黃雪冰，陳雅娟

(細(xì)胞逆境響應(yīng)與代謝調(diào)控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108)

奶牛乳房炎是一種主要由致病微生物引起的奶牛常見病，是對(duì)全世界奶牛產(chǎn)業(yè)造成損失最嚴(yán)重的疾病[1]。引發(fā)奶牛乳房炎的致病菌主要為大腸桿菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌[2-3]。而由于金黃色葡萄球菌對(duì)抗生素極易產(chǎn)生耐藥性，使得該菌引發(fā)的奶牛乳房炎治愈率很低[4]。因此，及時(shí)鑒定病原菌種類，盡快制定對(duì)應(yīng)的殺菌策略，對(duì)癥下藥，減少耐藥細(xì)菌產(chǎn)生，對(duì)治療奶牛乳房炎至關(guān)重要。

常規(guī)的微生物鑒定法對(duì)分離出來的細(xì)菌分析比較單一片面，且耗時(shí)較長(zhǎng)[5-6]，難以在畜牧業(yè)中廣泛推廣。目前隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)技術(shù)成為細(xì)菌檢測(cè)的新興手段[7]。奶牛畜牧場(chǎng)的微生物鑒定常常會(huì)采用16S rRNA保守序列作為分子標(biāo)記來鑒定從生牛乳中分離出來的細(xì)菌種類[8-9]。但是由于金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，細(xì)胞壁較密較厚，且有莢膜等結(jié)構(gòu)[5]，細(xì)菌DNA較難發(fā)生泄漏，不能像革蘭氏陰性菌可以直接使用菌落或者菌液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10]，傳統(tǒng)鑒定金黃色葡萄球菌都是提前采用溶葡球菌酶對(duì)其細(xì)胞壁進(jìn)行裂解，再提取其基因組進(jìn)行后續(xù)的PCR檢測(cè)[11-12]。但溶葡球菌酶的價(jià)格昂貴，且提取基因組過程煩瑣，至少需要2 h，如果僅是應(yīng)用于微生物鑒定檢測(cè)，則缺乏經(jīng)濟(jì)實(shí)用性。

近些年來，研究人員通過摸索探究，發(fā)現(xiàn)了一些物理方法或者化學(xué)方法可以代替溶葡球菌酶實(shí)現(xiàn)金黃色葡萄菌基因組的提取，比如CTAB法[5]、SDS法[5]、凍融法[13]、煮沸法[1]、微波法[14]和玻璃微珠法[15]等，這些方法確實(shí)節(jié)省了很多經(jīng)濟(jì)成本和時(shí)間成本，有很大的應(yīng)用價(jià)值。但是本課題組發(fā)現(xiàn)，他們都是采用金黃色葡萄球菌的細(xì)菌培養(yǎng)液，即菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而菌液至少需要16 h的培養(yǎng)期，且也會(huì)出現(xiàn)金黃色葡萄球菌無法擴(kuò)增出條帶的情況出現(xiàn)[13]。

為了進(jìn)一步節(jié)約時(shí)間成本，本試驗(yàn)擬探討菌落能否代替菌液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。首先通過煮沸法、凍融法、微波法分別處理金黃色葡萄球菌的菌液以及菌落，對(duì)比二者的PCR擴(kuò)增效果；然后選取5株不同的金黃色葡萄球菌分別進(jìn)行處理，測(cè)試菌落DNA提取方法的適用性；再對(duì)比不同處理時(shí)間的擴(kuò)增效果，分析3種方法所需的最短時(shí)間；最終對(duì)比菌落經(jīng)過3種方法處理后的上清中的DNA含量，獲得更適用于PCR擴(kuò)增的提取方法。本研究通過試驗(yàn)證明僅通過金黃色葡萄球菌的菌落也可以提取出用于PCR擴(kuò)增的基因組DNA，為金黃色葡萄球菌DNA的快速提取提供新策略。

1 材料與方法

1.1 菌株

以金黃色葡萄球菌ATCC25923、Newman、RN4220、ATCC6538、MRSA為試驗(yàn)菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基TSB(北京索萊寶科技有限公司)、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基TSA(北京索萊寶科技有限公司)、溶葡球菌酶[生工生物工程(上海)股份有限公司]、PCR試劑PowerPol 2×PCR MIX with Dye(武漢愛博泰克生物科技有限公司)、瓊脂糖(北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司)、MarkerⅡ DNA ladder(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、核酸染料GelStain(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、細(xì)菌基因組DNA純化試劑盒EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)

1×TE緩沖液配制：1 mL體系中，980 uL高溫高壓滅菌雙蒸水、10 uLEDTA、10 uLTris-HCl(pH=8.0)。

1×TAE緩沖液配制：1 L體系中，Tris 242 g、Na2EDTA·2H2O 37.2 g、加入57.1 mL的冰乙酸，充分?jǐn)嚢?；加去離子水定容至1 L后，室溫保存。使用時(shí)用去離子水稀釋50倍。

1.3 儀器

微波爐(廣州格蘭仕集團(tuán)有限公司)、加熱制冷型金屬浴連接儀[卡尤迪生物科技(北京)有限公司]、DYY-6C電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)[儀生儀世(上海)生物科技有限公司]。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)菌培養(yǎng)及樣品收集 細(xì)菌培養(yǎng)：用滅過菌的槍頭挑取少量-80℃凍存的金黃色葡萄球菌，劃線于對(duì)應(yīng)抗性的TSA板上，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育至有明顯菌落。

菌液收集：挑取單菌落于1 mL新鮮配制的TSB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 h至菌液渾濁。收集上述菌液15 uL于0.2 mLPCR管中，12 000 r·min-1，60 s離心去掉上清，加入30 uL1×TE緩沖液，渦旋混勻。

菌落收集：在0.2 mLPCR管中各添加30 uL1×TE緩沖液，挑取金黃色葡萄球菌單菌落，在1×TE緩沖液中吹打，讓部分菌落能落在緩沖液中，再將槍頭打進(jìn)含1 mL LB的試管中培養(yǎng)。

1.4.2DNA提取方法 DNA提取方法見表1。

表1 DNA提取方法操作步驟

1.4.3PCR擴(kuò)增參數(shù) 采用NCBI上已經(jīng)公布的金黃色葡萄球菌16SrRNA基因，設(shè)計(jì)基因引物為：16SrRNA-F (5′-GCGGTCGCCTCCTAAAAG-3′)，16SrRNA-R (5′-TCCCGGTCCTCTCGTACTA-3′)。

PCR反應(yīng)體系：2×PCR MIX with Dye 2.5 uL，引物各0.2 uL，模板1 uL，超純水定容至10 uL。

PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性60 s；進(jìn)入PCR循環(huán)95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。

1.4.4瓊脂糖凝膠電泳 稱取1 g瓊脂糖粉末，加入100 mL 1×TAE緩沖液，微波爐中高火加熱2～3 min，直到粉末溶解，再1∶10 000加入核酸染料GelStain，凝固后在每個(gè)孔槽中加入10 uLPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳時(shí)間為40 min。最后的結(jié)果用凝膠成像儀進(jìn)行拍照保存。根據(jù)電泳圖譜來判斷3種金黃色葡萄球菌菌落DNA提取方法的效果，擴(kuò)增條帶大小為419 bp。

1.4.53種方法對(duì)金黃色葡萄球菌的菌液以及菌落DNA的提取效果比較 通過煮沸法、凍融法和微波法分別處理金黃色葡萄球菌ATCC25923的菌液以及菌落60 s，提取DNA。通過PCR擴(kuò)增目的條帶，瓊脂糖凝膠電泳圖譜鑒定DNA的提取情況，比較菌液以及菌液的提取效果。以溶葡球菌酶裂解細(xì)菌提取金黃色葡萄球菌ATCC25923基因組為陽性對(duì)照。

1.4.63種方法對(duì)不同金黃色葡萄球菌的菌落DNA的提取效果測(cè)試 使用本課題組所擁有的共5株金黃色葡萄球菌(ATCC25923、Newman、RN4220、ATCC6538、MRSA)各進(jìn)行3種方法的菌落DNA的提取，處理時(shí)間均為60 s，通過PCR擴(kuò)增目的條帶，瓊脂糖凝膠電泳圖譜鑒定DNA的提取情況。

1.4.73種方法提取金黃色葡萄球菌的菌落DNA的時(shí)間梯度測(cè)試 控制煮沸法、凍融法和微波法的處理時(shí)間為10、20、30、40、50、60 s，分別對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923的菌落進(jìn)行DNA提取，通過PCR擴(kuò)增目的條帶，瓊脂糖凝膠電泳圖譜鑒定DNA的提取情況。以溶葡球菌酶裂解細(xì)菌提取金黃色葡萄球菌ATCC25923基因組為陽性對(duì)照。

1.4.83種方法提取金黃色葡萄球菌菌落DNA濃度比較 挑取過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌ATCC25923的菌落，于30 uL 1×TE緩沖液中吹打混勻。共20個(gè)樣品，分為4組，每組5個(gè)樣品作為平行。其中3組樣品分別通過煮沸法、凍融法和微波法進(jìn)行處理，最后1組不進(jìn)行處理，作為陰性對(duì)照。處理時(shí)間均為10 s，隨后離心,取2.5 uL的上清進(jìn)行dsDNA(雙鏈DNA)含量的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種方法對(duì)金黃色葡萄球菌菌液以及菌落DNA的提取效果比較

由圖1可知，煮沸法、凍融法和微波法均可使菌液或者菌落擴(kuò)增出清晰正確的條帶。雖然菌液DNA的擴(kuò)增條帶更加明亮，但是菌落DNA擴(kuò)增出的條帶已經(jīng)足夠單一清晰，完全滿足鑒定結(jié)果的分析。

注：第1道為溶葡菌球酶提取的金黃色葡萄球菌基因組的PCR條帶，2、3、4道分別為煮沸法、凍融法以及微波法提取的金黃色葡萄球菌菌液PCR條帶，5、6、7道分別為煮沸法、凍融法以及微波法提取的金黃色葡萄球菌菌落PCR條帶圖1 3種方法提取金黃色葡萄球菌菌液及菌落DNA的PCR擴(kuò)增效果Fig.1 PCR amplification effect of DNA extracted from the bacteria solution and colony of Staphylococcus aureus by the three methods

2.2 3種方法對(duì)不同金黃色葡萄球菌菌落DNA的提取效果測(cè)試

由圖2可知，經(jīng)過3種方法處理，不同的金黃色葡萄球菌的16S rRNA都可以被擴(kuò)增出來，說明菌落DNA提取方法對(duì)于金黃色葡萄球菌具有普遍適用性。

2.3 3種方法提取金黃色葡萄球菌菌落DNA的時(shí)間梯度測(cè)試

由圖3可知，煮沸法、凍融法和微波法均僅需10 s即可快速提取出金黃色葡萄球菌菌落的DNA，電泳圖譜結(jié)果顯示，不同時(shí)間處理提取的菌落DNA擴(kuò)增條帶都很準(zhǔn)確單一，且并無時(shí)間依賴。故后續(xù)試驗(yàn)采用10 s作為處理時(shí)間。

注：第1道為ATCC25923提取的PCR條帶，第2道為Newman提取的PCR條帶，第3道為RN4220提取的PCR條，第4道為ATCC6538提取的PCR條帶，第5道為MRSA提取的PCR條帶圖2 3種方法對(duì)不同金黃色葡萄球菌DNA的快提效果Fig.2 Effect of the three methods on the rapid extraction of DNA from different Staphylococcus aureus

注：第1-6道分別是3種不同方法處理10、20、30、40、50、60 s后PCR擴(kuò)增的條帶，第7道是利用溶葡菌酶提取的ATCC25923基因組PCR擴(kuò)增條帶圖3 3種提取方法對(duì)金黃色葡萄球菌DNA時(shí)間梯度Fig.3 Time gradient of the three extraction methods on the DNA extraction from Staphylococcus aureus

2.4 3種方法提取金黃色葡萄球菌菌落DNA濃度比較

由表2可知，煮沸法、凍融法和微波法提取的金黃色葡萄球菌菌落DNA濃度的平均值分別為17.62、7.62 、6.58 ng·mL-1，凍融法和微波法提取DNA濃度較不處理組(2.86 ng·mL-1)顯著提高，而煮沸法較不處理組極顯著提高。

表2 3種方法提取的金黃色葡萄球菌菌落DNA濃度 (單位： ng·mL-1)Table 2 Concentration of DNA extracted from Staphylococcus aureus colony by the three methods

3 結(jié)論與討論

奶牛養(yǎng)殖業(yè)中時(shí)常會(huì)爆發(fā)的奶牛乳房炎，很多時(shí)候都是因?yàn)楦腥玖私瘘S色葡萄球菌，這不但會(huì)給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失，也有可能危害消費(fèi)者的身體健康。因此，快速鑒定病原菌種類，用正確的抗生素對(duì)其進(jìn)行殺滅，才能避免更大的損失。

PCR技術(shù)目前已經(jīng)成為各大微生物鑒定必不可少的分子技術(shù)手段，但是以金黃色葡萄球菌為代表的葡萄球菌屬由于其細(xì)胞壁厚等特點(diǎn)，DNA的提取較為困難。目前還有許多課題組還依然在采用傳統(tǒng)的溶葡球菌酶法提取金黃色葡萄球菌的基因組進(jìn)行后續(xù)的研究。但溶葡球菌酶價(jià)格相當(dāng)昂貴，操作也是較為復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)于僅需要驗(yàn)證的試驗(yàn)來說實(shí)用性不強(qiáng)。在近幾年的探索中，陸續(xù)有研究人員發(fā)現(xiàn)一些方法可以代替溶葡球菌酶提取基因組，但是都是采用培養(yǎng)到平臺(tái)期的菌液來進(jìn)行試驗(yàn)。故本研究本著進(jìn)一步減少時(shí)間成本的目的，測(cè)試了直接采取金黃色葡萄球菌菌落作為PCR模板的擴(kuò)增效果。結(jié)果表明菌落中提取出的基因組DNA足夠作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，尤其是像細(xì)菌種類檢測(cè)這樣不需要太高精確度的研究，菌落PCR正適合作為初步的篩選技術(shù)。本試驗(yàn)測(cè)試了3種處理方法，研究結(jié)果表明3種方法均能協(xié)助快速提取金黃色葡萄球菌菌落中的DNA，其中煮沸法對(duì)菌落DNA的提取效果最佳。本研究通過改進(jìn)試驗(yàn)方法，縮短DNA提取時(shí)間，能在PCR鑒定表現(xiàn)出較大優(yōu)勢(shì)，期望本研究結(jié)果能為金黃色葡萄球菌的分子檢測(cè)提供一個(gè)方法學(xué)的參考，以此協(xié)助奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。