傅傳杰，全浩龍，楊 敏，黃建忠

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350108)

煙酰胺單核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，NMN)是一種自然存在的生物核苷酸，分子式：C11H15N2O8P，分子量：334.2，分為α和β兩種結(jié)構(gòu)形式。其中β-NMN(NMN)是煙酰胺單核苷酸的活性形式，天然存在于人體及果蔬肉類當(dāng)中，參與多種生理生化反應(yīng)[1-4]，有助于恢復(fù)母豬等畜牧哺乳動(dòng)物的卵巢活力、改善卵母細(xì)胞功能[5-7]，在肺炎、潰瘍性結(jié)腸炎、調(diào)節(jié)腸道菌群[8-11]等疾病的治療中作用顯著。我國是畜牧養(yǎng)殖大國，隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)集約化程度越來越高，國家對(duì)動(dòng)物疫病防控越來越重視。2020年7月國家頒布的“禁抗令”無疑是對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的一大挑戰(zhàn)，會(huì)增加畜禽的發(fā)病率以及養(yǎng)殖和醫(yī)療成本，預(yù)防和治療用藥的需求也日益增多[12]，獸藥市場總體呈上升趨勢，預(yù)計(jì)2022年全球獸藥市場規(guī)模將達(dá)5 372億元[13]。因此NMN有極大的潛力作為飼料添加劑應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)[14]，有助于畜牧產(chǎn)品的食品安全建設(shè)。

當(dāng)前NMN的合成主要分為化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法以及生物酶法?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)過程中使用大量有機(jī)溶劑，產(chǎn)物中含有無活性α-NMN，純化難且環(huán)境污染嚴(yán)重[15-16]，因此該方法已逐漸被淘汰。微生物發(fā)酵法是在細(xì)胞內(nèi)煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nampt)的作用下，將自身生長積累合成的磷酸核糖焦磷酸(PRPP)與培養(yǎng)基外加的煙酰胺(NAM)催化生成NMN。Huang等[17]通過在大腸桿菌中異源表達(dá)弧菌噬菌體KVP40(VpNadV)的煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nampt)，以煙酰胺為底物發(fā)酵25 h后NMN產(chǎn)量達(dá)到16.2 g·L-1，為目前報(bào)道的最高產(chǎn)量。發(fā)酵法解決了化學(xué)合成法中NMN手性問題，但存在發(fā)酵液組分復(fù)雜，分離純化困難、成本高的問題[18-19]。生物酶法轉(zhuǎn)化既有效解決化學(xué)合成法同分異構(gòu)體以及存在致癌物殘留風(fēng)險(xiǎn)的缺點(diǎn)，也能解決微生物發(fā)酵法周期長、純化難和成本高的問題，但生物酶轉(zhuǎn)化過程中需要等摩爾比ATP提供磷酸，成本高，且反應(yīng)過程中有大量副產(chǎn)物ADP/AMP生成，不利于后期純化。因此在多種NRK中篩選表達(dá)出一個(gè)性能穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率高的的酶[20-21]，同時(shí)降低ATP用量，簡化純化工藝至關(guān)重要。為滿足未來NMN在藥物制備中的應(yīng)用，本試驗(yàn)通過對(duì)4株不同來源的NRK菌株進(jìn)行篩選，同時(shí)在酶轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中引入PPK酶構(gòu)建ATP循環(huán)系統(tǒng)，以期提高底物的轉(zhuǎn)化效率，降低ATP的用量以及減少副產(chǎn)物的生成，利于降低生產(chǎn)成本和純化難度。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1菌株和質(zhì)粒 本試驗(yàn)中用到的表達(dá)宿主EscherichiacoliBW25113、表達(dá)載體pBAD，均保藏于福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心。

1.1.2酶和試劑 高保真PCR酶購自南京諾維贊生物科技有限公司；Gibson酶購自NEB(北京)有限公司；瓊脂糖、凝膠DNA回收試劑盒均購自上海捷瑞生物工程有限公司；鏈霉素購自生工生物工程(上海)股份有限公司；酵母提取物和胰蛋白胨，英國Oxoid公司。所有試劑均為分析純。

1.1.3培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(液體)：酵母浸提粉5 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1，固體培養(yǎng)基另外添加20 g·L-1的瓊脂糖。

ZY培養(yǎng)基(液體)：酵母浸提粉5 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、50×M 20 mL·L-1、50×5052 20 mL·L-1、1 moL·L-1硫酸鎂2 mL·L-1、1000×微量元素2 mL·L-1、1000×鏈霉素1 mL·L-1、20%阿拉伯糖10 mL·L-1。50×5052：25%甘油、2.50%葡萄糖。50×M：1.25 moL·L-1磷酸二氫鈉、1.25 moL·L-1磷酸二氫鉀、2.5 moL·L-1氯化銨、0.25 moL·L-1硫酸鈉。1000×微量元素：50 mmol·L-1氯化高鐵、20 mmol·L-1氯化鈣、10 mmol·L-1氯化錳、10 mmol·L-1硫酸鋅、20 mmol·L-1氯化鈷、2 mmol·L-1氯化銅、2 mmol·L-1氯化鎳、2 mmol·L-1鉬酸鈉、2 mmol·L-1硼酸。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1重組菌的構(gòu)建 將NCBI數(shù)據(jù)庫中篩選出的4個(gè)Nrk基因和2個(gè)Ppk基因，分別命名為NRK-Kk、NRK-Ec、NRK-Gs、NRK-Hi、PPK-Bb、PPK-Cb，送由生工生物工程(上海)有限公司合成。通過Gibson酶將合成的目的基因與質(zhì)粒連接構(gòu)建6個(gè)重組質(zhì)粒，通過CaCl2法轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BW25113感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組大腸桿菌pBAD-NRK-Kk/BW、pBAD-NRK-Ec/BW、pBAD-NRK-Hi/BW、pBAD-NRK-Gs/BW、pBAD-PPK-Bb/BW、pBAD-PPK-Cb/BW(簡稱NRK-Kk/BW、NRK-Ec/BW、NRK-Hi/BW、NRK-Gs/BW、PPK-Bb/BW、PPK-Cb/BW)。將重組菌株于37℃含鏈霉素(50 μg·L-1)抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h，再涂布于含鏈霉素的平板中培養(yǎng)12 h。經(jīng)菌落PCR鑒定后篩選陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)至含鏈霉素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行6～8 h的培養(yǎng)，將菌液送往尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，驗(yàn)證重組菌株是否發(fā)生移碼突變。

1.2.2重組菌的培養(yǎng)與誘導(dǎo) 將-80℃的重組菌轉(zhuǎn)接至含鏈霉素的平板劃線活化，挑取單菌落接入含有鏈霉素的10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床220 r·min-1過夜培養(yǎng)后按5%接種量接種至100 mL的ZYM自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在30℃恒溫?fù)u床中220 r·min-1誘導(dǎo)18 h。取出菌液8 000 r·min-1離心10 min，棄上清收取菌體。

1.2.3NRK工程菌篩選 取1.2.2的誘導(dǎo)表達(dá)的菌液用Tris-HCl(pH 7.0、50 mmol·L-1)重懸菌體沉淀，冰浴超聲破碎獲得破碎菌液，即為粗酶液，進(jìn)行SDS-PAGE分析及轉(zhuǎn)化能力測定。催化反應(yīng)體系(20 mL)為：50 mmol·L-1NR、50 mmol·L-1ATP、NRK(OD600nm=10)；反應(yīng)條件：37℃、pH 7.0、150 r·min-1恒溫?cái)嚢柁D(zhuǎn)化1 h。樣品沸水浴1 min終止反應(yīng)后8 000 r·min-1離心2 min取上清，稀釋50倍后檢測。使用HPLC法檢測NMN生成量，采用C18柱(Agilent 5μm，4.6 mm×250 mm)，流速為1 mL·min-1，檢測波長370 nm，柱溫35℃。流動(dòng)相為磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀各10 mmol·L-1。根據(jù)在單位時(shí)間內(nèi)，NMN催化生成量進(jìn)行菌株篩選。

1.2.4NRK工程菌轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化 在NRK重組菌在pH7.0條件下，對(duì)溫度梯度為31、33、35、37、39℃的轉(zhuǎn)化體系測定轉(zhuǎn)化率，分析確定工程菌催化反應(yīng)的最適溫度。在最適溫度條件下，對(duì)pH梯度為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的轉(zhuǎn)化體系測定轉(zhuǎn)化率，分析確定工程菌催化反應(yīng)的最適pH，檢測方法及體系同方法1.2.3。

1.2.5PPK工程菌篩選 對(duì)PPK工程菌同出發(fā)NRK工程菌復(fù)配進(jìn)行篩選，反應(yīng)體系(20 mL)為：50 mmol·L-1NR、10 mmol·L-1ATP、10 mmol·L-1六偏磷酸鈉、NRK(OD600nm=10)、PPK (OD600nm=10)，反應(yīng)條件：37℃、pH 5.5、150 r·min-1恒溫?cái)嚢柁D(zhuǎn)化1 h。檢測方法同方法1.2.2。

1.2.6雙酶法轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化 對(duì)工程菌復(fù)配體系進(jìn)行析因設(shè)計(jì)，反應(yīng)體系(20 mL)如下：50～100 mmol·L-1NR、5～20 mmol·L-1ATP、10 mmol·L-1六偏磷酸鈉、NRK濃度(OD600nm:5～20)、PPK濃度(OD600nm:5～20)，反應(yīng)條件：37℃、pH 5.5、150 r·min-1恒溫?cái)嚢柁D(zhuǎn)化1 h。檢測方法同方法1.2.2。

1.2.7發(fā)酵罐培養(yǎng)及全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)NMN 依據(jù)優(yōu)化的結(jié)果，按照方法1.2.1構(gòu)建了1株NRK-Gs & PPK-Cb/BW工程菌，將重組菌按照1.2.3方法活化后轉(zhuǎn)接至100 mL液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6～8 h后接種至裝無機(jī)鹽培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，待菌體濃度OD600nm達(dá)到40～50時(shí)，添加終濃度為2 g·L-1阿拉伯糖，28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10～12 h，發(fā)酵液用8 000 r·min-1離心15 min，棄上清，收集菌體,進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 NRK工程菌的表達(dá)與篩選

由圖1可知，對(duì)4種重組菌經(jīng)SDS-PAGE凝膠分析，NRK-Kk/BW、NRK-Hi/BW和NRK-Gs/BW表達(dá)的蛋白量在25～35 kDa，NRK-Ec/BW表達(dá)的蛋白量在40～50 kDa，表明4種Nrk基因均在大腸桿菌BW25113中成功表達(dá)。對(duì)4種NRK工程菌株進(jìn)行驗(yàn)證篩選，在50 mmol·L-1NR和50 mmoL·L-1ATP的反應(yīng)體系中以37℃、pH 7.0、150 r·min-1恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 h，檢測NMN生成量進(jìn)行比對(duì)篩選。由圖2可知，NRK-Gs/BW催化產(chǎn)生的NMN含量及轉(zhuǎn)化率是4個(gè)工程菌株當(dāng)中最高的，1 h催化生成NMN 28.12 mmol·L-1,轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到56.24%，與其他菌株最高相差38%以上。因此初步選擇NRK-Gs/BW作為出發(fā)工程菌。

圖1 SDS-PAGE分析重組大腸桿菌NRK的表達(dá)Fig.1 NRK expression of the recombinant Escherichia coli by SDS-PAGE analysis

2.2 NRK工程菌株反應(yīng)條件優(yōu)化

為提高出發(fā)菌株的轉(zhuǎn)化率，對(duì)反應(yīng)溫度和pH進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果(圖3)表明，4種工程菌的最適反應(yīng)溫度均在35～39℃；NRK-Kk/BW、NRK-Hi/BW、NRK-Ec/BW最適pH為7.0，NRK-Gs/BW最適pH為4.5～5.5，為嗜酸性酶。在NRK-Gs/BW體系中，NR轉(zhuǎn)化率最高時(shí)為86%。

圖2 NRK工程菌轉(zhuǎn)化能力測定Fig.2 Determination of the transformation ability of NRK engineering bacteria

圖3 溫度及pH對(duì)不同NRK催化轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of temperature and pH on the catalytic conversion of different NRK

2.3 PPK工程菌株表達(dá)與篩選

由圖4可知，對(duì)2株重組菌經(jīng)SDS-PAGE凝膠分析，PPK-Bb/BW和PPK-Cb/BW條帶都在25～35 kDa，與預(yù)測值相符合。由圖5可知，NRK-Gs/BW與PPK-Bb/BW(圖5 A1)搭配的催化反應(yīng)最高轉(zhuǎn)化率為76.6%，副產(chǎn)物(ADP+AMP)的量為6.6 mmol·L-1，NRK-Gs/BW與PPK-Cb/BW(圖5 B1)搭配時(shí)，最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到89.8%，副產(chǎn)物的量為5.22 mmol·L-1。因此，PPK-Cb/BW與PPK-Bb/BW相比，轉(zhuǎn)化率更高且副產(chǎn)物更少，選用PPK-Cb/BW同NRK-Gs/BW進(jìn)行雙酶催化反應(yīng)。

2.4 催化體系析因結(jié)果分析

利用JMP軟件對(duì)4個(gè)影響雙酶催化結(jié)果的因素進(jìn)行析因設(shè)計(jì)，對(duì)雙酶催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率等數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合處理，見圖6。根據(jù)JMP結(jié)果推斷，反應(yīng)體系為：50 mmol·L-1NR、10 mmol·L-1ATP、35 mmol·L-1Mg2+、NRK(OD600nm=15)、PPK(OD600nm=15)時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。

圖4 SDS-PAGE分析重組大腸桿菌PPK的表達(dá)Fig.4 PPK expression of the recombinant Escherichia coli by SDS-PAGE analysis

圖5 PPK工程菌株的篩選Fig.5 Screening of the PPK engineering strain

2.5 雙酶工程菌驗(yàn)證

由圖7可知，在50 mmol·L-1NR、10 mmol·L-1ATP、35 mmol·L-1Mg2+、NRK-Gs & PPK-Cb/BW(OD600nm=15)反應(yīng)體系中，pH=5.5，反應(yīng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)化3 h，NR轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)99.96%，NMN產(chǎn)量為49.98 mmol·L-1。同時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物中AMP僅0.42 mmol·L-1，有利于后期NMN產(chǎn)物純化。

圖6 雙酶催化反應(yīng)體系響應(yīng)面設(shè)計(jì)Fig.6 Response surface design of the dual-enzyme catalytic system

圖7 雙酶工程菌優(yōu)化體系驗(yàn)證Fig.7 Verification of the optimization system of dual-enzyme engineering bacteria

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)通過基因工程成功構(gòu)建重組NRK-Kk/BW、NRK-Ec/BW、NRK-Gs/BW、NRK-Hi/BW 4株菌株，通過條件優(yōu)化篩選出1株嗜酸性的高效轉(zhuǎn)化NR生成NMN的菌株NRK-Gs/BW。在體系中引入多聚磷酸激酶重組菌PPK-Cb/BW后，ATP使用量降低為初始的20%。通過軟件對(duì)析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果分析得出，雙酶法最優(yōu)的反應(yīng)體系為：50 mmol·L-1NR、10 mmol·L-1ATP、35 mmol·L-1Mg2+。最后，構(gòu)建了雙酶工程菌NRK-Gs&PPK-Cb/BW進(jìn)行高密度發(fā)酵和轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，結(jié)果顯示NR轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到99.96%。本試驗(yàn)構(gòu)建的雙酶工程菌催化NR合成NMN,和單酶法相比ATP的使用降低80%，相較于現(xiàn)有的雙酶法轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)到99.96%，能有效提高底物利用率。同時(shí)篩選的NRK和PPK均為嗜酸性酶，能有效地減少NMN的降解以及提高穩(wěn)定性，有利于后期純化工作。但仍存在一些問題需要解決，如在保證轉(zhuǎn)化率的同時(shí)提高底物濃度和產(chǎn)量，這將有助于NMN工業(yè)化生產(chǎn)的放大。