趙文聞，徐黎明，陳桂花，段凱越，趙景壯，任廣明，邵軼智，張穎，盧彤巖

（1.大連海洋大學，遼寧 大連 116023；2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江省水生動物病害與免疫重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；3.中國水產科學研究院珠江水產研究所，廣東 廣州 510380）

傳染性胰腺壞死病（Infectious pancreatic necrosis，IPN）是鮭鱒魚類最為嚴重的傳染性疾病之一。該病病原傳染性胰臟壞死病毒（Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）隸屬于雙RNA 病毒科Birnaviridae、水生雙RNA 病毒屬Aquabirnavirus[1]。IPNV 為二十面體對稱，無囊膜，直徑為50～75 nm，核酸為雙鏈RNA[2,3]，主要危害虹鱒Onchorhynchus mykiss、美洲紅點鮭Salvelinus fontinalis、褐鱒Salmo trutta、大西洋鮭Salmo salar 和大麻哈屬Oncorhynchus spp.的魚苗及幼魚[4]。不同毒株、宿主和環(huán)境因素,IPNV可造成宿主10%～90%的死亡率[5,6]。IPNV 在美國[7]、法國[8]、土耳其[9]、智利[10]、墨西哥[11]、芬蘭[12]、挪威[13]、西班牙[14]、日本[15]、韓國[16]以及伊朗[17]等國家均有檢出。IPNV 最早于20 世紀80 年代在我國甘肅[18]、山西[19]以及山東[20]等地被檢出，近些年又從四川省[21]以及云南省[22]分離到IPNV 毒株。本實驗室于2013—2020 年在我國鮭鱒主養(yǎng)區(qū)進行IPNV流行病學監(jiān)測過程中分離到了大量的IPNV 毒株[23]。目前尚無有效防治IPN 的藥物，進行IPNV檢測，阻止病毒的流通擴散，對減少我國虹鱒養(yǎng)殖業(yè)的經濟損失具有重要的意義。

目前用于IPNV 檢測的方法有聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）、實時熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附測定法、免疫熒光法、基因探針法[24-26]、基因芯片法[27]原位雜交法[28]以及環(huán)介導等溫擴增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[29,30]等多種方法，其中PCR 是最常用的實驗室檢測方法。該方法需擴增提取病毒的核酸，但擴增效果受病毒含量的影響，通常會先利用敏感細胞對病毒進行擴增，然后再檢測出現(xiàn)細胞病變的細胞培養(yǎng)物的病毒。江育林等[19]研究結果表明：目前可用于IPNV 體外培養(yǎng)的細胞系有鯉上皮瘤細胞（Epit helioma papulosum cyprini，EPC）、大鱗大麻哈魚胚胎細胞（Chinook salmon embryo，CHSE-214）、虹鱒性腺細胞（Rainbow trout gonad，RTG-2）、虹鱒肝細胞（Liver cells of rainbow trout，R1）、狗魚性腺細胞（Gonad cells of pike，PG）等魚類細胞系。劉淼等[31]研究發(fā)現(xiàn)，IPNV ChRtm213 分離株可在CHSE-214 和RTG-2 細胞上增殖，并產生典型細胞病變，但CHSE-214 比RTG-2 細胞具有更好的敏感性?，F(xiàn)有研究表明，CHSE-214 細胞和RTG-2 細胞是IPNV 體外培養(yǎng)最常用細胞系。為篩選出IPNV 體外培養(yǎng)最佳敏感細胞系，本研究將實驗室保存的24 株IPNV 分離株分別接種于CHSE-214 和RTG-2 細胞，通過細胞病變情況比較這兩種細胞對IPNV 的敏感性，確定IPNV 敏感細胞并分析IPNV 毒株在敏感細胞上的增殖特性，以期為IPNV 的檢測提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中所用的全部IPNV 分離株由本實驗室分離保存[23]。CHSE-214 細胞和RTG-2 細胞由中國水產科學研究院長江水產研究所魚類病害教研室曾令兵研究員惠贈。胎牛血清、胰蛋白酶、MEM 培養(yǎng)基（Minimum essential medium）購自Gibco 公司，青霉素-鏈霉素購自ThermoFish 公司；TRIzol Reagent 購自Invitrogen 公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與傳代

從液氮罐里取出CHSE-214 和RTG-2 細胞，將其置于30℃水浴鍋融化，在無菌條件下將其移入15 mL 離心管中，1 000 g/min 離心2 min，棄去凍存液，加入1 mL 細胞培養(yǎng)液（MEM 培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗）吹勻，之后將細胞移入T-25 細胞培養(yǎng)瓶中，補加4 mL 細胞培養(yǎng)液，置于18℃二氧化碳生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長成均勻的單層細胞，用胰蛋白酶消化并用細胞培養(yǎng)液吹打混勻，放入新T-25細胞培養(yǎng)瓶中進行1∶2 傳代培養(yǎng)。

1.3 細胞敏感性分析

將24 株IPNV 分離株以1 000 TCID50的劑量分別接種于單層RTG-2 和CHSE-214 細胞上，連續(xù)觀察7 d。每天觀察細胞變化，記錄在RTG-2 和CHSE-214 細胞上病變的IPNV 毒株數(shù)量，以確定IPNV 最敏感細胞系，用以開展IPNV 在最佳敏感細胞上的增殖特性研究。

1.4 IPNV 在CHSE-214 細胞上增殖的實驗設計

將IPNV 毒株ChRtm213 分別以10 TCID50和100 TCID50的劑量接種于六孔板上的CHSE-214 單層細胞中，每天在顯微鏡下觀察并記錄細胞病變情況，并在接種后第1、2、3、4、5 d 收獲細胞培養(yǎng)物。每3 個孔為一個平行樣，凍存于-80℃冰箱備用。

1.5 IPNV 在CHSE-214 細胞上增殖的分析

每個平行孔取200 μL 病毒液于一個EP 管中，混勻后取出200 μL 病毒液于無RNA 酶的離心管中，用Trizol 法提取病毒RNA[32]。分別以IPNV A 鏈和IPNV B 鏈為靶標基因，β-actin 為內參基因，對各組樣品中IPNV 載量的變化情況進行RT-qPCR分析。反應體系（20 μL）包括：10 μL 2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4、1.2 μL TaKaRa Ex Taq HS Mix、0.4 μL PrimeScript PLUS RTase Mix、2 μL RNA 模板、各0.8 μL 的上下游引物以及4.8 μL 的RNase Free dH2O。反應程序為：42℃5 min，95℃10 min，95℃5 s；60℃34 s（40 個循環(huán)）；95℃15 s，60℃1 min；95℃30 s，60℃15 s。以10 TCID50接種后1 d 收獲的細胞樣本作為陰性對照，采用2-ΔΔCT方法計算基因相對表達量[33]。β-actin 上游引物βactin F：GCCGGCCGC GACCTCACAGACTAC，下游引物β-actin R：CGGCCGTGGTGGTGA AGCTGTAAC；A 基因上游引物AF：GCATTCAACTACGGGAGAC，下游引物AR：CATCAGGCTGTTGTAGGTTAG；B 基因上游引物BF：CCGCAGCAC AGTTCCTAA，下游引物BR：GCTTGCCATCGTCTACCA。引物由吉林省庫美生物合成。

1.6 IPNV 在CHSE-214 細胞上的生長曲線繪制

在1.5 mL 無菌離心管中，用細胞維持液（MEM培養(yǎng)基+2%胎牛血清+1%雙抗）將1.4 中收獲的IPNV 病毒液分別進行10 倍系列稀釋（10-1～10-8）。將稀釋好的病毒懸液分別接種于96 孔微量細胞培養(yǎng)板上單層CHSE-214 細胞，每孔接種病毒懸液100 μL，每個濃度接種8 個孔，將只加細胞維持液的孔設成陰性對照孔，置于15℃二氧化碳生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，記錄出現(xiàn)及未出現(xiàn)CPE 的孔數(shù)，利用Reed-Muench 法計算IPNV 的TCID50[34]。

2 結果與分析

2.1 敏感性分析

將24 株IPNV 分離株1 000 TCID50劑量接種于CHSE-214 細胞和RTG-2 細胞，觀察細胞病變產生、變化情況及導致細胞病變的毒株數(shù)量。顯微鏡觀察結果顯示，接毒后1 d 時，CHSE-214 細胞和RTG-2 細胞均未出現(xiàn)任何變化；接毒后2 d 時，各CHSE-214 細胞組均出現(xiàn)變薄、變圓、崩解脫落等明顯的典型細胞病變，個別RTG-2 細胞組出現(xiàn)了明顯的細胞病變；接毒后3 d 時，CHSE-214 細胞出現(xiàn)大面積脫落，RTG-2 細胞病變部位擴大，出現(xiàn)了崩解脫落的現(xiàn)象（圖1）。接毒后7 d，CHSE-214 細胞產生了典型的細胞病變并幾乎完全崩解脫落，8 組RTG-2 細胞產生了典型的細胞病變及崩解脫落。這表明所有的IPNV 分離株均能在CHSE-214 上增殖，而僅有8 株IPNV 分離株可以在RTG-2 細胞上增殖，說明CHSE-214 細胞IPNV 敏感性更好，更適用于IPNV 的分離培養(yǎng)，推薦CHSE-214 細胞用于IPNV 的體外分離培養(yǎng)。

圖1 IPNV 在RTG-2 細胞和CHSE-214 細胞上產生的細胞病變Fig.1 Cytopathic effect of IPNV on RTG-2 and CHSE-214 cells

2.2 IPNV 不同接毒劑量下CHSE-214 細胞的病變

分別以10 TCID50和100 TCID50接毒劑量將IPNV 分離株ChRtm213 接種于CHSE-214 細胞，觀察細胞病變產生及變化情況以及出現(xiàn)細胞病變的時間。結果顯示，在接毒后1 d，以兩種劑量接種IPNV 分離株的CHSE-214 細胞均未出現(xiàn)任何變化；接毒后2 d，兩個劑量組的CHSE-214 細胞均出現(xiàn)了細胞變圓、變薄、部分消融的典型細胞病變（圖2），其中，以100 TCID50劑量接種IPNV 的CHSE-214細胞病變更為明顯；接毒3 d，以10 TCID50接種的細胞全部出現(xiàn)典型細胞病變，開始出現(xiàn)部分崩解，以100 TCID50劑量接種的細胞也同樣開始出現(xiàn)崩解，但尚未嚴重脫落；接毒后4～5 d，所有劑量組細胞均幾乎全部崩解，嚴重脫落，僅能觀察到極少量的完整細胞結構（圖2）。

圖2 接種不同劑量IPNV 后CHSE-214 細胞產生的細胞病變Fig.2 Cytopathic effect of CHSE-214 cells inoculated with IPNV at different doses

2.3 IPNV 在CHSE-214 細胞上增殖的RTqPCR 分析

將IPNV 毒株分別以10 TCID50和100 TCID50接種于6 孔細胞培養(yǎng)板上單層的CHSE-214 細胞，接毒后5 d 內每天收獲病毒培養(yǎng)物，提取RNA，分別以IPNV A 鏈和IPNV B 鏈為靶標基因，β-actin為內參基因，利用RT-qPCR 方法檢測接毒后不同時間病毒在細胞中載量的變化，以10 TCID50劑量接種IPNV 病毒1 d 后收獲的病毒培養(yǎng)物提取的RNA 作為陰性對照。結果顯示，隨著時間的增加兩種劑量組的IPNV 載量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在接毒后3 d 時達最大值，顯著高于其余各時間點，不同靶基因檢測結果相一致（P＜0.05，圖3）。接種后3 d 時，10 TCID50劑量組的IPNV 病毒載量顯著高于100 TCID50劑量組（P＜0.05）（圖3）。上述結果表明，利用CHSE-214 細胞對IPNV 進行增殖時病毒載量先升高再下降。

圖3 以不同劑量接種于CHSE-214 細胞的IPNV 載量變化Fig.3 Variation in viral load in CHSE-214 cells inoculated with different doses of IPNV

2.4 IPNV 生長曲線的繪制

將IPNV 毒株以10 TCID50、100 TCID50兩種不同劑量接種于單層CHSE-214 細胞，接種后5 d 內，每天收獲病毒液，進行TCID50測定，繪制生長曲線。兩個劑量組的IPNV 滴度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在接毒后3 d 時達最大值：接種后第1～3 d 呈對數(shù)增長，第4～5 d 緩慢下降（圖4）。當接種劑量為10 TCID50時，接毒后第3 d 時IPNV 滴度高達106.57TCID50/0.1 mL，而在接毒后第5 d 時IPNV 滴度降低至103.88TCID50/0.1 mL；除接種后1 d 外，10 TCID50劑量組IPNV 滴度在各時間點均顯著高于100 TCID50劑量組。接毒后第3 d 和5 d 時，100 TCID50劑量組IPNV 滴度分別為105.62TCID50/0.1 mL和103.43TCID50/0.1 mL，顯著低于10 TCID50劑量組（P＜0.05）。

圖4 IPNV 在CHSE-214 細胞上的滴度變化Fig.4 Changes in IPNV titers in CHSE-214 cells

3 討論

3.1 IPNV 毒株的選擇

水生雙RNA 病毒共包括7 個基因型（基因組I-基因組VII 型）[35]，包括Blake 等[8]基于VP2 序列建立的6 個基因型（基因組I 型-VI 型）和Nishizawa 等[24]基于VP2/NS 基因建立的1 個基因型。每種基因型的IPNV 毒株的地理分布不同，基因組I 型IPNV 毒株主要分布于美國[7]、智利[10]、墨西哥[11]、西班牙[14]、日本[15]和中國[18-20]，基因組II 型、III 型和IV 型IPNV 毒株主要分布于加拿大[31]、西班牙[14]和加拿大，基因組V 型IPNV 毒株分布于土耳其[9]、芬蘭[12]、挪威[13]、伊朗[17]和意大利[36]，基因組VI 型IPNV 毒株分布于德國以及芬蘭。根據(jù)GenBank 公布的中國IPNV 毒株VP2 基因序列，對本實驗室于2013—2020 年分離獲得的二十余株IPNV 毒株，Duan 等[23]進行了基因型分析。結果顯示：我國IPNV基因型為I 型和V 型，I 型分布更廣。因此在本研究中選擇了I 型IPNV 來分析CHSE-214 和RTG-2的敏感性，將實驗室保存的我國不同養(yǎng)殖區(qū)域的全部I 型IPNV 作為實驗表株，以期為我國IPNV 病毒的檢測提供指導。

3.2 細胞敏感性分析

IPNV 可從許多感染的魚類中分離出，并在許多魚類細胞系中增殖。不同的細胞對IPNV 敏感性不同。IPNV 可在許多細胞系中增殖感染并產生典型的細胞病變狀態(tài)：CHSE-214、RTG-2、EPC、淡水鯉科魚類細胞系（fathead minnow muscle cell line，F(xiàn)HM）、銅吻鱗鰓太陽魚細胞系（Bluegill fry，BF-2）、虹鱒肝細胞系（Liver cells of rainbow trout，R1）、虹鱒魚細胞系（steelhead trout embryo-137，STE-137）、紅鮭胚胎細胞系（sockeye salmon embryo-5，SSE-5）、虹鱒肝臟瘤細胞系（rainbow trout hepatoma-149，RTH-149）、虹鱒脾臟細胞系（Rainbow trout spleen，RBS）、虹鱒魚苗細胞系（rainbow trout fry-1，RTF-1）以及大西洋鮭細胞系（Atlantic salmon，AS）等[37]。其中CHSE-214 細胞、RTG-2 細胞以及EPC 細胞均可用于IPNV 的檢測[19]，但劉淼等[31]發(fā)現(xiàn)，IPNV ChRtm213 分離株在EPC 細胞上的滴度最低，產生細胞病變最慢，而CHSE-214 和RTG-2 細胞比EPC 細胞的敏感性更好。IPNV 檢測的國家標準《GB 15805.1-2008-T 魚類檢疫方法 第1 部分：傳染性胰臟壞死病毒（IPNV）》推薦使用RTG-2、CHSE-214 或者PG 細胞分離IPNV。我國大多數(shù)實驗室更傾向于利用鮭鱒魚來源的CHSE-214 和RTG-2 分離IPNV。本研究中選用了CHSE-214 和RTG-2 細胞分析IPNV 敏感性，以此來篩選出更適合IPNV 分離鑒定的細胞系。將IPNV 分離株全部以較大劑量接種于CHSE-214 和RTG-2 細胞，結果發(fā)現(xiàn)所有的IPNV 分離株均能在CHSE-214 細胞上增殖并產生典型細胞病變，而僅有三分之一的IPNV 分離株能在RTG-2 細胞上增殖并產生細胞病變，證明CHSE-214 細胞比RTG-2 細胞對IPNV 敏感。Lorenzen 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，不同實驗室的同一細胞系對同一病毒的敏感性存在一定的差異，但是該差異性并不會影響細胞對病毒敏感性的判斷。本研究證明CHSE-214 細胞更適合用于IPNV 的體外分離培養(yǎng)。

3.3 IPNV 在CHSE-214 細胞上的增殖特性

病毒體外增殖的主要決定因素包括細胞系、接種劑量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度等。江育林等[19]將IPNV 毒株分別接種于鯽（Carassius auratus auratus）的囊胚細胞（Blaetoderm ofCarassius auraius，CAR）、鯉（Cyprinus carpio）的白細胞（Leucocytes of common carp，GLC）和草魚（Ctenopharyngodon idella）卵巢細胞（Overy cells of grass carp，CO），于20℃培養(yǎng)7 d，細胞未出現(xiàn)任何病變；而在CHSE-214、RTG-2、PG和R1 細胞上，3 d 內皆出現(xiàn)CPE，7 d 內CPE 達到90%以上，7 d 時測得滴度分別為105.8TCID50/0.1 mL、105.5TCID50/0.1 mL、106.5TCID50/0.1 mL 和106.2TCID50/0.1 mL。劉淼等[31]發(fā)現(xiàn)，將IPNV ChRtm213 毒株分別接種于CHSE-214、RTG-2、EPC 細胞上，在接毒后48 h時，CHSE-214 細胞出現(xiàn)皺縮變圓、崩解脫落等明顯的細胞病變，RTG-2 細胞只出現(xiàn)少數(shù)的病變灶，在接毒后72 h，CHSE-214 細胞大面積崩解脫落，RTG-2 細胞病變部位擴大，部分細胞崩解脫落，而EPC 細胞生長正常。20℃下培育7 d 時ChRtm 213 在CHSE-214、RTG-2 和EPC 細胞上病毒滴度分別為105.2TCID50/0.1 mL、103.2TCID50/0.1 mL、102.3TCID50/0.1 mL。謝文萍等[38]將IPNV 接種于FHM 細胞上，18 h細胞病變，出現(xiàn)空洞，15℃培育7 d 所測得的病毒滴度分別為103.064TCID50/0.1 mL。上述各研究所采用的培養(yǎng)溫度均在15～20℃的最適范圍[19]，但所用毒株各不相同，接種劑量也不相同，因此無法精確衡量各培養(yǎng)條件對病毒滴度的影響。將IPNV 接種于CHSE-214 細胞上，第7 d 時收獲病毒，但本研究發(fā)現(xiàn)在CHSE-214 細胞上，IPNV 表現(xiàn)出獨特的增殖特性：接毒后第3 d 時IPNV 滴度高達106.57TCID50/0.1 mL，而第5 d 時IPNV 滴度降低至103.43TCID50/0.1 mL。由此可見，病毒載量和病毒滴度隨著接種時間的增加，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這與段凱越等[39]研究結果相一致；且在接毒后3～5 d 時，低劑量組收獲的IPNV 的病毒量顯著高于高劑量組。由此可見，將IPNV 接種于單層CHSE-214 細胞后，病毒培養(yǎng)時間并非越長越好，接毒劑量也并非越大越好，應在大部分細胞出現(xiàn)細胞病變，但尚未完全崩解脫落時收獲病毒進行檢測，不但可縮短檢測時間而且會提高檢出效率。IPNV 在CHSE-214 細胞中的增殖特性在先前的研究中并未被報道過。掌握該增殖特性，有利于IPNV 的檢測和在滅活疫苗的制備時降低接毒劑量，縮短培養(yǎng)時間降低成本，提高病毒產量。利用CHSE-214 培養(yǎng)IPNV，培養(yǎng)溫度18℃，病毒接種量為10 TCID50，培養(yǎng)時間3 d 時最為合適。