尹春月 黃志廣 何融泉 陳罡 龍禹

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 廣西南寧 530021）

胎盤植入性疾病是指滋養(yǎng)層細胞不同程度地侵襲子宮肌層。PAS 患者往往面臨剖宮產(chǎn)術中或術后大出血，從而導致孕產(chǎn)婦凝血功能障礙甚至死亡。故PAS 患者不僅需輸注大量血液制品，還增加切除子宮的風險[1]。

妊娠期免疫耐受有助于促進人類妊娠成功[2]，而CD200-CD200R1 信號通路具有強大的免疫抑制功能[3]。我們推測CD200R1 在促進PAS 的形成中起著免疫系統(tǒng)失調(diào)、EVT 過度侵襲的作用。在此，我們充分利用計算生物學方法的優(yōu)勢以協(xié)助PAS 研究，通過收集PAS 及相應的對照組織樣本，并利用信使核糖核酸測序技術，比較PAS 組與非PAS 組之間的CD200R1 表達模式。然后，我們整合全球范圍內(nèi)所有PAS 測序數(shù)據(jù)，對CD200R1 在PAS 中的表達進行綜合評估。我們通過對PAS 中CD200R1 共表達基因的富集分析，進一步研究CD200R1 在PAS 中的潛在作用和機制。

1 材料和方法

1.1 本課題組mRNA- seq

1.1.1 研究對象。本院倫理委員會（2015KY-E-042）同意本研究實施，并獲得全部參與者的知情同意書。本研究納入2016年1 月1 日至2017 年9 月30 日在本院住院分娩的PAS 患者，選取因疤痕子宮而行剖宮產(chǎn)分娩的患者為對照組。最終，收集到3 例穿透型胎盤植入（PAS 組）患者和5 例對照組的胎盤標本。無肌層和漿膜層的PAS 胎盤標本從胎盤侵襲最深的部位取得，而對照組胎盤標本從胎盤的母體表面獲取。所有胎盤標本的mRNA-seq 采用雙端測序，在BGISEQ-500 測序平臺上讀取100 堿基對（bp）的成對讀段（reads），每個胎盤樣本獲得存放read1和read2 的2 份fastq 測序文件，由華大基因（BGI）完成。

1.1.2mRNA-seq 數(shù)據(jù)分析。利用FastQC 軟件對本課題組的mRNA-seq 進行質(zhì)量控制，通過STAR 軟件將測序文件與人類參考基因GRCh38 進行比對獲得表達矩陣，并對表達矩陣進行l(wèi)og2X 轉(zhuǎn)換。差異表達基因分析由R 語言limma 包完成。ggplot2和pROC 包對CD200R1 mRNA 表達數(shù)據(jù)繪制箱式圖和受試者工作特征（ROC）曲線。

1.2 公共數(shù)據(jù)庫的PAS 測序數(shù)據(jù)

從序列片段歸檔數(shù)據(jù)庫（SRA）、基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）、生物項目數(shù)據(jù)庫（BioProject）和ArrayExpress 公共數(shù)據(jù)庫中下載全部人類PAS 的CD200R1 mRNA 表達數(shù)據(jù)。篩選后納入兩個PAS測序數(shù)據(jù)（GSE136048、PRJNA627183），見表1。

表1 納入的公共數(shù)據(jù)集的特征

1.3CD200R1 在PAS 中潛在的分子機制

在3 個測序數(shù)據(jù)中獲取|皮爾遜相關系數(shù)|＞0.30 和P＜0.05 的CD200R1 共表達基因。正相關基因被認為是本課題組mRNA-seq 高表達基因中的CD200R1 正相關基因；而負相關基因被認為是本課題組mRNA-seq 低表達基因中CD200R1 負相關基因。clusterProfiler 包用于完成功能（GO）和通路（KEGG）富集分析。Cytoscape 軟件構建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡（PPI），并利用cytoHubba 算法獲取degree排名前5 的樞紐（hub）基因。

1.4 統(tǒng)計與分析

Stata14.0 軟件對整合后的CD200R1 mRNA 數(shù)據(jù)進行標準化均數(shù)差（SMD）和95%置信區(qū)間（CI）分析、Egger's 檢驗和敏感性分析。PAS 患者與對照組之間CD200R1 表達差異顯著性由Student’s t 檢驗進行，P＜0.05 被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 本課題組mRNA- seq 的差異表達分析

滿足Fold Change＞1.2 或＜-0.8 且P＜0.05 的基因被選為PAS 中的差異表達基因，火山圖（圖1A）用來可視化差異分析的結(jié)果。CD200R1 在PAS組比對照組明顯增高見圖1B（P=0.0276），CD200R1對PAS 組和對照組有較好的區(qū)分能力（ROC 曲線下面積AUC=1.00，圖1C）。

圖1基因的火山圖（A）CD200R1 的表達（B）ROC 曲線（C）

2.2CD200R1 在PAS 中的綜合表達

我們通過充分整合3 個數(shù)據(jù)集，包括1 個微陣列（GSE136048） 和2 個RNA-seq 數(shù) 據(jù)（PRJNA627183 和本課題組mRNA-seq 數(shù)據(jù)），進一步檢測CD200R1 在PAS 中的綜合表達，共14 例PAS樣本和13 例非PAS 樣本。與非PAS 組相比，PAS 組的CD200R1 表達明顯升高（SMD=0.861，95%CI=0.003-1.719，圖2A）?；贓gger’s 檢驗的漏斗圖顯示各數(shù)據(jù)集之間無異質(zhì)性（P= 0.154，圖2B）。敏感性分析提示合并的SMD 結(jié)果穩(wěn)定（圖2C）。

圖2 分別展示了森林圖（A） Egger’s 檢驗（B） 敏感性分析（C）

2.3CD200R1 共表達差異基因的富集分析

經(jīng)過取交集后，獲得CD200R1 正相關基因382個，CD200R1 負相關基因390 個。負相關基因參與細胞-基板連接組件、細胞-底物連接、細胞黏附分子結(jié)合（cell-substrate junction assembly、cell-substrate junction、cell adhesion molecule binding）等功能（圖3A），正相關基因涉及血小板激活、早期核內(nèi)體、IgG 結(jié) 合（platelet activation、early endosome、IgG binding）等通路（圖3C）。負相關基因參與精氨酸和脯氨酸代謝，脂肪酸延長（arginine and proline metabolism、fatty acid elongation）等功能（圖3B），正相關基因涉及精氨酸和脯氨酸代謝、脂肪酸降解（arginine and proH2BC5（圖4A），在本課題組mRNA 測序數(shù)據(jù)中均低表達見圖4B（P＜0.05）。正相關基 因PPI 中 的hub 基 因 為：TLR4、CD86、PLEK、FCGR1A、FCGR2A（圖4C），在本課題組mRNA 測序數(shù)據(jù)中均高表達見圖4D（P＜0.05）。

圖3 CD200R1 共表達基因GO 及KEGG 富集

圖4 CD200R1 共表達基因PPI 及hub 基因的表達

3 討論

分析表明，CD200R1 可能通過細胞- 基板連接組件、血小板激活、精氨酸和脯氨酸代謝有助于PAS 的發(fā)生發(fā)展。這些研究結(jié)果表明CD200R1 是PAS 的關鍵基因。本研究通過整合所有PAS 測序數(shù)據(jù)，增加了樣本量，提高結(jié)果的準確性。同時作為一項多中心研究，我們首次揭示了CD200R1 在PAS 中的高水平表達。

子癇前期（PE）、流產(chǎn)和早產(chǎn)被認為是滋養(yǎng)細胞侵襲能力不足的疾病[4]，與PAS 中滋養(yǎng)細胞過度侵襲不同。因此，我們可以將PAS 與PE、早產(chǎn)、流產(chǎn)聯(lián)系起來，以更好地理解CD200R1 在PAS 中發(fā)揮的作用，從而進一步證明CD200R1 在PAS 致病中存在重要意義。我們推測CD200R1 的上調(diào)可能通過細胞-基板連接組件、血小板激活、精氨酸和脯氨酸代謝通路等途徑促進滋養(yǎng)細胞的遷移和侵襲，誘導血管生成，進而促進PAS 的發(fā)生發(fā)展。CD200R1 共表達基因中hub 基因?qū)︻A測PAS 的發(fā)病機制同樣重要。FN1 對滋養(yǎng)層侵襲、細胞黏附、生長、遷移和分化中發(fā)揮關鍵作用，與子宮平滑肌瘤及子癇前期發(fā)生發(fā)展有關[5]。同時，異常表達的TLR4 與免疫系統(tǒng)異常反應、滋養(yǎng)細胞浸潤不足和螺旋動脈重構有關。以上提示hub 基因參與滋養(yǎng)層侵襲、細胞黏附、免疫反應等過程，進一步提示CD200R1 同樣有類似的功能，從而促進PAS 的發(fā)生。

本研究的關鍵優(yōu)勢在于首次利用計算生物學方法整合PAS 在全球范圍內(nèi)的表達數(shù)據(jù)，驗證CD200R1在PAS 中的高表達，并進一步探索CD200R1 在PAS中的潛在機制。我們未來的目標是通過體外和體內(nèi)實驗證實CD200R1 在PAS 中的作用。