馬月龍，賴澤迎，馮荊城，林少青，陳雅娟

(細(xì)胞逆境響應(yīng)與代謝調(diào)控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108)

慶大霉素1966年在我國(guó)被王岳教授首次分離，并實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)，它是畜牧養(yǎng)殖業(yè)重要的氨基糖苷類抗生素之一，伴隨著其長(zhǎng)期大量的使用，耐藥性問題日益突出造成慶大霉素的有效利用率顯著降低[1-2]，從細(xì)胞水平尋找耐藥菌對(duì)抗生素的敏感位點(diǎn)使其重新發(fā)揮作用迫在眉睫。本研究發(fā)現(xiàn)外膜蛋白o(hù)mpC過表達(dá)能夠極顯著提高慶大霉素對(duì)大腸桿菌的殺傷效果，這可以有效阻止抗生素耐藥性在農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖業(yè)中的蔓延，具有二次利用現(xiàn)有慶大霉素快速將致病菌進(jìn)行殺滅的重大價(jià)值。目前關(guān)于大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥性機(jī)制的認(rèn)識(shí)主要包括三個(gè)方面：一是大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物細(xì)胞內(nèi)積累量的降低[3]；二是氨基糖苷類抗生素鈍化酶對(duì)氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生了修飾行為[4-5]；三是突變或甲基化修飾改變了氨基糖苷類抗生素在細(xì)菌核糖體30S亞基中16S rRNA上的結(jié)合作用位點(diǎn)。其中后兩種機(jī)制可造成更高水平的耐藥性[6-7]， 針對(duì)大腸桿菌對(duì)慶大霉素耐藥性問題，在體外水平上，目前主要采用聯(lián)合防治策略，通過慶大霉素與其他抗菌藥物的聯(lián)合使用，特別是與β-內(nèi)酰胺類抗生素協(xié)同使用使其成為在養(yǎng)殖業(yè)抗擊病原菌嚴(yán)重感染中的利器[8]。在體內(nèi)水平上，趙艷娜等[9]創(chuàng)新性提出，可通過快速冷凍提高藥物在菌體胞內(nèi)的積累達(dá)到清除致病菌的目的。另有呂波燕等[10]研究表明低離子休克能夠增強(qiáng)耐藥菌對(duì)慶大霉素的攝取，從而造成對(duì)病原菌的殺滅。多項(xiàng)研究有力表明離子通道蛋白可作為有力的潛在藥敏靶點(diǎn)[11-12]。同時(shí)，醇類、吲哚及抗菌肽等代謝物被報(bào)道能輔助慶大霉素殺滅致病性大腸桿菌[13-14]，然而目前尚未有研究表明外膜蛋白在慶大霉素對(duì)致病性大腸桿菌的殺菌效果上具有潛在的作用。

本研究借鑒前人經(jīng)驗(yàn)聚焦于大腸桿菌外膜蛋白家族，以期在眾多外膜蛋白中發(fā)現(xiàn)新的有助于菌體攝取慶大霉素的敏感結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)掘外膜孔蛋白上在應(yīng)對(duì)慶大霉素耐藥性的潛在價(jià)值。大腸桿菌膜上主要的孔蛋白o(hù)mpC非常豐富，并且都具有陽(yáng)離子選擇性[15]，有極大的可能性利于菌體對(duì)抗生素的額外攝取。故本試驗(yàn)提出假設(shè)，過表達(dá)孔蛋白o(hù)mpC是否有助于抗生素通過細(xì)菌膜進(jìn)入胞內(nèi)起到殺菌的目的。本研究通過使用pCA24N表達(dá)載體構(gòu)建大腸桿菌外膜蛋白過表株W3110-p4A24N(ompC)，并與野生型進(jìn)行慶大霉素殺傷效果比較，測(cè)試大腸桿菌ompC過表達(dá)對(duì)慶大霉素殺菌效果的影響。利用免疫印跡法探究ompC蛋白表達(dá)量與慶大霉素殺菌效果的關(guān)系，并進(jìn)一步測(cè)定過表達(dá)菌株的MIC，以評(píng)估大腸桿菌膜孔隙蛋白在抗生素體內(nèi)的殺傷作用，以期望發(fā)現(xiàn)新的藥敏靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)采用的菌株見表1。

表1 菌株的名稱及其來源

1.2 抗生素類型

所用抗生素和使用濃度見表2。

表2 抗生素名稱和使用濃度

1.3 主要儀器

超低溫冰箱(-80℃)、潔凈工作臺(tái)、恒溫震蕩培養(yǎng)箱(37℃)、紫外可見分光光度計(jì)、掃描儀、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、電泳儀、制冰機(jī)、加熱制冷型金屬浴連接儀、蛋白質(zhì)凝膠轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、水平搖床、垂直脫色搖床等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1過表達(dá)載體W3110-pCA24N(ompC)測(cè)序驗(yàn)證 從-80℃超低溫冰箱的ASKA文庫(kù)中選取W3110-pCA24N(ompC),劃在氯霉素抗性固體LB固體培養(yǎng)基平板上，挑取單克隆，再用新鮮氯霉素抗性液體LB培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h,用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取質(zhì)粒(依照產(chǎn)品說明書操作)，取0.2 mL到EP管中，用已合成的上下游引物p-sfiⅠ和p-NotI送去公司對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行基因序列的驗(yàn)證，引物序列見表3。

表3 引物序列

1.4.2免疫印跡法檢測(cè)ompC過表達(dá)情況 將W3110-pCA24N、W3110-pCA24N(ompC)按1∶100的接菌比例轉(zhuǎn)接至含氯霉素抗性的液體LB中，在搖床中培養(yǎng)至OD600≈0.5～0.6時(shí)加不同濃度的IPTG(一種誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的試劑，全名為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(0.1、0.5、1 mmol·L-1)，繼續(xù)放置在搖床中誘導(dǎo)至OD600≈0.8,之后取菌液1 mL，12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心機(jī)離心2 min，棄上清加入30 μL的10% SDS溶液和30 μL的6× loading buffer，混合均勻，置于100℃的金屬浴上煮沸15 min。用10%的SDS-PAGE凝膠電泳將樣品進(jìn)行分離，電泳液為1×SDS電泳緩沖液。凝膠電泳結(jié)束后，使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后封閉液封閉1 h。封閉結(jié)束后，加入一抗，置于水平搖床上反應(yīng)30 min后，置于4℃冰箱過夜靜置12 h。過夜后的膜置于垂直脫色搖床上，用1× TBST緩沖液洗滌3次，每次間隔8～10 min。洗滌后置于水平搖床上，加入二抗反應(yīng)1.5 h，再換置于搖床上，用1×TBST緩沖液洗滌3次，每次間隔8～10 min。最后進(jìn)行BCIP/NBT試劑顯色。

1.4.3ompC過表達(dá)菌株抗生素敏感性檢測(cè) 將菌株W3110-pCA24N、W3110-pCA24N(ompC)預(yù)先活化。將活化好的菌液1∶100轉(zhuǎn)接至含氯霉素液體LB中，置于搖床中培養(yǎng)至OD600≈0.5～0.6時(shí)加入終濃度分別為0.1、0.5、1 mmol·L-1的IPTG，繼續(xù)放置于搖床中誘導(dǎo)至OD600≈0.8。取菌液100 μL于EP管中，12 000 r·min-1離心2 min，去上清，用等體積的0.01 mol·L-1PBS緩沖液重懸作為對(duì)照樣品備用。取1 mL誘導(dǎo)至OD600≈0.8的菌液于玻璃搖菌管中，離心去上清，加入10% SDS溶解液和6×loadiong buffer緩沖液進(jìn)行制樣后進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，同時(shí)取1 mL離心去上清，采用慶大霉素對(duì)過表達(dá)誘導(dǎo)程度不同的大腸桿菌進(jìn)行處理，置于搖床中培養(yǎng)，45 min后取100 μL于EP管中，離心后去上清，用等體積的0.01 mol·L-1PBS緩沖液重懸作為試驗(yàn)樣品，將以上樣品用緩沖液梯度稀釋后點(diǎn)板，平板在37℃過夜培養(yǎng)12 h，觀察細(xì)菌存活情況，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。取3次平行試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

1.4.4ompC過表達(dá)菌株最小抑菌濃度(MIC)測(cè)試 最小抑菌濃度MIC是抑制細(xì)菌生長(zhǎng)所加的最小的藥物濃度，同時(shí)這也是判斷藥物是否有效的標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)際抗菌素協(xié)會(huì)規(guī)定用二倍稀釋法來確定MIC[16]。

將活化好的W3110-pCA24N、W3110-pCA24N(ompC)按1∶100轉(zhuǎn)接至含氯霉素液體LB中，置于搖床中培養(yǎng)至OD600≈0.5～0.6時(shí)加入濃度為1 mmol·L-1的IPTG，繼續(xù)放置于搖床中誘導(dǎo)至OD600≈0.8。2倍稀釋法將抗生素稀釋成相應(yīng)濃度(0、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg·mL-1)，在無(wú)菌96孔板上按照濃度梯度順序每孔加入200 μL抗生素稀釋液，將誘導(dǎo)后的菌液稀釋5倍后，每個(gè)孔中加入2 μL稀釋后的菌液即每孔菌量約為105～106CFU·mL-1，全部上樣完成后，37℃靜置培養(yǎng)24 h。取出96孔板，用槍頭輕輕吹打混勻菌液，在肉眼條件下對(duì)光觀察，清澄透光的孔對(duì)應(yīng)的最低抗生素濃度為該菌體外培養(yǎng)最低抑菌濃度(MIC)。

圖1 W3110-pCA24N(ompC)測(cè)序結(jié)果Fig.1 Sequencing results of W3110-pCA24N (ompC)

2 結(jié)果與分析

2.1 過表達(dá)載體W3110-pCA24N(ompC)測(cè)序驗(yàn)證

將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast序列比對(duì)，由圖1可知，測(cè)序結(jié)果與該基因原始序列一致且相似度將近100%。

2.2 免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果分析

由圖2可知，0.1、0.5和1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)的3個(gè)W3110-pCA24N(ompC)分別用A、B、C表示，均成功跑出條帶，提示W(wǎng)3110-pCA24N(ompC)過表達(dá)誘導(dǎo)成功(ompC蛋白大小約38 kDa)，并且該蛋白的表達(dá)量隨著IPTG濃度的升高而升高。

圖2 不同誘導(dǎo)濃度下W3110-pCA24N(ompC)免疫印跡檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Immunoblotting detecting results of W3110-pCA24N(ompC) at different induced concentrations

2.3 ompC過表達(dá)提高大腸桿菌對(duì)慶大霉素的敏感性

由圖3可知，經(jīng)過比對(duì)分析，慶大霉素對(duì)W3110-pCA24N(ompC)組的殺菌效果明顯強(qiáng)于W3110-pCA24N組，表明過表達(dá)ompC能顯著增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)慶大霉素的敏感性；W3110-pCA24N(ompC)經(jīng)不同濃度IPTG誘導(dǎo)后大腸桿菌對(duì)慶大霉素的敏感性隨著IPTG濃度的升高而增強(qiáng)。

2.4 測(cè)定過表達(dá)菌株最小抑菌濃度

由圖4可知，過表達(dá)ompC后的菌株 W3110-pCA24N(ompC)的最小抑菌濃度8 ug·mL-1明顯低于W3110-pCA24N(野生型)的16 ug·mL-1，表明外膜蛋白o(hù)mpC的過表達(dá)增強(qiáng)了大腸桿菌對(duì)慶大霉素的敏感性。

圖3 不同濃度誘導(dǎo)野生型和W3110-pCA24N(ompC)過表達(dá)株對(duì)慶大霉素的敏感性Fig.3 Sensitivity of the wild-type strain and the over-expressing strain of W3110-pCA24N (ompC) to gentamicin induced by different concentrations

圖4 W3110-pCA24N和W3110-pCA24N(ompC)過表達(dá)株最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果Fig.4 Determined results of the minimum inhibitory concentration of W3110-pCA24N and the over-expressing strain of W3110-pCA24N (ompC)

3 結(jié)論與討論

抗生素在防治人和動(dòng)物疾病、促進(jìn)畜牧養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展中起著舉足輕重的作用，但隨著其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和臨床治療中的廣泛使用甚至濫用，細(xì)菌耐藥性問題日益突出。促使抗菌藥物對(duì)耐藥菌重新發(fā)揮殺菌作用，提高現(xiàn)存抗生素的有效利用率是阻止細(xì)菌耐藥現(xiàn)象蔓延的關(guān)鍵一步。因此在分子水平上尋找新的藥物敏感位點(diǎn)是必要的。細(xì)菌與外界環(huán)境的交流主要通過外膜蛋白來進(jìn)行，同時(shí)這也是抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌當(dāng)中發(fā)揮作用的重要通道。如果外膜蛋白的表達(dá)量下降，抗菌藥物就無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，宏觀上表現(xiàn)出細(xì)菌對(duì)該抗菌藥物的耐受性增強(qiáng)[17]。近年來，研究大腸桿菌耐藥機(jī)制的方向主要是改變外膜通透性、形成相應(yīng)水解酶、泵系統(tǒng)外排、改變作用靶位、減小外膜滲透壓以及形成生物被膜等多種方面[18]，已有相關(guān)研究表明大腸桿菌可以通過被改變外膜通透性、調(diào)節(jié)控制外膜蛋白的結(jié)構(gòu)來影響其敏感性[19-20]。

大腸桿菌的外膜蛋白o(hù)mpC作為其中數(shù)量較多的外膜蛋白之一，本研究發(fā)現(xiàn)ompC過表達(dá)后能夠極其顯著降低大腸桿菌對(duì)慶大霉素的存活率，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，最小抑菌濃度(MIC)明顯降低，因此認(rèn)為外膜蛋白o(hù)mpC過表達(dá)顯著提高了大腸桿菌對(duì)慶大霉素敏感性，慶大霉素更多地被攝入大腸桿菌胞內(nèi)，這使得大腸桿菌對(duì)慶大霉素的耐藥性降低，增強(qiáng)了慶大霉素的殺菌效果。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于治療致病性菌造成的持續(xù)性感染疾病有著重要的實(shí)踐及理論意義，且該敏感位點(diǎn)是否適用于對(duì)其他致病菌的殺滅是值得更深一步探究的地方。