楊敏捷（綜述） 王小林△（審校）

（1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院介入治療科 上海 200032；2上海市影像醫(yī)學(xué)研究所 上海 200032；3國家放射與治療臨床醫(yī)學(xué)中心 上海 200032）

人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)需要自我更新和分化之間的精確平衡。不同組織中存在干細(xì)胞，其中少數(shù)保留再生潛能，而大多數(shù)細(xì)胞進(jìn)入不可逆分化過程，最終產(chǎn)生特定類型的細(xì)胞。干細(xì)胞存在于造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、腸、皮膚、心肌、肺等組織中［1］。人體對于某種抗原能夠產(chǎn)生長達(dá)幾十年甚至終身的特異性免疫記憶［2］。理論上存在一種能夠自我更新以及分化為其他類型T細(xì)胞的記憶性干細(xì)胞樣T細(xì)胞（stem cell-like memory T cells，TSCM）［3］。2006年，人們在移植物抗宿主疾病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)一群長期生存、具有干細(xì)胞特性的記憶T細(xì)胞，逐步揭開了TSCM神秘的面紗［4］。由于TSCM所占比例稀少（正常人外周血中TSCM占T細(xì)胞的2%～3%）［5］，確定人類的TSCM表型特征十分具有挑戰(zhàn)性。最近，通過TSCM細(xì)胞標(biāo)記物CD62L、CCR7、IL2Rβ、BCL-2和趨化因子（C-X-C基序）受 體3（chemokine（C-X-C motif）receptor 3，CXCR3）的表達(dá)可在多個物種中鑒別出TSCM［4-5］。使用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxy fluorescein N-succinimidyl ester，CSFE）追蹤細(xì)胞分裂的實驗已經(jīng)證明：TSCM細(xì)胞能夠自我更新，且分化為 不 同 類 別 的T細(xì) 胞［6］。雖 然 中 央 記 憶T細(xì) 胞（central memory T cell，TCM）和 效 應(yīng) 記 憶T細(xì) 胞（effector memory T cell，TEM）也可以進(jìn)行自我更新，但是只有TSCM細(xì)胞能夠產(chǎn)生所有3種記憶T細(xì)胞以及效應(yīng)T細(xì)胞（effector T cell，TEFF）［5］。

細(xì)胞免疫治療是腫瘤治療的新方向，其中基因修飾T細(xì)胞（如嵌合抗原受體T細(xì)胞，CAR-T）已經(jīng)在血液系統(tǒng)腫瘤中取得突破性進(jìn)展。但是實體腫瘤的CAR-T細(xì)胞治療效果欠佳。研究表明大部分的T細(xì)胞在輸注后耗竭失能［7］，而輸注記憶性T細(xì)胞等其他具有長期生存能力的T細(xì)胞亞型有望提高臨床療效［8-11］。采用傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方案擴(kuò)增T細(xì)胞會導(dǎo)致T細(xì)胞分化和增殖潛力的喪失。由于TSCM能夠更好地適應(yīng)腫瘤微環(huán)境并且能夠長期生存分化為其他類型的T細(xì)胞，這使其成為腫瘤細(xì)胞免疫治療的理想工具［12-13］。目前，首個采用Piggybac基因編輯技術(shù)以抗B細(xì)胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）為靶點(diǎn)的CAR-TSCM的臨床試驗正在進(jìn)行中（NCT03288493）。

通過小分子藥物在體外誘導(dǎo)或者重新編程誘導(dǎo)干細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、β-胰島細(xì)胞等［14-15］。TSCM表型研究的重要進(jìn)展也是在小分子藥物處理下誘導(dǎo)產(chǎn)生足夠量的細(xì)胞（用于細(xì)胞測序，發(fā)現(xiàn)表型特征）的前提下而取得［5-6，16］。另外，抗原識別、共刺激配體和細(xì)胞因子共同調(diào)控T細(xì)胞活化和分化。本文將主要聚焦于TSCM，對其誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)機(jī)制的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

T細(xì)胞的分化幼稚T細(xì)胞（na?ve T cell，TN）在 接 受 抗 原 刺 激 后 表 達(dá)CD45RO［17］，分 化 為TM及TEFF。根據(jù)是否表達(dá)淋巴結(jié)歸巢標(biāo)志CCR7，TM分為TCM（CCR7+）及TEM（CCR7-）［18］。與TN比較，TM在抗原再次刺激時能夠迅速增殖，釋放TNFα、IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，轉(zhuǎn)化為TEFF細(xì)胞［19］。TCM細(xì)胞保持表達(dá)CD62L及CCR7但TEM兩者均為陰性，前者能夠更高效地釋放IL-2而后者則釋放更多的IFNγ從而更具細(xì)胞毒性［18］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞的分化呈漸進(jìn)式：效應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)隨著TN細(xì)胞→TSCM細(xì)胞→TCM細(xì)胞→TEM細(xì)胞逐漸升高，而初始相關(guān)基因的表達(dá)則逐漸丟失［5，20］；T細(xì)胞效應(yīng)相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄因子隨著細(xì)胞分化程度去甲基化并處于準(zhǔn)備表達(dá)的狀態(tài)，在IL-5、IL-7介導(dǎo)的細(xì)胞增殖中效應(yīng)分子的去甲基化得以保存而CCR7、Tcf7位點(diǎn)則 逐 漸 甲 基 化［21］。TSCM是 幼 稚T細(xì)胞接受抗原刺激后分化最少的一群T細(xì)胞其基因表達(dá)譜更接近于TM。

2006年Takahashi等［22］報道導(dǎo)入4種 轉(zhuǎn) 錄因子將體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞的iPSC技術(shù)。iPSC技術(shù)開啟了人類編輯細(xì)胞的新篇章。近年來，人們利用不同的細(xì)胞譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子組合，通過iPSC技術(shù)成功誘導(dǎo)出神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、β-胰腺細(xì)胞［23-26］。然而，用于遞送重編程因子的轉(zhuǎn)基因載體一般是病毒，這對干細(xì)胞的臨床應(yīng)用產(chǎn)生影響。小分子藥物可取代部分轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控相關(guān)通路促進(jìn)干細(xì)胞的產(chǎn)生［27］。近年來，基于這種思維以及前期對于T細(xì)胞記憶產(chǎn)生機(jī)制相關(guān)通路的研究，利用小分子藥物促進(jìn)TSCM的分化取得了重大的研究進(jìn)展（表1）。

表1 TSCM體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的機(jī)制Tab 1 Mechanisms of in vitro induction of TSCM

WNT信號通路在TSCM中的作用WNT信號對維持干細(xì)胞的自我更新具有重要的作用，通過GSK3β抑制劑激活WNT通路可以增加iPSC的轉(zhuǎn)換效率［28-30］。T細(xì)胞在胸腺的發(fā)育、分化、成熟中WNT信號通路同樣扮演著重要的角色。成熟的T細(xì) 胞 表 達(dá)WNT信 號 通 路 分 子LEF1和TCF1［31］。另外LEF1及TCF1在TN受到抗原刺激后降低表達(dá)［32］。Gattinoni等［6］發(fā) 現(xiàn)TWS-119（GSK3β抑 制劑）抑制TN細(xì)胞向TEFF細(xì)胞分化，產(chǎn)生一群CD44lowCD62LhighSca-1highCD122highBcl-2highTSCM。這群細(xì)胞能在小鼠體內(nèi)長期生存且在大量增殖后有將近一半的細(xì)胞依然保持TSCM的特性。相較于TEM及TCM，TSCM細(xì)胞在體內(nèi)具有更加高效的抗腫瘤能力。值得注意的是研究中每只小鼠所注射的T細(xì)胞量為5×104，這僅僅是CAR-T常用方案劑量的千分之一。GSK3β抑制劑的使用能夠產(chǎn)生足夠量的TSCM，這為確定人TSCM的表型提供支持。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CD95和IL-2Rβ的表達(dá)能夠區(qū)分人類的TN及TSCM。TSCM在α-CD3/CD2/CD28微球的刺激下迅速產(chǎn)生IFN-γ、IL-2及TNFα。腹腔注射靶向間皮素的TSCM相較于TEM及TCM明顯延長晚期（模型建立3個月后）腹腔間皮癌小鼠生存期［5］。

mTOR信號通路在TSCM中的作用mTOR是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的代謝酶。mTOR整合PI3KAKT通路的細(xì)胞因子和生長因子信號以及WNTGSK3β等信號，是調(diào)節(jié)代謝的樞紐［33］。雷帕霉素能夠特異性結(jié)合FKBP12蛋白阻斷mTORC1信號通路，是器官移植術(shù)后常用的免疫抑制藥物［34-35］。近年來研究發(fā)現(xiàn)低劑量的雷帕霉素能夠促進(jìn)TM細(xì)胞的 分 化［36-37］。mTOR通 路 中mTORC1、S6K1及eIF4E參與調(diào)控TM的形成，mTOR是直接作用于T細(xì)胞從而發(fā)揮調(diào)控作用［36］。研究表明雷帕霉素或WNT激動 劑TWS119對mTORC1的抑制，可以 促進(jìn)CD4+TSCM和CD8+TSCM細(xì)胞的誘導(dǎo)。藥物誘導(dǎo)的TSCM細(xì)胞具有優(yōu)越的在體長期增殖能力，WNT信號通路激活劑TWS119同時也抑制mTOR信號通 路［38］。這 與GSK3通 過 磷 酸 化TSC2以 依 賴 于AMPK-引發(fā)磷酸化的方式抑制mTOR途徑類似［39-40］。當(dāng) 然，TWS119是 否 能 夠 通 過 獨(dú) 立 于mTOR信號通路促進(jìn)TSCM的產(chǎn)生還需要進(jìn)一步研究。另外，值得注意的是該研究所用的細(xì)胞因子為IL-2（300 IU/mL）。聯(lián)合其他促進(jìn)記憶性T細(xì)胞產(chǎn)生及增殖的細(xì)胞因子可能進(jìn)一步增加TSCM的比例，為其臨床轉(zhuǎn)化打下基礎(chǔ)。

表觀遺修飾信號通路調(diào)控誘導(dǎo)TSCM真核細(xì)胞的基因組被包裝成被稱為核小體的緊密折疊結(jié)構(gòu)。核小體可以通過控制轉(zhuǎn)錄因子對DNA的可及性來協(xié)調(diào)細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)。在細(xì)胞分化過程中，命運(yùn)決定因子的DNA以及染色質(zhì)獲得了多個層次的表觀修飾［41］。調(diào)控DNA或者組蛋白修飾的小分子藥物能夠加速或者增加iPS的誘導(dǎo)、替代某些轉(zhuǎn)錄因子［14，42］。

Crompton等［43］對 體 外 產(chǎn) 生 的 小 鼠CD8+TCM、TEM和TSCM細(xì) 胞 進(jìn) 行 了H3K4me3和H3K27me3修飾的全基因組分析，發(fā)現(xiàn)TCM和TEM高效富集了包括IFN-γ、GZMB和PRF在 內(nèi) 的 效 應(yīng) 分 子 位點(diǎn)的H3K4me3組蛋白修飾，這使得記憶細(xì)胞在再次遇到抗原時能夠迅速表達(dá)這些基因。值得注意的是，雖然TSCM在許多檢測到的效應(yīng)分子位點(diǎn)處具有H3K4me3組蛋白修飾，其修飾程度與初始CD8 T細(xì)胞相似。Kakaradov等［20］通過單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)，在CD8+TN第一次分裂后產(chǎn)生的子代細(xì)胞中，CD8+TE的前體細(xì)胞迅速上調(diào)幾百個基因，而CD8+TM的前體細(xì)胞則只有幾個特定基因的改變。理論上通過小分子藥物調(diào)節(jié)相關(guān)因子的表觀修飾可以影響T細(xì)胞的分化方向。

Kagoya等［44］通過高通量小分子篩選促進(jìn)TSCM產(chǎn)生表觀遺傳學(xué)修飾靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)JQ1在體外刺激CD8+TN細(xì)胞后，TSCM和TCM細(xì)胞增加。在體內(nèi)，JQ1處理的細(xì)胞表現(xiàn)出更好的細(xì)胞生存、細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞因子產(chǎn)生能力。JQ1是含溴結(jié)構(gòu)域蛋白的BET家族的抑制劑。JQ1處理后T細(xì)胞減少賴氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子（human basic leucine zipper transcription factor，BATF）表達(dá)。通過siRNA沉默BATF增加TSCM和TCM細(xì)胞群。這與之前報道的JQ1通過抑制BATF增強(qiáng)沉默信息調(diào)節(jié)因子（Sirtuin1，SIRT1）抑 制T-bet減少TE一致［45-46］。研究中細(xì)胞培養(yǎng)方案包括細(xì)胞因子為IL-2（100 IU/mL）及IL-15（10 ng/mL）。初始培養(yǎng)細(xì)胞為CD3+T細(xì)胞，JQ1處理后CD4+TSCM細(xì)胞的比例為10%左右。IL-15可以促進(jìn)TM細(xì)胞的增殖。JQ1處理也同時顯著降低T細(xì)胞mTOR通路中的S6K蛋白的磷酸化，同時其上游的AKT磷酸化狀態(tài)沒有改變。JQ1對于mTOR通路的作用位點(diǎn)可能在AKT的下游。這提示表觀修飾調(diào)節(jié)小分子藥物對于細(xì)胞命運(yùn)的改變是通過多通路的調(diào)節(jié)而實現(xiàn)。Youngblood等［47］發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞中的幼稚相關(guān)基因的甲基化可以逆轉(zhuǎn)從而產(chǎn)生能夠長期生存的CD8 TM細(xì)胞。表明記憶T細(xì)胞也可能起源于效應(yīng)T細(xì)胞。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNA Methyltransferase 3A，DnMt3a）在CD8+T細(xì)胞受到刺激后升高［48］。在TE細(xì)胞中DnMt3a特異性的靶向幼稚相關(guān)的基因為：Sell（Cd62L），Ccr7以及Tcf7。研究者通過CSFE標(biāo)記CD62L（-）的T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)未分裂的第一代細(xì)胞可以通過去除Cd62L基因啟動子的甲基化而重新表達(dá)CD62L蛋白［47］。另外的研究［49］表明，調(diào)節(jié)甲基化的TET2的丟失促進(jìn)記憶性T細(xì)胞的產(chǎn)生。

Notch信號通路在TSCM中的作用Notch轉(zhuǎn) 導(dǎo)通路是細(xì)胞高度保守的信號通路，參與調(diào)節(jié)不同的祖細(xì)胞和干細(xì)胞類型的增殖和分化。Notch信號與造血干細(xì)胞的維持、T細(xì)胞的分化及成熟有關(guān)［50-51］。另外，Notch與IL-2R、mTOR及T-bet形成正 反 饋促 進(jìn)TE細(xì) 胞 的 產(chǎn) 生［52］。在iPS誘 導(dǎo) 方 面，抑 制Notch通路能夠抑制p21從而顯著提高了iPSC的產(chǎn)生［53］。這些信息似乎暗示Notch信號的阻斷可以促進(jìn)TM的生成。與此相反的是通過OP9-hDLL1系統(tǒng)激 活 人TEM（CD45RA+CD45RO-CCR7+CD95+）Notch信號能夠高效地促進(jìn)其轉(zhuǎn)變?yōu)門SCM［54］。其潛在機(jī)制可能在于NOTCH-FOXM1代謝通路調(diào)控［55］。這也說明，激活狀態(tài)的TEM也可以是TSCM的來源。通過測序發(fā)現(xiàn)，Notch誘導(dǎo)的TSCM的基因表達(dá)譜系與TWS119誘導(dǎo)的TSCM最為相似［54］。Notch信號可以促進(jìn)TH17細(xì)胞的長期生存，這說明Notch信號在T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶階段中可能發(fā)揮不同的作用［56］。TSCM轉(zhuǎn)化研究中細(xì)胞培養(yǎng)的條件近乎苛刻，OP9-DL1系統(tǒng)、IL-7（10 ng/mL）以及IFN-γ抗體缺一不可。而加入IL-15則顯著減少轉(zhuǎn)化效率。這也提示細(xì)胞因子在Notch信號通路T細(xì)胞類別轉(zhuǎn)換中扮演重要角色。

細(xì)胞因子在TSCM產(chǎn)生中的作用細(xì)胞因子全程參與T細(xì)胞的發(fā)育、成熟、分化、效應(yīng)和記憶形成［57］。在TSCM的產(chǎn)生中也扮演著至關(guān)重要的作用。近年來，多項研究表明IL-7、IL-15及IL-21能夠增加T細(xì) 胞 增殖 及 腫 瘤 殺傷 能 力［58-63］。IL-7及IL-15能夠促進(jìn)TSCM的產(chǎn)生，另外TSCM在IL-15或IL-7的作用下能夠大量分裂、增殖，而且該組合產(chǎn)生TSCM的效率優(yōu)于TWS119+IL-2［64］。為了培養(yǎng)臨床應(yīng)用級別的TSCM，Gattinoni等［5］采用逐步分離法從外周血中分離TN，培養(yǎng)基中加入5 ng/mL IL-7及30 ng/mL IL-21，9天后TSCM的比例高達(dá)52.2%±12.52%，而IL-2組TSCM的比例只有1.2%［5，65］。相較于體細(xì)胞，細(xì)胞因子對于T細(xì)胞的分化、生存及凋亡起著至關(guān)重要的作用。在對T細(xì)胞的重新編程、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化中，必須考慮細(xì)胞因子的作用。令人深思的是，IL-2增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)的脫中胚蛋白（Eomes）、顆粒酶B和CD44表達(dá)促進(jìn)CD8+TN細(xì)胞向CD8+TE細(xì)胞分化。IL-21抑制IL-2Rα的表達(dá)并抑制IL-2介導(dǎo)的CD8（+）TE細(xì)胞表型獲得，但I(xiàn)L-21在過繼免疫治療中顯著增強(qiáng)了抗腫瘤效果［66］，這與IL-21調(diào)控CD8+T細(xì)胞表達(dá)L-選擇蛋白提高細(xì)胞體內(nèi)的增殖有關(guān)。IL-2猶如T細(xì)胞之“興奮劑”，使之瘋狂，然后“消耗殆盡”。對于腫瘤或者慢性病毒感染，需要的是“持久的戰(zhàn)斗”，IL-7、IL-15及IL-21所培育出的“戰(zhàn)士”更具耐受性，能夠以一當(dāng)十。

不對稱分裂與TSCM不對稱分裂是干細(xì)胞的特征之一［67］。T細(xì)胞在穿越血管內(nèi)皮、與腫瘤組織接觸、輔助細(xì)胞和APC接觸以及細(xì)胞因子的作用下均可誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生不對稱分裂。通過不對稱分裂子細(xì)胞可以獲得不同的命運(yùn)決定因子從而分化為不同類型的細(xì)胞。TN細(xì)胞在接觸抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cells，APC）后產(chǎn)生第一代子細(xì)胞：靠近APC的子代細(xì)胞分化為TE；遠(yuǎn)離APC的分化為TM［68］。這種分化與c-Myc的不對稱分裂有關(guān)。進(jìn)一步研究表明：Notch、WNT、mTOC、表觀修飾、細(xì)胞因子等信號通路均與細(xì)胞的不對稱分裂有關(guān)［69-72］。另外，T細(xì)胞通過不對稱分裂子代細(xì)胞可以獲 得 不 同 的 代 謝方式［69，73-74］。低 表 達(dá)mTOC1的子代細(xì)胞脂肪代謝能力提高并且能夠在小鼠體內(nèi)長期生存［69］。CD4+細(xì)胞在刺激后分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞一部分保留了TCF1具有更強(qiáng)的自我更新能力，而另一部分子代細(xì)胞由于mTOC1抑制TCF1向終末分化的TE細(xì)胞分化［75］。TCR信號的強(qiáng)弱參與T細(xì)胞的極化從而引發(fā)不對稱分裂［76］。在IL-5及IL-17存在的條件下高強(qiáng)度的antiCD3刺激促進(jìn)TN細(xì) 胞向TE細(xì)胞分化［64］，而 低 強(qiáng) 度 刺 激 可 以 促 進(jìn)TSCM細(xì) 胞 產(chǎn) 生［77-80］。攜 帶 抗 原 肽-MHC復(fù) 合 物 的APC細(xì)胞對T細(xì)胞的極化是多方面的，具體在什么條件下，哪一方面對于所接觸的幼稚T細(xì)胞的分化方向起到?jīng)Q定性的作用還需要進(jìn)一步研究。另外血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等其他類型的細(xì)胞對于T細(xì)胞極化、不對稱分裂、命運(yùn)轉(zhuǎn)化的影響也有待探索［81］。

結(jié)語基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、表觀修飾組學(xué)、單細(xì)胞測序、基因編輯技術(shù)不斷發(fā)展，通過整合各種信息的綜合分析，新的TSCM命運(yùn)決定因子會不斷被發(fā)現(xiàn)［82］。目前，對于TSCM的轉(zhuǎn)化研究多為體外研究，值得注意的是誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTSCM與自然狀態(tài)的TSCM不 同：TWS119及NOTCH誘 導(dǎo) 的TSCM更 多 地表達(dá)IFN-γ、IFN-α、mTORC1信號基因，更少表達(dá)NF-κB導(dǎo) 致 的TNFα信 號、缺 氧 信 號、TGF-β信號［54］。對于TSCM在體內(nèi)如何產(chǎn)生，其長期生存的位置是位于骨髓、淋巴結(jié)還是其他部位需要進(jìn)一步的研究。綜合目前的研究結(jié)果，多數(shù)證據(jù)支持幼稚T細(xì)胞在接觸APC細(xì)胞活化時在特定的細(xì)胞因子組合情況下通過不對稱分裂產(chǎn)生保持一定幼稚T細(xì)胞特性的活化的TSCM（圖1）。

圖1 體內(nèi)產(chǎn)生的TSCM關(guān)鍵因素Fig 1 Key factors that determine differentiation and generation of Stem cell-like memory T cells in vivo

未來我們在運(yùn)用各種組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)TSCM產(chǎn)生的關(guān)鍵因子基礎(chǔ)上，通過納米材料技術(shù)等人工合成促進(jìn)TSCM的微環(huán)境、基因編輯技術(shù)、小分子藥物、相關(guān)細(xì)胞因子調(diào)控細(xì)胞分化命運(yùn)，能夠創(chuàng)造出更加適應(yīng)腫瘤微環(huán)境、安全、長效的TSCM應(yīng)用于實體腫瘤的治療［83-84］。

作者貢獻(xiàn)聲明楊敏捷論文撰寫和修訂，制圖。王小林論文構(gòu)思和審校。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。