鄒 濤 陳宇迪 莫單丹 趙 瑾 和莉穎 郭 姝 歐春麗 曾智強(qiáng) 繆劍華*

(1.北京市理化分析測(cè)試中心，北京 100089；2. 廣西藥用植物園，廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530023；3. 耐馳科學(xué)儀器商貿(mào)(上海)有限公司，上海 200131)

魚(yú)腥草屬三白草科蕺菜，是多年生草本植物蕺菜的帶根全草，性寒味辛，入肺、肝經(jīng)，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋、止血鎮(zhèn)痛、祛淤生新、增強(qiáng)免疫等功能[1，2]。在北方一些地區(qū)魚(yú)腥草主要作為中藥使用，在長(zhǎng)江以南地區(qū)魚(yú)腥草還可作為野生蔬菜。魚(yú)腥草已經(jīng)被國(guó)家衛(wèi)生部正式確定為“既是藥品，又是食品”的極具開(kāi)發(fā)潛力的植物資源之一[3]。魚(yú)腥草廣泛種植于我國(guó)南方各省，但由于各地日照、土壤等條件的差異，已有大量研究表明不同產(chǎn)地魚(yú)腥草的藥效品質(zhì)存在明顯的不同[4-9]。長(zhǎng)期以來(lái)，不同產(chǎn)地中藥材成分和藥性的差異嚴(yán)重制約了中醫(yī)和中藥材的發(fā)展，一般只有道地性藥材才能發(fā)揮出最好的藥效。目前，中藥材的鑒別方法主要有色譜法、光譜法、分子生物學(xué)技術(shù)、指紋圖譜鑒定技術(shù)等[10-14]。通常的鑒別方法均以樣本中某些有效成分為目標(biāo)物，比如測(cè)定魚(yú)腥草中的總黃酮、槲皮苷等物質(zhì)，通過(guò)測(cè)量這些物質(zhì)的含量進(jìn)行鑒別[15，16]。然而這些方法往往預(yù)處理繁瑣，效率低，而且使用大量有機(jī)試劑，成本高，環(huán)保隱患大。更重要的是，魚(yú)腥草某些成分的含量可以作為品質(zhì)檢驗(yàn)的指標(biāo)，但并不足以成為產(chǎn)地鑒別的充分必要條件,因此中藥材的道地性鑒別研究是目前的一個(gè)難點(diǎn)。

差示掃描量熱法(DSC)是一種常見(jiàn)的熱分析方法，具有操作簡(jiǎn)單，不用溶劑，樣品用量少，具有檢測(cè)快速和圖譜簡(jiǎn)單易懂的特點(diǎn)。然而多年來(lái)DSC方法并沒(méi)有被真正應(yīng)用于中藥材產(chǎn)地鑒別，只能通過(guò)DSC曲線的特征峰溫度的位置和形狀定性判斷中藥材的真?zhèn)?，且只能?duì)不同物種進(jìn)行區(qū)分鑒別。究其原因主要有兩點(diǎn)：(1)對(duì)于天然植物樣品，常規(guī)的DSC測(cè)量方法并不能得到有辨識(shí)度、穩(wěn)定重復(fù)的譜圖；(2)通常的DSC譜圖解析往往著眼于譜峰歸屬，熱焓計(jì)算等，而中草藥(例如魚(yú)腥草)的DSC曲線，由于其成分復(fù)雜，其各個(gè)熱效應(yīng)峰為多組分的綜合熱效應(yīng)，很難歸屬到具體的物質(zhì)，常規(guī)譜圖分析方法并不適用，甚至還不如成分測(cè)量簡(jiǎn)單直觀。本研究則從這兩個(gè)方面入手，首先優(yōu)化了DSC測(cè)量方法，采用耐高壓不銹鋼坩堝有效抑制組分揮發(fā)對(duì)測(cè)量譜圖的干擾，探討了其它主要的測(cè)量參數(shù)影響，最終得到穩(wěn)定、辨識(shí)度高的魚(yú)腥草DSC圖譜，通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地魚(yú)腥草樣本的重復(fù)測(cè)試，考察了實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。隨之，本文考察了16個(gè)不同產(chǎn)地的魚(yú)腥草樣本，建立魚(yú)腥草產(chǎn)地DSC圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)圖譜匹配識(shí)別算法，達(dá)到快速有效鑒別魚(yú)腥草產(chǎn)地的目的。

1 材料與儀器

1.1 魚(yú)腥草樣本

由廣西壯族自治區(qū)藥用植物園提供從不同種植地區(qū)采集的魚(yú)腥草整株樣本(16種)，隨機(jī)編號(hào)為1#～16#。上述樣品經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園繆劍華研究員鑒定。

1.2 樣本預(yù)處理

樣本經(jīng)過(guò)60℃恒溫24小時(shí)烘干，粉碎處理(多功能粉碎機(jī))，采用電動(dòng)振篩機(jī)(8411型)篩分成4個(gè)顆粒度的樣本(>60目、60目～110目、110目～170目、<170目)用于測(cè)試。

1.3 DSC儀器

實(shí)驗(yàn)采用DSC 204 F1差示掃描量熱儀；常壓密閉鋁坩堝(耐壓3MPa)和密閉不銹鋼坩堝(耐壓10MPa)；Proteus數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 DSC測(cè)試方法優(yōu)化

2.1.1坩堝類(lèi)型的優(yōu)化

魚(yú)腥草樣品含有多種揮發(fā)物質(zhì)，例如水分、芳香物質(zhì)等，這些物質(zhì)的揮發(fā)過(guò)程是吸熱的。這些吸熱效應(yīng)會(huì)對(duì)其它反應(yīng)(例如某些成分的氧化等)產(chǎn)生干擾甚至掩蓋，常規(guī)的DSC測(cè)量方法(鋁坩堝加蓋，蓋上扎孔)下，各種熱效應(yīng)重疊后就使得譜圖整體上失去了辨識(shí)度，而且會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)不穩(wěn)定。因此我們的首要工作是抑制實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的揮發(fā)現(xiàn)象。本研究采用密閉坩堝實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)。

任取一個(gè)魚(yú)腥草樣本(5#，約20mg，顆粒度為<170目)，分別使用常壓密閉鋁坩堝和耐高壓密閉不銹鋼坩堝進(jìn)行DSC測(cè)試。溫度程序：以5℃/min的升溫速率從60℃升溫至350℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出坩堝發(fā)現(xiàn)常壓密閉鋁坩堝都存在鼓包爆開(kāi)漏氣現(xiàn)象具體結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1A為常壓密封鋁坩堝3次平行測(cè)試的結(jié)果，從圖中可以看出：在150℃～240℃間有一個(gè)寬的放熱峰，在250℃～265℃間有一個(gè)尖銳的吸熱峰。無(wú)論從峰的位置還是峰的面積，這3次測(cè)試結(jié)果重現(xiàn)性差，而且隨著溫度升高，魚(yú)腥草易揮發(fā)成分的釋放導(dǎo)致坩堝內(nèi)壓力增大致使坩堝鼓脹爆開(kāi)。為解決這個(gè)問(wèn)題，本研究采用耐高壓的不銹鋼坩堝進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如圖1B所示，從圖中可以看出：3次平行測(cè)試的DSC曲線拓?fù)鋱D形基本一致，峰位置與熱焓值也基本相同。可見(jiàn)使用耐高壓坩堝抑制揮發(fā)反應(yīng)有效，測(cè)試重復(fù)性好，合理可行。

圖1 常壓密閉鋁坩堝3次平行測(cè)試

2.1.2升溫速率的優(yōu)化

分別稱(chēng)取編號(hào)為5#，目數(shù)<170目的魚(yú)腥草樣本約20mg，裝入4只不銹鋼坩堝內(nèi)，分別以2℃/min、5℃/min、10℃/min和20℃/min升溫速率從60℃升溫至350℃，考察不同升溫速率對(duì)DSC結(jié)果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 魚(yú)腥草不同升溫速率的DSC曲線圖

結(jié)果顯示，隨著升溫速率的提升，兩個(gè)放熱峰的位置均向高溫段移動(dòng)，這是由于升溫速率變快導(dǎo)致的滯后現(xiàn)象，升溫速率越快這種滯后現(xiàn)象就越加明顯。同時(shí)隨著升溫速率的加快，峰拖尾和重合疊加的效應(yīng)越明顯，會(huì)導(dǎo)致DSC圖譜失去很多信息。另外一方面，升溫速率過(guò)低時(shí)，靈敏度降低，DSC峰不明顯，測(cè)試耗時(shí)長(zhǎng)。因此，綜合考慮效率和譜圖信息的情況下，實(shí)驗(yàn)選擇5℃/min的升溫速率。

2.1.3樣本顆粒度的優(yōu)化

同樣以5#魚(yú)腥草樣本為例，稱(chēng)取顆粒度分別為<170目、110目～170目、60目～110目之間和>60目的樣品20mg，以5℃/min升溫速率升溫至350℃，考察不同顆粒度對(duì)DSC結(jié)果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同顆粒度的5#魚(yú)腥草樣本的DSC曲線圖

從圖中可以看出，隨著顆粒度變大，兩個(gè)放熱峰的位置均出現(xiàn)了滯后的情況，第1個(gè)放熱峰更加明顯一點(diǎn)，<170目的樣本第一個(gè)放熱峰峰值溫度為142.7℃，>60目的為151.5℃，滯后約9℃，這可能是由于顆粒越大越不利于傳熱與反應(yīng)。同時(shí)組成第2個(gè)大峰的3個(gè)峰的比例出現(xiàn)變化，205℃左右的第1個(gè)肩峰比例降低到最后幾乎看不出來(lái)，而275℃左右的第3個(gè)肩峰逐漸變得明顯。為保留更多的峰信息，而且較細(xì)的顆粒度使在測(cè)試取樣量較小的情況下更具樣本代表性，因此本實(shí)驗(yàn)最后確定<170目的樣本，稱(chēng)樣量約為20mg，以5℃/min升溫速率升溫至350℃來(lái)考察魚(yú)腥草樣本的DSC曲線。

2.2 DSC測(cè)量方法的驗(yàn)證

按上述方法對(duì)16個(gè)魚(yú)腥草樣本進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試，每個(gè)樣品取4平行。仍以5#魚(yú)腥草的DSC曲線為例，對(duì)得到的DSC曲線的兩個(gè)放熱峰的起始點(diǎn)溫度、峰值溫度及峰面積進(jìn)行了標(biāo)注，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 魚(yú)腥草5#平行實(shí)驗(yàn)間的DSC曲線特征值及重復(fù)性列表

從表1的數(shù)據(jù)可以看到：第1個(gè)放熱峰的峰值溫度在142.8℃左右，焓值約為25.8 J/g。第2個(gè)放熱峰的峰值溫度在226.4℃左右，焓值約為155.4J/g，所有特征溫度的數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.5%，說(shuō)明此方法重復(fù)性良好。

按2.1方法對(duì)16個(gè)樣品分別進(jìn)行測(cè)試，其DSC曲線如圖4所示。從圖上可以明顯看出不同產(chǎn)地魚(yú)腥草的DSC曲線及其特征峰都有差異，有的差異明顯，有的差異較小，這些差異反映了不同產(chǎn)地魚(yú)腥草在化學(xué)成分和理化性質(zhì)上存在差異，而本研究改進(jìn)的DSC測(cè)量方法能夠清晰地展示這些差異，說(shuō)明此方法特異性良好。

圖4 16個(gè)魚(yú)腥草樣本的DSC曲線

由于樣品的“微環(huán)境”(密閉坩堝內(nèi))是空氣氣氛，這些放熱峰對(duì)應(yīng)于組分的氧化和熱裂解。雖然放熱反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)理尚待進(jìn)一步研究，但是上述的實(shí)驗(yàn)方法與參數(shù)，可以得到穩(wěn)定可靠的魚(yú)腥草DSC譜圖。

2.3 魚(yú)腥草DSC譜圖相似度計(jì)算與識(shí)別

2.3.1魚(yú)腥草DSC譜圖相似度計(jì)算

優(yōu)化的DSC測(cè)量方法為本研究對(duì)魚(yú)腥草DSC圖譜進(jìn)行“宏觀”比對(duì)建立了基礎(chǔ)。所謂宏觀比對(duì)，指的是不再采用常規(guī)的DSC解析方法，不以具體峰值和峰面積為參數(shù)，而是計(jì)算兩條DSC曲線的相似度，通過(guò)相似度匹配達(dá)到產(chǎn)地鑒別的目標(biāo)。這個(gè)方法類(lèi)似于人臉識(shí)別技術(shù)。

對(duì)于本實(shí)驗(yàn)研究的魚(yú)腥草DSC圖形識(shí)別方法的原理和流程如下：(1)通過(guò)DSC測(cè)試得到DSC曲線圖像；(2)對(duì)測(cè)得的DSC曲線圖像二值化處理；通常可以將DSC曲線定義為一個(gè)像素點(diǎn)的集合，對(duì)于一幅大小為m×n的譜圖圖像s,可將其定義為點(diǎn)集：

s={pi,j}i=1,2,…,m;j=1,2,…,n

(1)

根據(jù)式(1)，點(diǎn)集s滿足下述條件：i的取值范圍為整數(shù)1～m，j的取值范圍為整數(shù)1～n，且i，j的取值涵蓋了其各自取值范圍內(nèi)的所有可能組合；同時(shí)像素點(diǎn)pi,j在曲線中對(duì)應(yīng)的位置為(x,y),x的取值范圍為溫度范圍60℃～350℃，y的取值范圍為熱流信號(hào)強(qiáng)度范圍；(3)獲取圖像識(shí)別所需的特征點(diǎn)，如峰起始溫度點(diǎn)，峰值溫度點(diǎn)，焓值面積等特征信息，將所得的信息保存成數(shù)據(jù)庫(kù)；(4)對(duì)新測(cè)試的DSC曲線與數(shù)據(jù)庫(kù)中的曲線逐一匹配，計(jì)算相似度，輸出識(shí)別結(jié)果。

依然以5#樣本為例，如表2所示，研究發(fā)現(xiàn)平行測(cè)試曲線之間的相似度均超過(guò)99%，這說(shuō)明該方法是合理的。其余樣品通過(guò)類(lèi)似處理，同一產(chǎn)地魚(yú)腥草樣品平行測(cè)試的DSC曲線間的相似度也均超過(guò)99%，說(shuō)明該方法重復(fù)性好可靠性高。

表2 魚(yú)腥草5#平行實(shí)驗(yàn)間的DSC曲線特征值及圖形識(shí)別相似度列表

2.3.2魚(yú)腥草DSC譜圖相似度識(shí)別

如上所述，可以事先采集不同產(chǎn)地魚(yú)腥草樣本建立DSC曲線數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)未知樣品的DSC曲線進(jìn)行相似度匹配，從而實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)地魚(yú)腥草的快速分類(lèi)鑒別。本研究將16種魚(yú)腥草樣本的DSC圖譜建立數(shù)據(jù)庫(kù)，然后在這16種樣本中分別重新取樣，按照2.1方法測(cè)試，將測(cè)得的DSC譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行逐一匹配識(shí)別，最終的識(shí)別驗(yàn)證結(jié)果如表3所示。

表3 16個(gè)魚(yú)腥草樣本的相似度識(shí)別列表

表3數(shù)據(jù)結(jié)合圖4可見(jiàn)，對(duì)于DSC圖譜比較接近的樣本，本研究算法可以得到較高的相似度，反之則計(jì)算得到較低的相似度。而且對(duì)于本類(lèi)樣本，相似度數(shù)值均達(dá)到99%以上,識(shí)別準(zhǔn)確率達(dá)到100%，說(shuō)明本研究采用的相似度算法穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

本研究首次將DSC圖譜相似度識(shí)別匹配技術(shù)應(yīng)用到魚(yú)腥草產(chǎn)地的鑒別研究中，結(jié)果表明該方法識(shí)別度好，準(zhǔn)確率高，操作簡(jiǎn)單方便，能夠?qū)崿F(xiàn)魚(yú)腥草樣品產(chǎn)地的高效、準(zhǔn)確鑒別，為DSC法用于中藥材產(chǎn)地鑒別提供了定量化基礎(chǔ)，也為魚(yú)腥草及其他中藥材的道地性鑒別研究和質(zhì)量控制提供了新的研究方法和思路。此外，中藥材的藥效一般與藥材的土壤、環(huán)境、氣候水文條件等息息相關(guān)，通過(guò)不同產(chǎn)地魚(yú)腥草的藥性、環(huán)境條件與DSC圖譜特征的相關(guān)性研究，也可能為道地性藥材基地的選址建立提供科學(xué)的參考依據(jù)，這也將是我們需要深入研究的一個(gè)方向。