王倩倩，邱泳明，遲雪梅，賈倩雯，任楠楠，遲乃玉，張慶芳*

(1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622)

草菇(Volvariellavolvacea(Bull.ex Fr.) Sing.)肉質(zhì)脆嫩，味道鮮美，維生素含量高，并富含多種氨基酸和礦物質(zhì)元素[1-2]；白菜(Brassicapekinensis(Lour.) Rupr.)又稱“百菜之王”，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，已發(fā)現(xiàn)白菜中含有預(yù)防腫瘤的成分[3]。發(fā)酵制品是利用益生菌發(fā)酵而成的一類特殊食品，以其獨(dú)特的風(fēng)味和多種保健功能而越來(lái)越受到消費(fèi)者歡迎。多種微生物在發(fā)酵制品的發(fā)酵過(guò)程中扮演著重要角色，其能將原料中的蛋白質(zhì)分解為氨基酸和多肽，將脂肪分解為短鏈的揮發(fā)性脂肪酸和酯類物質(zhì)[4-5]，微生物的代謝產(chǎn)物與原料分解產(chǎn)物共同形成了發(fā)酵制品特有的風(fēng)味和品質(zhì)特征。臨床研究證實(shí)發(fā)酵制品中特有的益生菌[6]對(duì)胃腸疾病和過(guò)敏性疾病有積極的作用；研究顯示益生菌還可用于治療肥胖癥、胰島素抵抗綜合征、Ⅱ型糖尿病和非酒精性脂肪肝等疾病。乳酸菌作為發(fā)酵制品中最為豐富的菌群[7]，不僅能改善食品的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)，還具有降低膽固醇、防止乳糖不耐受癥、止腹瀉、抗腫瘤、抗變異原、增強(qiáng)免疫力、清除自由基和延緩衰老等重要功能。

本研究采用白菜和草菇為基本原料，添加蜂蜜(或冰糖)及食鹽，進(jìn)行接種乳酸菌(或添加酸奶，或自然發(fā)酵)，見表1。在相同工藝條件下制作發(fā)酵制品，根據(jù)感官評(píng)價(jià)和相關(guān)的理化指標(biāo)，從12個(gè)發(fā)酵制品中，挑選出4種最佳發(fā)酵產(chǎn)品，序號(hào)為1號(hào)(BC4)、2號(hào)(BC1)、7號(hào)(XG12)、8號(hào)(XG10)，進(jìn)行16S rDNA高通量測(cè)序；分析微生物的多樣性及潛在功能，為發(fā)酵制品的安全與營(yíng)養(yǎng)提供了理論依據(jù)，用以評(píng)價(jià)蔬菜發(fā)酵制品的品質(zhì)；同時(shí)也為其更進(jìn)一步作為益生菌飲料[8]的生產(chǎn)和開發(fā)等提供了理論指導(dǎo)。

表1 蔬菜發(fā)酵制品配方Table 1 The formula of fermented vegetable products

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

遼寧省海洋微生物工程技術(shù)中心培育的新鮮草菇、市售新鮮白菜(大連91-12)、蜂蜜(購(gòu)于超市)、錦州雙八乳業(yè)有限公司生產(chǎn)的新鮮酸奶(含有Lactobacillusbulgaricus和Streptococcusthermophilus，按1∶1的比例)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵制品的制備

挑選草菇和鮮嫩、無(wú)枯葉、無(wú)病葉的白菜，用流水清洗，切碎成小塊(1 cm寬)；在90 ℃熱水中燙漂10 min；將處理好的100 g草菇、白菜在火焰旁分別裝入消毒后的廣口瓶中，加入10 g蜂蜜、0.5%的鹽，最后加入300 mL水；設(shè)置不同處理(即不添加，添加5%酸奶)；補(bǔ)水至瓶口；蓋上磨口的瓶蓋，用封口膜密封。將其放置在地下室柜中，避光，發(fā)酵溫度為17 ℃，發(fā)酵周期為30 d。4種發(fā)酵制品代號(hào)分別為BC1、BC4、XG10、XG12，配方見表2。

表2 草菇和白菜發(fā)酵制品配方

1.2.2 亞硝酸鹽殘留量的測(cè)定

采用鹽酸萘乙二胺法[9]。

1.2.3 pH值的測(cè)定

使用精密pH計(jì)直接讀數(shù)。

1.2.4 糖度的測(cè)定

使用糖度計(jì)直接讀數(shù)。

1.2.5 發(fā)酵制品基因組DNA的提取

發(fā)酵制品基因組DNA的提取方法參見文獻(xiàn)[10]，DNA樣品經(jīng)純化后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.6 發(fā)酵制品16S rDNA測(cè)序

細(xì)菌多樣性研究主要是基于16S rDNA(V3+V4)區(qū)。細(xì)菌V3+V4擴(kuò)增采用的引物：338F： 5′-ACTCCTA-CGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTW-TCTAAT-3′F，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)，對(duì)于建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用 Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2.7 生物信息分析流程

數(shù)據(jù)預(yù)處理：根據(jù)PE reads之間的Overlap關(guān)系，將HiSeq測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接(Merge)成一條序列Tags，同時(shí)對(duì)Reads的質(zhì)量和Merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾[11]。

信息分析內(nèi)容：使用QIIME(Version 1.8.0)軟件中的Uclust[12]Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得OTU，并基于Silva(細(xì)菌)分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋；使用Mothur(Version v.1.30)軟件[13]對(duì)樣品Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估；利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R語(yǔ)言工具繪制成樣品各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖；使用PICRUSt軟件通過(guò)比對(duì)16S rDNA測(cè)序數(shù)據(jù)獲得物種組成信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

通過(guò)高通量測(cè)序平臺(tái)，得到Raw Tags，按測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量[14]要求處理后，對(duì)序列進(jìn)行組裝拼接，得到Clean Tags序列，各樣品測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 3 The statistics of sample sequencing results

2.2 基于OTU的Venn圖分析

在97%的相似度水平下，聚類成可操作分類單元(OTU)，通過(guò)聚類BC1、BC4、XG10和XG12樣品各得到52，12，16，21個(gè)OTU。利用Venn圖[15]可以展示樣品之間共有、特有OTU數(shù)目，直觀地表現(xiàn)出樣品間OTU的重合情況。結(jié)合OTU所代表的物種，可以找出不同環(huán)境中的共有菌群。

圖1 OTU-Venn圖

由圖1可知，OUT數(shù)在4個(gè)制品之間共有10個(gè)，樣品BC1和BC4之間共有12個(gè)，樣品BC1和XG10之間共有13個(gè)，樣品BC4和XG12之間共有10個(gè)，樣品XG10和XG12之間共有14個(gè)；樣品BC1特有34個(gè)，樣品BC4特有0個(gè)，樣品XG10特有2個(gè)，樣品XG12特有4個(gè)。

2.3 Alpha多樣性分析

為比較樣品間的多樣性指數(shù)，分析時(shí)將樣品所含序列數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在97%相似度水平下，各樣品Alpha多樣性指數(shù)值統(tǒng)計(jì)見表4。Chao1和Ace值越大，說(shuō)明樣品的物種豐度越大。Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說(shuō)明樣品的物種多樣性越高。

表4 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

由表4可知，ACE指數(shù)BC1>XG12>BC4>XG10，Chao1指數(shù)BC1>XG12>XG10>BC4，因此可知，添加酸奶的白菜發(fā)酵制品的物種豐度極顯著大于其他3種發(fā)酵制品的物種豐度，在草菇制品中，自然發(fā)酵制品的物種豐度大于添加酸奶制品的物種豐度；Shannon指數(shù)XG10>XG12>BC1>BC4，Simpson指數(shù)XG10

2.4 物種組成與結(jié)構(gòu)分析

將OTU的代表序列與細(xì)菌參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)可得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，進(jìn)而在各水平(門、綱、目、科、屬、種)統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成。

2.4.1 屬等級(jí)分類

表5樣品中主要微生物屬組成

在屬等級(jí)上，BC1注釋得到36個(gè)屬，BC4注釋得到9個(gè)屬，XG10注釋得到12個(gè)屬，XG12注釋得到16個(gè)屬。由表5可知，4種樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬均為L(zhǎng)actobacillus，所占比例分別為88.97%、90.65%、67.63%、69.46%，Leuconostoc在XG10和XG12中比例分別為29.51%和30.10%，兩種菌屬在4種樣品中的累計(jì)相對(duì)含量分別為90.24%、94.69%、97.15%、99.56%，均高于90%。

2.4.2 種等級(jí)分類

在種等級(jí)上，BC1注釋得到27個(gè)種，BC4注釋得到5個(gè)種，XG10注釋得到6個(gè)種，XG12注釋得到9個(gè)種。

表6 樣品中主要微生物種組成Table 6 The composition of main microbial species in the samples %

由表6可知，4種樣品中優(yōu)勢(shì)菌種均為L(zhǎng)actobacillusplantarum，所占比例分別為88.84%、90.65%、67.63%和69.46%，Leuconostocpseudomesenteroides在4種樣品中所占比例分別為1.27%、4.04%、29.51%和30.10%，unculturedBacteriumgStreptococcus在4種樣品中所占比例分別為1.63%、0%、1.91%和0.02%，其余種比例在BC1、BC4、XG10和XG12中均低于0.50%。

2.5 16S功能基因預(yù)測(cè)分析

使用PICRUSt比對(duì)16S測(cè)序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測(cè)樣本中的功能基因組成，從而分析不同樣本或分組之間在功能上的差異[16]。

2.5.1 COG功能預(yù)測(cè)

同等原料的2個(gè)發(fā)酵制品COG功能預(yù)測(cè)比較結(jié)果見圖2和圖3。

由圖2和圖3可知，影響發(fā)酵制品營(yíng)養(yǎng)的功能代謝途徑有多項(xiàng)顯示，如碳水化合物代謝組、氨基酸代謝組、能量代謝組、輔助因子和維生素代謝組及運(yùn)輸和分解代謝組等。由圖2可知，BC1與BC4之間，在菌群群落的功能分布及所占豐度上存在顯著性差異和變化，各功能項(xiàng)上BC1顯著性大于BC4的為16項(xiàng)，BC4顯著性大于BC1的為5項(xiàng)；由圖3可知，XG10與XG12之間，在菌群群落的功能分布及所占豐度上也存在差異和變化，各功能項(xiàng)上XG10顯著性大于XG12的為8項(xiàng)，XG12顯著性大于XG10的為2項(xiàng)，說(shuō)明添加酸奶對(duì)發(fā)酵制品的COG功能影響較大。

圖2 樣品BC1、BC4的COG功能分類統(tǒng)計(jì)圖Fig.2 COG function classification statistics of BC1 and BC4 samples

圖3 樣品XG10、XG12的COG功能分類統(tǒng)計(jì)圖Fig.3 COG function classification statistics of XG10 and XG12 samples

2.5.2 KEGG功能預(yù)測(cè)

同等原料的2個(gè)發(fā)酵制品KEGG功能預(yù)測(cè)比較結(jié)果見圖4和圖5。

圖4 樣品BC1、BC4間KEGG代謝途徑的差異分析圖Fig.4 Differential analysis of KEGG metabolic pathway between BC1 and BC4 samples

圖5 樣品XG10、XG12間KEGG代謝途徑的差異分析圖Fig.5 Differential analysis of KEGG metabolic pathways between XG10 and XG12 samples

由圖4和圖5可知，除了碳水化合物的運(yùn)輸與代謝與氨基酸代謝等在樣品中的表達(dá)較強(qiáng)之外，傳染病、癌癥等影響樣品安全的功能代謝途徑非常少而且表達(dá)水平低。由圖4可知，BC1與BC4之間，在菌群群落的功能分布及所占豐度上存在顯著性差異和變化，各功能項(xiàng)上BC1顯著性大于BC4的為21項(xiàng)，BC4顯著性大于BC1的為7項(xiàng)；由圖5可知，XG10與XG12之間，在菌群群落的功能分布及所占豐度上也存在差異和變化，各功能項(xiàng)上XG10顯著性大于XG12的為8項(xiàng)，XG12顯著性大于XG10的為3項(xiàng)，說(shuō)明添加酸奶對(duì)發(fā)酵制品的KEGG功能影響較大。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)草菇和白菜發(fā)酵制品中主要菌群都為益生菌中的乳酸菌。草菇發(fā)酵制品中，無(wú)論是添加酸奶還是自然發(fā)酵，其優(yōu)勢(shì)菌都是Lactobacillusplantarum(添加酸奶發(fā)酵：67.63%、自然發(fā)酵：69.46%)和Leuconostocpseudomesenteroides(添加酸奶發(fā)酵：29.51%、自然發(fā)酵：30.10%)。白菜發(fā)酵制品中，無(wú)論是添加酸奶還是自然發(fā)酵，其優(yōu)勢(shì)菌都是Lactobacillusplantarum(添加酸奶發(fā)酵：88.97%、自然發(fā)酵：90.65%)，也有Leuconostocpseudomesenteroides，但比例較少(添加酸奶發(fā)酵：1.27%、自然發(fā)酵：4.04%)。因此發(fā)現(xiàn)白菜發(fā)酵制品中Lactobacillusplantarum所占比例遠(yuǎn)高于草菇發(fā)酵制品，草菇發(fā)酵制品中Leuconostocpseudomesenteroides所占比例遠(yuǎn)高于白菜發(fā)酵制品。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacillusplantarum具有降解亞硝酸鹽功能，能夠降低亞硝胺的致癌性；臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)Lactobacillusplantarum對(duì)Ⅱ型糖尿病治療起輔助作用，可以使葡萄糖和同型半胱氨酸水平顯著降低；可以降低人體身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)和動(dòng)脈血壓值；可以改善乳糖消化和耐受性，對(duì)腹瀉和胃腸脹氣有明顯的改善作用，還可以改善腸黏膜屏障的完整性并減少感染并發(fā)癥等[17]；在蔬菜發(fā)酵制品中Lactobacillusplantarum可以從蔬菜的膳食纖維中制造短鏈脂肪酸，可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，可能有助于預(yù)防結(jié)腸癌[18]。Leuconostocpseudomesenteroides是得到美國(guó)FDA認(rèn)可的GRAS菌[19]，又稱風(fēng)味菌、香氣菌和產(chǎn)香菌，具有改善人體腸道環(huán)境，抑制某些病原菌等功能[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究的草菇和白菜發(fā)酵制品都適合作為益生菌飲料產(chǎn)品。

本研究發(fā)酵制品基于高通量測(cè)序得到注釋的細(xì)菌屬、種主要為益生菌中的乳酸菌，占比達(dá)90%。除此以外，有可能影響產(chǎn)品安全的細(xì)菌占比極低或不能培養(yǎng)(見表5和表6)，對(duì)產(chǎn)品不構(gòu)成影響。因此，從主要微生物屬、種組成方面也說(shuō)明了本研究的發(fā)酵制品具有安全性，再者本研究發(fā)酵制品的KEGG功能預(yù)測(cè)得到的結(jié)果(見圖4和圖5)也顯示，影響發(fā)酵制品安全的功能代謝途徑顯示的非常少而且水平低。

白菜是屬于含有大量硝酸鹽的蔬菜[21]。在白菜發(fā)酵過(guò)程中，因發(fā)酵初期會(huì)有產(chǎn)硝酸鹽還原酶的菌存在，從而將硝酸鹽大量地還原成亞硝酸鹽，NO2-能與蛋白質(zhì)代謝物反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物亞硝胺。本實(shí)驗(yàn)室及其他學(xué)者[22]研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillusplantarum具有亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase，NiR)基因，能在NO2-的誘導(dǎo)下產(chǎn)生NiR；Lactobacillusplantarum降解NO2-的途徑為產(chǎn)NH3途徑，最終產(chǎn)物為NH3。環(huán)境pH值>4.5時(shí)，主要是在NiR作用下分解亞硝酸鹽。Lactobacillusplantarum屬于同型乳酸發(fā)酵，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，能快速使環(huán)境pH值<4.0，從而迅速進(jìn)入NO2-被H+降解階段[23]。草菇是屬于含極少量硝酸鹽的蕈菌[24]，其發(fā)酵制品中亞硝酸鹽含量也少。可能也是本研究的發(fā)酵制品中亞硝酸鹽含量都低的原因(國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)<20 mg/kg)，見表7。

表7 草菇和白菜發(fā)酵制品中NO2-殘留量Table 7 NO2- residues in fermented products of Volvariella volvacea and cabbage mg/kg

通過(guò)分析OTU聚類數(shù)、豐度指數(shù)、物種注釋數(shù)，其中BC1數(shù)值均高于其他樣品，但發(fā)酵制品中優(yōu)勢(shì)菌群仍主要為乳酸菌。分析原因：白菜中含有大量的硝酸鹽作為氮源，添加蜂蜜提高了碳源的量，致使發(fā)酵環(huán)境中存在大量的氮源和碳源及合適的碳氮比，添加的酸奶中富含半乳糖和乳酸、小的肽鏈和氨基酸、脂肪酸等大量營(yíng)養(yǎng)因子和乳酸菌等；富集的營(yíng)養(yǎng)條件使發(fā)酵前期各種細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛；導(dǎo)致白菜發(fā)酵前期大量硝酸鹽降解產(chǎn)生亞硝酸鹽。亞硝酸鹽可作為防腐劑[25]，又抑制了大量其他菌的生長(zhǎng)；乳酸菌本身產(chǎn)生的酸及乳酸菌素又能抑制發(fā)酵中的雜菌[26]；研究還認(rèn)為L(zhǎng)actobacillusplantarum耐受亞硝酸鹽的能力較強(qiáng)，耐酸能力較強(qiáng)[27]。因此，在發(fā)酵制品中檢測(cè)到優(yōu)勢(shì)乳酸菌為L(zhǎng)actobacillusplantarum。在BC1中檢測(cè)到亞硝化菌，亞硝化菌能使NH3生成NO2-，在H+的作用下NO2-生成NO和NO3-[28]；研究[29]中常見蔬菜發(fā)酵后期，汁液中NO3-和NO2-含量出現(xiàn)低頻率的反復(fù)波動(dòng)現(xiàn)象，推測(cè)可能與存在氮代謝有關(guān)的菌相關(guān)。在添加酸奶的發(fā)酵制品中還檢測(cè)到了Streptococcus(白菜：1.63%、草菇：1.91%)，可能與添加的新鮮酸奶中含有Streptococcusthermophilus有關(guān)。

在COG功能預(yù)測(cè)中，BC1和BC4比較顯著性差異為21項(xiàng)，XG10和XG12比較顯著性差異為10項(xiàng)。在KEGG功能預(yù)測(cè)中，BC1和BC4比較顯著性差異為28項(xiàng)，XG10和XG12比較顯著性差異為11項(xiàng)。因此，以草菇為原料的2個(gè)制品有顯著性差異的功能項(xiàng)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于以白菜為原料的2個(gè)制品有顯著性差異的功能項(xiàng)數(shù)量。就功能預(yù)測(cè)指標(biāo)分析及工藝成本考慮，以白菜為原料的制品，可首選BC1(添加酸奶)；以草菇為原料的制品，可首選XG12(自然發(fā)酵)。

對(duì)本研究中的草菇和白菜發(fā)酵制品，測(cè)定pH、糖度和總酸等理化指標(biāo)(pH在3.1～3.4之間，糖度在8%～10%之間，總酸在0.29%～0.35%之間)，顯示符合人們正?？诟行枰猍30]，見表8。

表8 樣品主要理化組成Table 8 The main physical and chemical components of samples

4 展望

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)制備的草菇和白菜發(fā)酵制品進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析及功能預(yù)測(cè)，在4個(gè)發(fā)酵制品中檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)菌主要是對(duì)人體有臨床療效的Lactobacillusplantarum，功能預(yù)測(cè)分析發(fā)酵制品都具有安全性和營(yíng)養(yǎng)性，發(fā)酵制品中亞硝酸鹽殘留量低于安全標(biāo)準(zhǔn)，糖酸比符合大眾口味。綜上，可以認(rèn)為這4個(gè)發(fā)酵制品適合作為益生菌飲料進(jìn)行產(chǎn)品化。