張霽紅，康三江，胡生海，李玉梅，張芳

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，蘭州 730070；2.甘肅省果蔬貯藏加工技術(shù)創(chuàng)新中心，蘭州 730070)

梨是我國(guó)僅次于蘋果、柑橘的第三大水果，種植面積大、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)豐富，每100 g果肉含水分80.3 g、蛋白質(zhì)0.7 g、脂肪0.4 g、碳水化合物13.3 g、粗纖維4.4 g以及多種礦物質(zhì)元素和維生素[1-2]，可替代糧食加工果醋。果醋富含不揮發(fā)性有機(jī)酸、Vc等營(yíng)養(yǎng)成分，具有開(kāi)胃健脾、幫助消化、增強(qiáng)代謝和防治動(dòng)脈硬化、高血壓等保健功能，是目前很有發(fā)展前途的新型水果加工品[3-4]。我國(guó)梨品種豐富，不同梨品種加工特性及加工品質(zhì)差異較大[5-7]，不同梨品種、梨果實(shí)不同部位發(fā)酵梨醋菌種、條件、工藝、抗氧化性能研究及復(fù)合梨醋發(fā)酵研究均有報(bào)道[8-15]。梨醋傳統(tǒng)發(fā)酵工藝是在梨汁中添加蔗糖、檸檬酸進(jìn)行調(diào)糖和調(diào)酸，在適合的條件下添加菌種進(jìn)行發(fā)酵，而發(fā)酵體系中氮源及無(wú)機(jī)鹽方面的研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法[16-18]研究碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽對(duì)早酥梨醋發(fā)酵總酸的影響，旨在提高梨醋的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

早酥梨：購(gòu)于甘肅省景泰縣早酥梨產(chǎn)區(qū)；安琪果酒專用酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)：中國(guó)微生物菌種保存中心；蔗糖、檸檬酸、氯化銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、無(wú)水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉等(均為化學(xué)純)：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；酵母膏、瓊脂(生物試劑)：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；果膠酶(酶活30000～50000 U/g)：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；ZHJH-C1112B超凈工作臺(tái)、ZWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱；TGL-16MC冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司；日本愛(ài)拓PAL-1數(shù)顯糖度計(jì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

早酥梨清洗榨汁→酶解→殺菌→過(guò)濾→調(diào)整糖酸比→冷卻→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵→過(guò)濾澄清→滅菌→陳釀→產(chǎn)品。

1.3.2 主要操作步驟

1.3.2.1 酶解

早酥梨清洗榨汁后，加入0.03%酶活30000～50000 U/g的果膠酶，pH值4.0，溫度45 ℃，酶解2.5 h，75 ℃殺酶過(guò)濾。

1.3.2.2 酒精發(fā)酵

在糖酸比30～50的梨汁中加入總質(zhì)量8%已活化的安琪果酒酵母，25 ℃發(fā)酵5 d。

1.3.2.3 醋酸發(fā)酵

當(dāng)發(fā)酵液中糖度不再下降，酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)，接種梨汁總質(zhì)量10%三級(jí)培養(yǎng)活化后的巴氏醋桿菌，32 ℃ 醋酸發(fā)酵6 d，殺菌、陳釀后得到梨醋。

1.3.3 分批補(bǔ)充碳源實(shí)驗(yàn)研究

在酶解后的早酥梨汁中一次性補(bǔ)充總質(zhì)量6%的蔗糖，分別在發(fā)酵12，36 h時(shí)的發(fā)酵液中補(bǔ)充總質(zhì)量3%的蔗糖，分別在發(fā)酵12，24，36 h時(shí)的發(fā)酵液中補(bǔ)充總質(zhì)量2%的蔗糖，研究碳源對(duì)醋酸發(fā)酵中總酸含量的影響，每處理重復(fù)3次。

1.3.4 氮源濃度篩選

醋酸發(fā)酵初期在發(fā)酵液中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的氯化銨，研究氯化銨添加量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響，每處理重復(fù)3次。

1.3.5 無(wú)機(jī)鹽濃度篩選

醋酸發(fā)酵初期在發(fā)酵液中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的硫酸鎂，0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%的磷酸二氫鉀，研究無(wú)機(jī)鹽對(duì)醋酸發(fā)酵的影響，每處理重復(fù)3次。

1.3.6 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因子被設(shè)置為高、中、低3個(gè)水平(-1，0，1)，各因子變量選擇范圍見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 The factors and levels of response surface analysis

1.4 產(chǎn)品檢測(cè)

1.4.1 發(fā)酵液中可溶性固形物的測(cè)定

采用日本產(chǎn)PAL-1型折光儀測(cè)定可溶性固形物含量。

1.4.2 總酸含量的測(cè)定

采用氫氧化鈉酸堿滴定法測(cè)定總酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 分批補(bǔ)充碳源對(duì)醋酸發(fā)酵結(jié)果的影響

圖1 分批添加碳源對(duì)總酸含量的影響 Fig.1 Effect of adding carbon source in batches on total acid content

由圖1可知，在酶解后的早酥梨汁中分3次添加總量6%的蔗糖進(jìn)行果醋發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果顯示：與對(duì)照相比，添加蔗糖可提高碳源物質(zhì)含量，增加發(fā)酵液中的總酸含量。相同質(zhì)量的蔗糖分1，2，3次添加后發(fā)酵液中總酸含量有明顯差異，添加1次和添加2次差異不顯著，添加3次與其他兩次差異較顯著。這是因?yàn)楣装l(fā)酵過(guò)程中糖轉(zhuǎn)化為酒精，進(jìn)一步生成乙酸，當(dāng)糖濃度過(guò)高時(shí)，抑制酵母菌生長(zhǎng)，影響糖的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，如果適量添加可進(jìn)一步激活酵母生長(zhǎng)，提高轉(zhuǎn)化率。

2.2 不同氮源濃度對(duì)醋酸發(fā)酵結(jié)果的影響

在發(fā)酵液中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的氯化銨后發(fā)酵液中總酸含量見(jiàn)圖2。

圖2 氯化銨添加量對(duì)總酸含量的影響Fig.2 Effect of ammonium chloride additive amount on total acid content

氮源主要參與氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸等菌體細(xì)胞構(gòu)成及含氮物質(zhì)代謝，無(wú)機(jī)氮源氯化銨有利于微生物快速利用，在梨醋發(fā)酵體系中加入適量的氯化銨可提高醋酸總量。由圖2可知，當(dāng)氯化銨添加量在0.1%～0.3%范圍內(nèi)可促進(jìn)發(fā)酵體系中總酸量的積累，當(dāng)氯化銨添加量大于0.4%時(shí)有抑制總酸產(chǎn)量的趨勢(shì)。

2.3 不同無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)醋酸發(fā)酵結(jié)果的影響

酒精發(fā)酵結(jié)束后在發(fā)酵液中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的硫酸鎂后發(fā)酵液中總酸含量見(jiàn)圖3。

圖3 硫酸鎂添加量對(duì)總酸含量的影響Fig.3 Effect of magnesium sulfate additive amount on total acid content

酒精發(fā)酵結(jié)束后在發(fā)酵液中分別添加0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%的磷酸二氫鉀，研究微量元素鉀對(duì)醋酸發(fā)酵的影響(見(jiàn)圖4)，每處理重復(fù)3次。

圖4 磷酸二氫鉀添加量對(duì)總酸含量的影響

無(wú)機(jī)鹽作為輔酶或酶活性基團(tuán)的組成部分，是微生物維持生命活動(dòng)的必需物質(zhì)，K+能夠影響細(xì)胞的通透性，維持細(xì)胞的滲透壓，Mg2+是許多酶的催化劑，也是ATP的輔因子，能活化磷酸化酶和激酶參與發(fā)酵液中醋酸的合成。由圖3和圖4可知，當(dāng)發(fā)酵液中加入0.1%～0.3%的硫酸鎂、0.02%～0.06%的磷酸二氫鉀時(shí)可促進(jìn)發(fā)酵體系中總酸量的積累，當(dāng)硫酸鎂、磷酸二氫鉀添加量增大時(shí)有抑制總酸產(chǎn)量的趨勢(shì)。

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

利用Design-Expert 10軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析，相應(yīng)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，以總酸含量(g/L)為響應(yīng)值，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到總酸與各因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：總酸含量(g/L)=+59.25-1.31A+0.26B+0.97C+2.70AB+1.52AC-0.42BC-4.34A2-3.20B2-3.19C2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

由表3方差分析結(jié)果可知，模型的P<0.01，說(shuō)明該模型因子具有顯著性意義。失擬項(xiàng)的P>0.05，不顯著，回歸方程R2=0.9804，擬合度較好，表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以較好地反映各因素和總酸含量之間的關(guān)系。3個(gè)因素對(duì)梨醋總酸含量的影響大小依次為A氯化銨添加量(%)>C磷酸二氫鉀添加量(%)>B硫酸鎂添加量(%)。其中一次項(xiàng)A極顯著，C顯著，B不顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2極顯著，交互項(xiàng)AB、AC極顯著，BC不顯著，說(shuō)明各因素對(duì)總酸含量的影響不呈線性關(guān)系。

2.5 響應(yīng)面圖及等高線圖分析

根據(jù)回歸方程，利用Design Expert 10軟件繪制響應(yīng)曲面圖及等高線，見(jiàn)圖5～圖7。分析各因素及其相互作用對(duì)總酸含量的影響，確定最佳因素水平范圍。從圖中可直觀地看出各因子對(duì)響應(yīng)值的影響變化趨勢(shì)，而且回歸模型確實(shí)存在最大值。

圖5 氯化銨、硫酸鎂添加量對(duì)梨醋總酸含量影響的曲面圖與等高線 Fig.5 The response surface and contour of the effect of ammonium chloride and magnesium sulfate on the total acid content of pear vinegar

由圖5可知，總酸含量隨著氯化銨和硫酸鎂濃度的升高先增加后降低，當(dāng)氯化銨濃度接近0.3%時(shí)，總酸含量趨于平穩(wěn)，響應(yīng)面相對(duì)陡峭，當(dāng)A、B定量時(shí)，等高線呈橢圓形，表明A、B的交互作用顯著。

由圖6可知，總酸含量隨著氯化銨和磷酸二氫鉀濃度的升高先增加后降低，當(dāng)磷酸二氫鉀濃度大于0.05%～0.06%、氯化銨濃度大于0.25%～0.30%時(shí)，總酸含量下降，響應(yīng)面相對(duì)陡峭，當(dāng)A、C定量時(shí)，等高線呈橢圓，表明A、C的交互作用顯著。

圖7 硫酸鎂、磷酸二氫鉀添加量對(duì)梨醋總酸含量影響的曲面圖與等高線 Fig.7 The response surface and contour of the effect of magnesium sulfate and potassium dihydrogen phosphate on the total acid content of pear vinegar

由圖7可知，總酸含量隨著硫酸鎂和磷酸二氫鉀濃度的升高先增加后降低，增加幅度較大，降低較小，響應(yīng)面相對(duì)平緩，當(dāng)B、C定量時(shí)，等高線呈圓形，表明B、C的交互作用不顯著。

2.6 響應(yīng)面模型驗(yàn)證

利用設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行回歸模型預(yù)測(cè)，總酸含量取最大值時(shí)各因素的優(yōu)化水平為氯化銨添加量0.27%、硫酸鎂添加量0.23%、磷酸二氫鉀添加量0.05%，此時(shí)模型預(yù)測(cè)的總酸含量最大值為57.03 g/L。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在早酥梨酶解調(diào)糖調(diào)酸后，加入氯化銨0.27%、硫酸鎂0.23%、磷酸二氫鉀0.05%進(jìn)行梨醋發(fā)酵，重復(fù)3次，測(cè)定總酸含量為56.72 g/L，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明預(yù)測(cè)模型較好地反映了各因素與總酸之間的實(shí)際情況，優(yōu)選工藝合理可行。

3 結(jié)論

在早酥梨醋發(fā)酵工藝中分批添加蔗糖可提高碳源的轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)總酸含量的提高。 應(yīng)用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)氯化銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀添加量對(duì)總酸含量的關(guān)系進(jìn)行研究，通過(guò)Design Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到早酥梨醋優(yōu)化發(fā)酵條件為氯化銨添加量0.27%、硫酸鎂添加量0.23%、磷酸二氫鉀添加量0.05%，總酸含量為57.03 g/L，較傳統(tǒng)未添加果汁發(fā)酵總酸含量48.76 g/L提高了16.3%，表現(xiàn)出了良好的優(yōu)化效果。