姚鳳琴,林發(fā)壯*,鐘琳珊,陳昌銘,陳瑋婷,林輝鋒,周惠英
[1.三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 福建 三明 365509; 2.福建省(山區(qū))作物遺傳改良與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 三明 365509; 3.古田縣林業(yè)局, 福建 寧德 352200)]
紅掌Anthuriumandraeanum原產(chǎn)于中南美洲,因具有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,現(xiàn)已成為全球發(fā)展較快、需求量較高的五大設(shè)施花卉之一[1]。目前,紅掌已在中國(guó)大部分地區(qū)栽培種植,然而種源多為國(guó)外推廣的高度雜合的商業(yè)品種,基本處于被壟斷狀態(tài)[2],這對(duì)紅掌產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展十分不利,因此積極培育推廣觀賞價(jià)值高,市場(chǎng)前景好,具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良品種,并進(jìn)行國(guó)產(chǎn)化替代是強(qiáng)化紅掌種業(yè)的關(guān)鍵所在。但我國(guó)在紅掌新品種選育方面起步較晚,與國(guó)外相比還存在很大差距,目前通過(guò)自主選育的新品種還較少,已報(bào)道的僅有白馬王子[3]、小嬌紅掌[4]、粉黛[5]、夏焰[6]、明農(nóng)月華[7]等,遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)紅掌新品種多元化的需求。而且紅掌由于自身缺乏飛燕草色素基因F3′5′H,無(wú)法形成深紫色和藍(lán)色佛焰苞的紅掌[8],所以直到目前為止,紫色紅掌一直是紅掌育種的難題,育出的紫色紅掌品種寥寥無(wú)幾,目前市場(chǎng)上比較暢銷(xiāo)的只有荷蘭安祖公司選育推廣的香妃,造成市場(chǎng)長(zhǎng)期緊俏,供不應(yīng)求且種源受制于人,因此迫切需要選育觀賞價(jià)值高、市場(chǎng)前景好的紫色紅掌新品種,將豐富紅掌品種新型花色,彌補(bǔ)當(dāng)前紫色紅掌品種的缺乏;同時(shí)還能有效地推動(dòng)我國(guó)紅掌新品種選育的研發(fā)力度和推進(jìn)紅掌產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。
SNP(Single Nucleotide Polymorphism)即單核苷酸多態(tài)性,因具有數(shù)量大、二態(tài)性、穩(wěn)定遺傳和易于自動(dòng)化檢測(cè)等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究[9]。紅掌基因組大,且無(wú)參考基因組,而簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(GBS,genotyping by sequencing)技術(shù)可以捕獲基因組重要區(qū)域,獲得大量的SNP,且無(wú)須已知基因組信息。因此通過(guò)簡(jiǎn)化基因組測(cè)序構(gòu)建基于SNP標(biāo)記的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)來(lái)確定種質(zhì)資源的親緣關(guān)系是紅掌高效育種的關(guān)鍵步驟。本研究通過(guò)雜交親本的選擇、人工授粉、無(wú)菌播種、單株篩選、擴(kuò)繁與多點(diǎn)試驗(yàn)等,以期選育出觀賞價(jià)值高、抗病性強(qiáng)、適應(yīng)性好的紫色紅掌新品種,滿(mǎn)足消費(fèi)市場(chǎng)對(duì)紫色紅掌品種的需求,同時(shí)利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù),鑒定后代苗的親緣關(guān)系,為紅掌新品種鑒定和構(gòu)建紅掌指紋圖譜等方面提供參考。
本研究采用的16份紅掌材料均來(lái)自三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院花卉所紅掌種質(zhì)資源圃,品種信息見(jiàn)表1。
表1 供試材料名稱(chēng)及來(lái)源
紅掌新品種明農(nóng)傾城以Sensa為母本,該品種佛焰苞為紫色,具有雜交或自交結(jié)實(shí)率高、抗病性強(qiáng)、適應(yīng)性好的特性;以White King為父本,該品種佛焰苞為白色,具有花粉多、抗病性強(qiáng)、適應(yīng)性好的特性。
以觀賞價(jià)值高、抗病性強(qiáng)、適應(yīng)性好的紫色紅掌新品種為育種目標(biāo),結(jié)合簡(jiǎn)化基因組的SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析,選取性狀優(yōu)良的自然群體作為雜交親本,然后進(jìn)行人工授粉雜交、無(wú)菌播種、組培擴(kuò)繁、出苗、單株篩選等紫色紅掌新品種的選育。2014年經(jīng)單株篩選,編號(hào)為12-07-11的單株入選,命名為明農(nóng)傾城。
1.3.1文庫(kù)構(gòu)建流程及測(cè)序 (1)取明農(nóng)傾城、其母本Sensa、其父本W(wǎng)hite King和其他13個(gè)紅掌品種的嫩葉為試驗(yàn)材料,使用CTAB法[10]提取基因組DNA,經(jīng)純度檢測(cè),高質(zhì)量的DNA用于GBS文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序[11];(2)每個(gè)樣本取250 ng,使用8 U MspI和8 U PstI HF(NEB)在30 μL反應(yīng)體系37℃下雙酶切反應(yīng)2 h,隨后在75℃下再孵育20 min,以滅活限制性酶;(3)隨后取20 μL酶切產(chǎn)物,添加1 μL的PstI Adaptor(0.1 mol·μ-1)、1.5 μL的Common Adaptor(0.1 mol·μ-1)、200 U的T4-DNA ligase、4 μL 10×T4-DNA ligase buffer混合,總體積為40 μL在22℃下進(jìn)行連接反應(yīng)2 h;(4)使用0.7體積的Sera-Mag SpeedBbeads(GE Healthcare Life Sciences)對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行純化回收,并清除小于300 bp的片段,室溫下孵育5min,使用磁性支架將珠與上清液分離,并用200 μL新鮮制備的70% 乙醇洗滌3次。用40 μL 10 mol·mL-1Tris-HCl (pH 8.0),從風(fēng)干珠中洗脫DNA;(5)對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為3 μL純化產(chǎn)物、16 μL H2O、5 μL 5×TaqMix(NEB)、0.5 μLPrimer1(10 mol·μ-1)和0.5 μLPrimer2(10 mol·μ-1),首先在95℃下變性30 s,在95℃變性30 s,16個(gè)循環(huán),引物在62℃退火20 s,片段在68℃延伸15 s,然后在68℃下最終片段延伸5 min;(6)在1.5%瓊脂糖凝膠上檢查8 μLPCR產(chǎn)物;(7)使用Qubit測(cè)定每個(gè)樣品的最終難度,僅對(duì)濃度>5.0 ng·μ-1的GBS文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序,對(duì)檢測(cè)合格的樣品取相同總量的DNA(比如30 ng)混合成庫(kù),使用步驟4對(duì)混合完的文庫(kù)進(jìn)行一次清理后即得到最終送測(cè)文庫(kù);(8)使用Illumina Novaseq PE150 測(cè)序平臺(tái)對(duì)混合好的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。
1.3.2SNP位點(diǎn)檢測(cè)及差異分析 (1)使用fastqc軟件對(duì)多樣品混池下機(jī)Raw Reads進(jìn)行質(zhì)控;使用stacks軟件包中的process_radtags程序,去除混池下機(jī)Raw Reads含有接頭序列的Reads,并依據(jù)建庫(kù)樣品與barcode對(duì)應(yīng)關(guān)系拆分為單樣品Raw Reads。(2)使用fastx toolkit軟件包中的fastx trimmer 程序,去除酶切位點(diǎn)序列以及 3′ 端fastqc質(zhì)控質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于20的所有堿基,得到Clean Reads。(3)使用Stacks[12]等軟件構(gòu)建參考基因組,再使用bowtie2軟件將Clean Reads比對(duì)到參考基因組。(4)基于樣品與參考基因組的比對(duì)結(jié)果,利用GATK軟件Haplotype Caller程序生成每個(gè)樣品中的GVCF文件,再通過(guò)GATK軟件Genotype GVCFs程序進(jìn)行群體SNP檢測(cè),對(duì)得到的群體SNP數(shù)據(jù)使用GATK軟件Select Variants程序?qū)︻A(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行篩選,得到初步SNP。(5)為了降低 SNP檢測(cè)的錯(cuò)誤率,使用VCFtools[13]軟件對(duì)獲得SNP分型結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾,過(guò)濾條件為Reads支持?jǐn)?shù)(DP)不低于4;剔除MAF小于0.01的位點(diǎn);剔除SNP分型缺失率高于20%的位點(diǎn)。(6)對(duì)SNP分型結(jié)果進(jìn)行差異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)分析,位點(diǎn)差異篩選標(biāo)準(zhǔn)一是基于進(jìn)行比較的兩組去掉基因型缺失的位點(diǎn),二是組內(nèi)基因型一致。
1.3.3系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 依據(jù)SNP的基因分型結(jié)果,對(duì)個(gè)體SNP標(biāo)記進(jìn)行首尾相連,如果缺失相應(yīng)的位點(diǎn),則用“-”代替。利用MEGA7.0軟件采用鄰接法[14](neighbor-joining method)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)treebest[15]軟件計(jì)算距離矩陣,進(jìn)化樹(shù)的可靠性通過(guò)bootstrap[16]法進(jìn)行檢驗(yàn)(重復(fù)1 000次)。
1.4.1品種比較試驗(yàn) 2014-2015年對(duì)明農(nóng)傾城與市場(chǎng)主流品種香妃進(jìn)行品種比較試驗(yàn)。在成品花時(shí)分別隨機(jī)抽取明農(nóng)傾城、香妃各10盆(2株·盆-1),測(cè)定其株高、冠幅、葉片長(zhǎng)、葉片寬、葉柄長(zhǎng)、葉柄直徑、花梗長(zhǎng)、花梗直徑、佛焰苞長(zhǎng)、佛焰苞寬、肉穗花序長(zhǎng)及肉穗花序中部直徑等主要觀賞性狀。
1.4.2多點(diǎn)區(qū)域試驗(yàn) 2016-2018年,在三明、寧德及龍巖對(duì)明農(nóng)傾城進(jìn)行多點(diǎn)區(qū)域栽培試驗(yàn)。在標(biāo)準(zhǔn)溫室大棚中,每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)種植明農(nóng)傾城100盆,每盆栽2株,按紅掌栽培進(jìn)行正常管理。同時(shí)大棚種植18個(gè)月時(shí),每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)隨機(jī)選取10盆,統(tǒng)計(jì)株高、冠幅、葉片長(zhǎng)、葉片寬、葉柄長(zhǎng)、葉柄直徑、花梗長(zhǎng)、花梗直徑、佛焰苞長(zhǎng)、佛焰苞寬、肉穗花序長(zhǎng)及肉穗花序中部直徑等主要觀賞性狀。
1.4.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
明農(nóng)傾城是由Sensa與 White King人工雜交后代單株選育,選育過(guò)程見(jiàn)圖1。2012年1月人工雜交,同年7月采收25粒成熟雜交種子,并進(jìn)行無(wú)菌瓶播,種子萌發(fā)后獲得18個(gè)雜交后代單株,分別對(duì)每個(gè)單株進(jìn)行小量組培擴(kuò)繁、出苗。2014年9月經(jīng)單株篩選,編號(hào)為12-07-11的單株入選,其性狀穩(wěn)定,適應(yīng)性好,抗寒性、抗病性強(qiáng),觀賞性佳,命名為明農(nóng)傾城,并對(duì)其規(guī)?;庇?。2014-2015年對(duì)明農(nóng)傾城與近似品種香妃進(jìn)行品種比較試驗(yàn),2016-2018年在三明、寧德及龍巖對(duì)明農(nóng)傾城進(jìn)行多點(diǎn)區(qū)域試驗(yàn),2020年7月獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒發(fā)的植物新品種權(quán)證書(shū)。
圖1 明農(nóng)傾城選育過(guò)程Fig.1 Breeding processs of Mingnong Qingcheng
2.2.1特征特性 明農(nóng)傾城株型中等、緊湊,生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)。從組培苗出瓶至第1朵花大約需8個(gè)月,成品花需15個(gè)月,平均株高48.84 cm、冠幅82.82 cm。嫩葉未完全展開(kāi)時(shí)棕黃色(RHS比色卡152A),完全展開(kāi)時(shí)黃綠色(RHS比色卡144A),成熟葉片深綠色(RHS比色卡NN137A),有光澤、中等卵圓形(圖2),平均長(zhǎng)20.21 cm,寬13.24 cm;葉柄棕綠色,平均長(zhǎng)28.53 cm。佛焰苞高于葉,花梗直立、棕紅色,平均長(zhǎng)34.36 cm,直徑4.21 mm;佛焰苞有光澤、中等卵圓形,平均長(zhǎng)10.39 cm,寬5.84 cm,初始和觀賞期為紫色(RHS比色卡N80A),隨著成熟逐漸變?yōu)闇\紫色(RHS比色卡75A),最后衰老變?yōu)榉圩仙?RHS比色卡65C)(圖2);肉穗花序直立,平均長(zhǎng)6.86 cm,中部直徑8.30 mm,花粉囊即將開(kāi)裂時(shí)基部和先端的主色均為深紫色(RHS比色卡79A),隨著成熟逐漸轉(zhuǎn)為淺紫色(RHS比色卡77C)。1葉1花,平均花朵數(shù)6.5個(gè),常年開(kāi)花;單花壽命60~120 d,最佳觀賞期30~35 d,花期持久。
圖2 明農(nóng)傾城葉片與花形態(tài)Fig.2 Morphology of the leaves and flowers of Mingnong Qingcheng
2.2.2品種比較試驗(yàn)表現(xiàn) 由表2、圖3可知,明農(nóng)傾城株高、葉柄長(zhǎng)和花梗直徑與香妃無(wú)顯著差異;冠幅、葉片長(zhǎng)、葉片寬、葉柄直徑、花梗長(zhǎng)、佛焰苞長(zhǎng)、佛焰苞寬、肉穗花序長(zhǎng)和肉穗花序中部直徑等與香妃差異顯著。另外,明農(nóng)傾城嫩葉為黃綠色(RHS比色卡144A)、中等卵圓形(圖3-A),香妃嫩葉為綠色(RHS比色卡137A)、披針形(圖3-B);明農(nóng)傾城的花梗長(zhǎng)度顯著比香妃的長(zhǎng),明農(nóng)傾城的佛焰苞明顯比香妃的大,且明農(nóng)傾城的肉穗花序明顯比香妃的長(zhǎng)且粗(圖3-C、圖3-D)。
表2 明農(nóng)傾城與香妃形態(tài)學(xué)特征比較
注:A為明農(nóng)傾城嫩葉;B為香妃嫩葉;C為明農(nóng)傾城的花;D為香妃的花圖3 明農(nóng)傾城與香妃嫩葉和花的形態(tài)比較Fig.3 Morphological comparison of the tender leaves and flowers between Mingnong Qingcheng and Xiangfei
2.2.3多點(diǎn)試驗(yàn)表現(xiàn) 由表3可知,明農(nóng)傾城在3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的主要觀賞性狀表現(xiàn)較穩(wěn)定,其中只有株高和冠幅在寧德和三明2個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)之間有顯著差異,這可能與高海拔氣候有關(guān),同等生長(zhǎng)周期高海拔地區(qū)紅掌生長(zhǎng)更快;其他性狀差異不顯著。此外,明農(nóng)傾城在3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的花色一致且夏季不褪色,株型中等、緊湊,生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng),未出現(xiàn)明顯的病蟲(chóng)害現(xiàn)象。
表3 明農(nóng)傾城多點(diǎn)試驗(yàn)主要性狀表現(xiàn)
2.2.4栽培技術(shù)要點(diǎn) 在溫室大棚中參照福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB35/T 1239-2012《紅掌盆花生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》進(jìn)行栽培養(yǎng)護(hù)。選取生長(zhǎng)健壯、剛剛展開(kāi)的幼嫩葉片、葉柄為外植體進(jìn)行組培快繁,待生根苗高2~3 cm、根2~3條時(shí)出瓶移植,用甲基托布津或多菌靈可濕性粉劑800倍液消毒處理后,種植于128孔穴盤(pán),種植后立馬澆透水,并用甲基托布津或多菌靈可濕性粉劑噴施1次;種植后10 d內(nèi)基質(zhì)保持濕潤(rùn),10 d后基質(zhì)保持干濕交替。待幼苗長(zhǎng)至9 cm左右高時(shí)移至上口徑9 cm 的塑料小盆中種植,每盆2株;上盆后立馬澆透水,之后保持盆中基質(zhì)干濕交替。待苗長(zhǎng)至15 cm高時(shí)移至上口徑13 cm 的塑料盆中種植;換盆后立馬澆透水,并合理密植。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段施用 N∶P∶K為20∶10∶20 的水溶肥,生殖生長(zhǎng)階段施用 N∶P∶K為10∶30∶20 的水溶性肥。
注意防治細(xì)菌性疫病、莖基腐病等病害,病害發(fā)生后應(yīng)及時(shí)處理病株病葉,防止擴(kuò)散。注意防治紅蜘蛛、斜紋夜蛾、蚧殼蟲(chóng)和薊馬等蟲(chóng)害,可采用克螨特、吡蟲(chóng)啉、阿維菌素等相應(yīng)殺蟲(chóng)劑進(jìn)行防治。每種病蟲(chóng)害用藥噴施連續(xù)使用不宜超過(guò)3次,可交替施用。
由表4可知,明農(nóng)傾城、Sensa和White King的測(cè)序序列總量為18 161 130條,總堿基數(shù)據(jù)量2.67 Gb;過(guò)濾后得到高質(zhì)量總堿基數(shù)據(jù)量為2.47 Gb,平均樣本數(shù)據(jù)量為0.82 Gb,堿基質(zhì)量值Q20和Q30分別平均為96.52%和91.29%。經(jīng)過(guò) SNP位點(diǎn)檢測(cè)并過(guò)濾,共獲得27 969個(gè)SNP 位點(diǎn)。
從表5可知,比較明農(nóng)傾城與其母本Sensa的SNP總差異位點(diǎn)有2 835個(gè),相同位點(diǎn)21 591個(gè);明農(nóng)傾城與其父本W(wǎng)hite King的SNP總差異位點(diǎn)3 025個(gè),相同位點(diǎn)22 344個(gè);而父母本的SNP位點(diǎn)與子代相比,有更多的差異位點(diǎn)有3 794個(gè),相同位點(diǎn)更少為20 618個(gè);另外,明農(nóng)傾城紅掌與其母本Sensa和父本W(wǎng)hite King的SNP位點(diǎn)相似系數(shù)為88.39%、88.08%,表明明農(nóng)傾城在SNP位點(diǎn)基因型上與母本Sensa親緣關(guān)系更接近。
表4 紅掌測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析
表5 明農(nóng)傾城、Sensa和 White King SNP差異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)
利用27 969個(gè)SNP標(biāo)記位點(diǎn)通過(guò)MEGA7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。對(duì)16份種質(zhì)資源進(jìn)行聚類(lèi)分析,結(jié)果表明這些種質(zhì)資源被劃分為3個(gè)居群,第一居群(綠色)包含9份紅掌種質(zhì)資源,包含Pink Champion(An107)、White Champion(An2)、Pandola(An124)、Cavalli(An139)、明農(nóng)紅唇(An21)、Casanova(An106)、明農(nóng)霞光(An36)、Piccolo(An143)和Smprem(An99)。第二居群(紅色)5份資源,包含Cherry Champion(An147)、Sensa(An80)、明農(nóng)傾城(An14)、明農(nóng)月華(An15)和 White King(An81);其余2份種質(zhì)資源屬于第三居群(黑色) ,分別為ANTH42(An135)和Anouk(An188)(圖4)。
圖4 基于NJ法的紅掌16個(gè)個(gè)體系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on NJ of 16 individuals of A.andraeanum
紅掌為舶來(lái)品,市場(chǎng)種源基本處于被國(guó)外壟斷狀態(tài),只有積極選育并推廣具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良新品種才能強(qiáng)化我國(guó)紅掌種業(yè),而目前市場(chǎng)上比較暢銷(xiāo)的紫色紅掌品種只有荷蘭安祖公司的香妃,造成市場(chǎng)長(zhǎng)期緊俏,供不應(yīng)求,因此迫切需要選育紫色紅掌新品種來(lái)豐富紅掌花色,彌補(bǔ)當(dāng)前紫色紅掌品種的缺乏。近些年來(lái),隨著紅掌育種技術(shù)的不斷發(fā)展,出現(xiàn)了紅掌誘變育種[17-18]、倍性育種[19-21]及分子育種[22-24]等研究的報(bào)道,但目前有性雜交和后代篩選仍是紅掌新品種選育的最主要手段[25-26]。本試驗(yàn)采用常規(guī)雜交育種的方法以Sensa為母本、White King為父本雜交選育出紫色紅掌新品種明農(nóng)傾城。
利用GBS-seq 的SNP位點(diǎn)和進(jìn)化樹(shù)分析是鑒定品種間的親緣關(guān)系的可靠方法。本試驗(yàn)對(duì)明農(nóng)傾城紅掌和其父母本進(jìn)行SNP分子鑒定及比較分析,結(jié)果顯示明農(nóng)傾城的SNP位點(diǎn)與其母本差異點(diǎn)要少于與其父本的差異,同時(shí)明農(nóng)傾城紅掌與其父母本相同的SNP位點(diǎn)要多于父母之間共同的位點(diǎn),明農(nóng)傾城紅掌與其母本Sensa和父本 White King的SNP位點(diǎn)相似系數(shù)為88.39%、88.08%。另外,通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析,明農(nóng)傾城遺傳距離更接近母本Sensa。以上證實(shí)明農(nóng)傾城紅掌與其父母在分子水平存在差異,明農(nóng)傾城在SNP位點(diǎn)基因型上與母本Sensa親緣關(guān)系也更接近。
明農(nóng)傾城與主流品種香妃進(jìn)行品種比較試驗(yàn)表明,明農(nóng)傾城比香妃的花梗更長(zhǎng)、佛焰苞更大,且明農(nóng)傾城的肉穗花序顯著比香妃的長(zhǎng)且粗。經(jīng)過(guò)多點(diǎn)區(qū)域試驗(yàn)表明,明農(nóng)傾城在3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的主要觀賞性狀表現(xiàn)較穩(wěn)定,適宜于大面積推廣應(yīng)用,市場(chǎng)前景看好。