黃學(xué)蘭 王妍柏 王銀鋒 李想

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 1.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；2.神經(jīng)內(nèi)科腦脊液檢測室，寧夏 銀川 750004)

乙型肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的傳播性疾病，由病原體乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起[1]。相關(guān)研究報(bào)道，盡管HBV疫苗計(jì)劃降低了HBV感染的新發(fā)病率，但全世界仍有2.4億人攜帶HBV[2]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)患者體內(nèi)HBV復(fù)制會(huì)激活機(jī)體的免疫病理反應(yīng)，并誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化、增殖，導(dǎo)致CHB繼發(fā)肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌等疾病，嚴(yán)重危及全球人類健康[3-4]。抑制HBV復(fù)制、表達(dá)的抗病毒治療是改善CHB的重要手段[5]。近年來發(fā)現(xiàn)，小RNA分子miRNA可在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮調(diào)控作用，參與機(jī)體的多種生理、病理機(jī)制，在HBV感染中的作用逐漸引起人們重視[6]。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-583在CHB不同中醫(yī)癥候患者體內(nèi)差異表達(dá)。RNA解螺旋酶DDX5(DEAD box helicase5)是DEAD蛋白家族成員，參與RNA的合成、剪接及轉(zhuǎn)運(yùn)，在多種腫瘤中高表達(dá)，在HBV復(fù)制期間被下調(diào)[8-9]。TargetScanHuman網(wǎng)站顯示，miR-583、DDX5存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，但靶向調(diào)控關(guān)系尚未確認(rèn)。本研究旨在探討miR-583靶向調(diào)控DDX5表達(dá)對HBV復(fù)制、表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人肝癌細(xì)胞HepG2、人穩(wěn)轉(zhuǎn)HBV病毒的肝癌細(xì)胞HepG2.2.15(貨號：YS-0075X、YS-2193X)購自美國sciencell；DMEM培養(yǎng)基(貨號：PM150210)購自武漢益普生物科技有限公司；TRIzol試劑(貨號：abs60154)購自愛必信(上海)生物科技有限公司；miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號：AOMD-Q050)購自美國GeneCopoeia；SYBR qPCR試劑盒(貨號：BK2200-2203)購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑(貨號：L3000015)購自美國Invitrogen；人乙型肝炎病毒s抗原(Hepatitis B s antigen，HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(Hepatitis B e antigen，HBeAg)酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號：CSB-E10089h-1、CSB-E13557h-1)購自上海恒斐生物科技有限公司；HBV DNA檢測試劑盒(貨號：1529377106)購自上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(貨號：11402HZ60)購自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱(型號：MIR-262-PC)購自日本松下公司；酶標(biāo)儀(型號：SPECTR AmaxM2e)購自美國Molecular Devices公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀(Rotor-Gene?Q)購自美國QIAGEN公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)于加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放在溫度為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%時(shí)，用胰酶適度消化、傳代3次，取對數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 qPCR法檢測 HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞中miR-583、DDX5 mRNA表達(dá)，將HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞密度為1.0×105個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h。TRIzol法提取HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞中總RNA，紫外分光計(jì)、甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳測定RNA濃度、純度及完整性，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA后，按照qPCR試劑盒說明書進(jìn)行qPCR反應(yīng)，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-583、DDX5 mRNA表達(dá)水平。miR-583及其內(nèi)參U6引物、DDX5及其內(nèi)參GAPDH引物為上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司合成的特異性引物。miR-583反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火延伸30 s，共循環(huán)40次；DDX5反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共循環(huán)40次。

1.3.3 HepG2.2.15細(xì)胞分組 將HepG2.2.15細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞密度為1.0×105個(gè)/孔，培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)到80%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。設(shè)置空白對照組、NC-siRNA組、miR-583 siRNA組。NC-siRNA組、miR-583 siRNA組使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染NC-siRNA和miR-583 siRNA，轉(zhuǎn)染步驟按照LipofectamineTM3000說明書進(jìn)行。

1.3.4 qPCR法檢測各組HepG2.2.15細(xì)胞中miR-583、DDX5 mRNA表達(dá) HepG2.2.15細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，按照1.3.2中的檢測步驟，qPCR法檢測各組HepG2.2.15細(xì)胞中miR-583、DDX5 mRNA表達(dá)水平，2-ΔΔCt法表示。

1.3.5 qPCR法檢測各組HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBV DNA水平 HepG2.2.15細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照1.3.2中的檢測步驟，使用HBV DNA檢測試劑盒進(jìn)行qPCR。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，共循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后使用RG6000軟件分析計(jì)算HBV DNA拷貝數(shù)。

1.3.6 ELISA檢測各組HepG2.2.15細(xì)胞上清液HBsAg和HBeAg表達(dá)水平 HepG2.2.15細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照HBsAg、HBeAg測定試劑盒說明書上的步驟進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上讀取吸光度(optical density，OD)值，波長設(shè)定為450 nm，配置相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)液并測定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算HBsAg、HBeAg表達(dá)水平。

1.3.7 雙熒光素酶法驗(yàn)證miR-583與DDX5的靶向關(guān)系 使用miRTarBase網(wǎng)站分析miR-583與DDX5的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建DDX5的3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體(野生型DDX5-WT和突變型DDX5-MUT)。以HepG2.2.15細(xì)胞基因組為模板，PCR擴(kuò)增miR-583序列，采用EcoR I和BamH I雙酶切miR-583序列和pmiR-mCherry質(zhì)粒，16℃過夜構(gòu)建miR-583重組質(zhì)粒，將miR-583重組質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR及測序驗(yàn)證，然后提取重組質(zhì)粒。使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑將DDX5-WT、DDX5-MUT分別與pmiR-mCherry質(zhì)粒和miR-583重組質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)入HepG2.2.15細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書上的步驟進(jìn)行操作，測定熒光強(qiáng)度，以螢火蟲、海腎熒光素酶活性比值表示熒光素酶相對活性。

2 結(jié)果

2.1 HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞中miR-583、DDX5 mRNA表達(dá) 與HepG2細(xì)胞相比，HepG2.2.15細(xì)胞中miR-583表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，DDX5 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞中miR-583、DDX5 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 各組HepG2.2.15細(xì)胞中miR-583、DDX5 mRNA表達(dá) 空白對照組與NC-siRNA組HepG2.2.15細(xì)胞中miR-583及DDX5 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NC-siRNA組相比，miR-583 siRNA組HepG2.2.15細(xì)胞中miR-583表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，DDX5 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組HepG2.2.15細(xì)胞中miR-583、DDX5 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 各組HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBV DNA水平 空白對照組與NC-siRNA組HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBV DNA水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NC-siRNA組相比，miR-583 siRNA組HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBV DNA水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBV DNA水平比較

2.4 各組HepG2.2.15細(xì)胞上清液HBsAg、HBeAg表達(dá)水平 空白對照組與NC-siRNA組HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBsAg、HBeAg表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NC-siRNA組相比，miR-583 siRNA組HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBsAg、HBeAg表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組HepG2.2.15細(xì)胞上清液HBsAg、HBeAg表達(dá)水平比較

2.5 雙熒光素酶法驗(yàn)證miR-583與DDX5的靶向關(guān)系 Target ScanHuman網(wǎng)站顯示，miR-583與DDX5存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染DDX5-MUT、pmiR-mCherry質(zhì)粒與共轉(zhuǎn)染DDX5-MUT、miR-583重組質(zhì)粒的HepG2.2.15細(xì)胞相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與共轉(zhuǎn)染DDX5-WT、pmiR-mCherry質(zhì)粒的細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染DDX5-WT、miR-583重組質(zhì)粒的HepG2.2.15細(xì)胞相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表5。

圖1 TargetScanHuman網(wǎng)站預(yù)測miR-583與DDX5的靶向結(jié)合位點(diǎn)

圖2 各組HepG2.2.15細(xì)胞相對熒光素酶活性比較

表5 各組HepG2.2.15細(xì)胞相對熒光素酶活性比較

3 討論

HBV是嗜肝DNA病毒，每年有至少一百萬人死于HBV相關(guān)的乙型肝炎及繼發(fā)的肝纖維化、肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌等疾病[10-11]。目前藥物治療中尚無藥物有效清除體內(nèi)的HBV，干擾素、核苷類似物等藥物可在一定程度上抑制病毒復(fù)制，但可能存在療效有限、停藥復(fù)發(fā)、存在較重的不良反應(yīng)等局限性[12-13]。miRNA能通過降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA翻譯來調(diào)控其靶基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)水平，在抗炎、抗腫瘤、抗病毒感染、免疫應(yīng)答等過程中均發(fā)揮重要的作用[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，在HBV感染過程中，HBV可通過其復(fù)制、表達(dá)的產(chǎn)物影響機(jī)體miRNA表達(dá)，從而增加其自身復(fù)制，促進(jìn)自身的持續(xù)性感染，同時(shí)，宿主細(xì)胞miRNA可通過間接、直接的機(jī)制調(diào)控HBV的復(fù)制、表達(dá)，如直接靶向病毒RNA抑制HBV復(fù)制，靶向特異性宿主基因阻擋病毒繁殖，或激活特異性免疫應(yīng)答消滅病毒等[16]。因此，miRNA在抗HBV治療中具有良好的應(yīng)用前景。

miR-583是近年來常研究的miRNA，既往發(fā)現(xiàn)在調(diào)控腰椎間盤退變方面發(fā)揮重要作用，在腫瘤中亦有差異性表達(dá)[17-18]。目前有研究顯示，miR-583在不同中醫(yī)癥候的CHB患者體內(nèi)差異表達(dá)，可能參與CHB進(jìn)展[7]。本研究結(jié)果顯示，人穩(wěn)轉(zhuǎn)HBV病毒的肝癌細(xì)胞HepG2.2.15中miR-583表達(dá)水平較人肝癌細(xì)胞HepG2顯著升高，提示miR-583可能參與HBV病毒感染過程，但其上調(diào)可能是HBV促進(jìn)自身持續(xù)性感染的機(jī)制，但也可能是機(jī)體阻止HBV復(fù)制、繁殖的對抗保護(hù)機(jī)制。機(jī)體感染HBV后，HBV在肝細(xì)胞中復(fù)制并分泌HBsAg、HBeAg等標(biāo)志物，這些標(biāo)志物水平可用來評估HBV復(fù)制水平[19-20]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)miR-583表達(dá)后，HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBsAg、HBeAg表達(dá)水平均顯著降低，且HBV DNA拷貝數(shù)亦顯著降低，提示抑制miR-583表達(dá)可以顯著抑制HBV的蛋白分泌水平及DNA復(fù)制水平，從而抑制HBV表達(dá)，推測miR-583在HepG2.2.15細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)更可能是HBV促進(jìn)自身持續(xù)性感染的機(jī)制。

DDX5是ATP依賴的進(jìn)化中高度保守的RNA解旋酶，在人類細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中廣泛表達(dá)，參與RNA合成、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)及核糖體生物合成、細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程[21-22]。劉歡等[23]研究表明，DDX5對病毒增殖具有抑制作用，可能與病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄過程負(fù)調(diào)控病毒基因組RNA、長鏈亞基因組sg mRNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)[24]。本研究結(jié)果顯示，人穩(wěn)轉(zhuǎn)HBV病毒的肝癌細(xì)胞HepG2.2.15中DDX5表達(dá)水平較人肝癌細(xì)胞HepG2顯著降低，提示DDX5在HepG2.2.15細(xì)胞中表達(dá)受到抑制，提示HBV病毒在HepG2.2.15細(xì)胞中促進(jìn)自身的復(fù)制、增殖，其機(jī)制可能涉及對DDX5表達(dá)的抑制。生物信息學(xué)分析顯示，miR-583與DDX5存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，可能存在靶向調(diào)控關(guān)系。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-583與DDX5在HepG2.2.15細(xì)胞中確實(shí)存在靶向調(diào)控關(guān)系。mRNA檢測亦顯示，下調(diào)miR-583表達(dá)后，HepG2.2.15細(xì)胞中DDX5 mRNA水平顯著升高，提示下調(diào)miR-583表達(dá)會(huì)導(dǎo)致其靶基因DDX5表達(dá)升高，進(jìn)而導(dǎo)致HBV病毒復(fù)制、增殖受到抑制。

4 結(jié)論

miR-583可能靶向抑制DDX5進(jìn)而促進(jìn)HBV復(fù)制、表達(dá)，并通過下調(diào)miR-583的表達(dá)而導(dǎo)致DDX5表達(dá)升高，進(jìn)而抑制HBV病毒復(fù)制、表達(dá)，為探討CHB新的治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。