崔洪全 張瀟藝 陳彬 馮其貞

（1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇州九龍醫(yī)院腫瘤科 蘇州 215028；2濟寧醫(yī)學(xué)院2018級臨床醫(yī)學(xué)五年制，3臨床醫(yī)學(xué)院外科學(xué)總論教研室 濟寧 272067）

卵巢癌是女性癌癥死亡的第五大原因，通常晚期才被發(fā)現(xiàn)［1］。流行病學(xué)研究表明美國約80%的卵巢癌患者存在局部或遠處轉(zhuǎn)移［2］。影響卵巢癌患者預(yù)后的主要因素是分期水平，Ⅰ期患者的5年生存率為70%，而Ⅳ期患者的5年生存率僅為8%［3］。因此，識別卵巢癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物和潛在的調(diào)節(jié)因子具有重要意義。近年來，卵巢癌的靶向治療和免疫治療為患者提供了新方向，其目的是通過激活T細胞，調(diào)節(jié)T細胞浸潤水平來延長患者生存時間［4］，同時有研究顯示免疫治療是刺激機體對腫瘤的免疫應(yīng)答［5］。因此，進一步明確腫瘤細胞與免疫細胞之間的相互作用及分子機制，可能為卵巢癌患者的免疫治療提供新的靶點。

羧基谷氨酸蛋白（matrix gamma linolenic acid protein，MGP）是在骨中發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性小蛋白，由軟骨細胞分泌到細胞外基質(zhì)中，在心臟、腎臟中均有表達。MGP通過與羥基磷灰石中的晶核結(jié)合，發(fā)揮鈣化抑制劑的功能，從而阻止晶體生長。MGP也是重要的局部血管鈣化抑制劑，可以接受兩種轉(zhuǎn)錄后修飾：維生素K-dependentγ-谷氨酸羧化和絲氨酸磷酸化［6］。已發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞系表達MGP，在乳腺癌MCF-7細胞中降低MGP表達，可導(dǎo)致腫瘤細胞增殖和侵襲能力增強。MGP在其他類型腫瘤中也有表達，如結(jié)腸癌、卵巢癌。我們應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析了MGP基因在卵巢癌組織中的表達情況，并發(fā)現(xiàn)MPG高表達與患者預(yù)后差密切相關(guān)；同時分析了MGP表達水平與卵巢癌免疫微環(huán)境的關(guān)系，為進一步研究其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機制提供有價值的依據(jù)。

材料和方法

TCGA數(shù)據(jù)庫分析進入TCGA網(wǎng)站（https：//www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga），點擊Access TCGA Data，進入數(shù)據(jù)下載頁面；點擊Repository，在Cases選項中選擇ovary，在Program選項中選擇TCGA，在Project選項中選擇TCGAOV，在Files選項中選擇transcriptome profiling，在Data Type選項中選擇Gene Expression Quantification，在Experimental Strategy選項中選擇RNA-seq，在Workflow Type選項中選擇HTSeq-FPKM，最后點擊Add All Files to Cart，進入Cart頁面，在Download選 項 中 下 載Manifest、Cart、Metadata和Clinical文 件。

GTEX數(shù)據(jù)庫分析基因型組織表達（Genotype-Tissue Expression，GTEX）是一個大型人類組織mRNA數(shù)據(jù)集，為識別與基因表達變化相關(guān)的遺傳變異提供參考。通過UCSC Xena官網(wǎng)（https：//xena.ucsc.edu/）進 入GTEX數(shù) 據(jù) 下 載 頁面，下載gene expression RNAseq轉(zhuǎn)錄組TOIL RSEM fpkm格式數(shù)據(jù)和GTEX phenotype臨床信息。

TIMER網(wǎng)站分析進入TIMER官網(wǎng)（https：//cistrome.Shinyapps.io/timer）可查看到7個模塊?！癉iff Exp”基因差異表達模塊通過箱線圖顯示基因在TCGA腫瘤組織和癌旁正常組織中的分布情況，并使用Wilcoxon檢驗對差異表達進行統(tǒng)計學(xué)分析?！癝urvival”生存模塊構(gòu)建COX比例風(fēng)險模型，協(xié)變量包括年齡、性別、種族、腫瘤分期和基因表達。通過Kaplan-Meier繪制生存曲線，通過log-rank檢驗比較兩組生存曲線的P值。該COX模型由R包“survival”中的函數(shù)coxph（）擬合；系數(shù)coef為 回 歸 系 數(shù)，HR為 風(fēng) 險 比，95%CI_l和95%CI_u顯示上下95%CI。“Mutation”突變模塊通過箱線圖顯示不同基因突變狀態(tài)下免疫細胞浸潤水平的分布，并使用雙邊Wilcoxon秩和檢驗進行統(tǒng)計分析?！癈orrelation”相關(guān)性模塊通過散點圖繪制目標(biāo)基因在腫瘤中的分布情況，并通過Spearman的rho值評估統(tǒng)計學(xué)意義，還提供了以腫瘤純度或年齡為條件的部分相關(guān)選項。

基因集富集分析GSEA方法是一組具有共同生物學(xué)功能、染色體位置或調(diào)節(jié)通路的基因［7］。本研究根據(jù)MGP基因表達水平將卵巢癌樣本分為高表達組和低表達組。使用GSEA_4.0.1版本軟件，在Gene sets database設(shè)置中分別選擇c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt［Curated］和c2.cp.biocarta.v7.4.symbols.gmt［Curated］，設(shè) 置 選 項 中Number of permutations選 擇1000，Phenotype labes選 擇h_versus_l。

統(tǒng)計學(xué)分析采用R 3.5.1軟件進行統(tǒng)計分析。通過limma包處理轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過Wilcoxon檢驗分析兩組間差異。測量數(shù)據(jù)用x±s表示，計數(shù)數(shù)據(jù)用百分比（%）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

MGP在不同類型人類腫瘤中的mRNA表達水平MGP mRNA在各種腫瘤與鄰近正常組織間的表達差異如圖1A所示，在膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、結(jié)腸癌中MGP表達均低于癌旁組織。由于TCGA數(shù)據(jù)庫中無正常卵巢組織數(shù)據(jù)，我們結(jié)合GTEX數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，MGP在正常卵巢組織中高表達，而在卵巢癌組織中低表達（圖1B）。

圖1 MGP在泛癌組織中與正常組織中的表達情況Fig 1 Expression level of MGP in pan-cancer tissues and normal tissues

GSEA分析MGP基因在卵巢癌中富集的信號通路以KEGG基因集作為GSEA分析的參考基因集，MGP高表達組與細胞黏附分子、細胞因子受體相互作用、血管平滑肌收縮、腸道免疫球蛋白IgA、自然殺傷細胞介導(dǎo)細胞毒性等信號通路相關(guān)（圖2A）。以BIOCARTA基因集作為GSEA分析的參考基因集，MGP高表達組與CCR5通路、NKT通路、IL-17通路、Th1/Th2等通路有關(guān)（圖2B）。表明MGP可能通過上述生物學(xué)過程促進卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，特別是與淋巴細胞和細胞因子密切相關(guān)。

圖2 GSEA分析MGP基因在卵巢癌中富集的信號通路Fig 2 GSEA analysis on the enriched signal pathway of MGP gene in ovarian cancer

MGP與卵巢癌免疫細胞浸潤的關(guān)系通過TIMER網(wǎng)站分析MGP表達與卵巢癌微環(huán)境中不同類型免疫細胞的相關(guān)性：MGP表達水平與CD8+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞呈正相關(guān)，而與腫瘤純度呈負相關(guān)（P＜0.05，圖3A）。通過分析MGP基因拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn)，MGP基因缺失與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、樹突狀細胞的浸潤水平密切相關(guān)（圖3B）。

圖3 MGP表達水平和基因突變與免疫浸潤的關(guān)系Fig 3 Relationship between MGP expression level，gene mutation and immune infiltration

MGP和免疫細胞浸潤水平與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系通過TIMER網(wǎng)站生存分析模塊，繪制免疫細胞浸潤和基因的Kaplan-Meier圖，通過logrank檢驗比較兩組生存曲線的P值。結(jié)果顯示，卵巢癌患者中CD4+T細胞、巨噬細胞浸潤水平和MGP表達水平與患者預(yù)后密切相關(guān)（P＜0.05，圖4）。高水平CD4+T細胞、低水平巨噬細胞和低水平MGP提示卵巢癌患者預(yù)后好。

圖4 MGP和免疫細胞浸潤水平與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig 4 Relationship between the level of MGP and immune cell infiltration and the prognosis of patients with ovarian cancer

MGP是卵巢癌患者的獨立預(yù)后因子通過構(gòu)建COX回歸模型發(fā)現(xiàn)：患者年齡，巨噬細胞、中性粒細胞浸潤水平，MGP表達水平與患者預(yù)后呈正相關(guān)，而CD8、CD4 T細胞與患者預(yù)后呈負相關(guān)（P＜0.05，表1），即MGP高表達組患者預(yù)后更差。

表1 卵巢癌患者總生存影響因素的COX比例風(fēng)險回歸模型分析Tab 1 COX proportional risk regression model analysis of factors influencing overall survival in ovarian cancer patients

MGP表達與免疫細胞相關(guān)基因的關(guān)系通過分析TIMER數(shù)據(jù)庫相關(guān)性模塊，使用Spearman的rho值評估統(tǒng)計差異并繪制散點圖，同時提供了以腫瘤純度或年齡為條件的部分相關(guān)選項。結(jié)果顯示，MGP與大多數(shù)免疫相關(guān)基因的相關(guān)性顯著，經(jīng)過腫瘤純度或年齡調(diào)整后差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5，表2），圖5僅展示MGP與CD8A和CD8B基因的相關(guān)性。

圖5 MGP與CD8基因表達的相關(guān)性分析Fig 5 Correlation analysis of MGP and CD8 gene expression

表2 TIMER數(shù)據(jù)庫中MGP與免疫細胞相關(guān)基因的相關(guān)性分析Tab 2 Correlation analysis between MGP and relate genes and markers of immune cells in TIMER database

討 論

卵巢癌分期對患者5年生存率有重要影響。研究表明，MGP在病理性血管生成和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。在膠質(zhì)母細胞瘤、宮頸癌和皮膚癌中均發(fā)現(xiàn)MGP表達水平升高，且與腫瘤進展呈正相關(guān)［8-9］。與正常組織中相比，MGP在多種實體瘤中表達下調(diào)。但是，我們在生存分析中發(fā)現(xiàn)MGP高表達組的卵巢癌患者預(yù)后更差，同時COX風(fēng)險比例模型顯示MGP為高風(fēng)險因素。

通過GSEA方法分析MGP基因在卵巢癌組織中的富集情況，結(jié)果顯示MGP富集于細胞黏附分子等信號通路。研究表明，細胞黏附分子PCDH18的低表達與頭頸鱗癌的整體生存較差相關(guān)，而MPG通過調(diào)節(jié)這一信號通路，導(dǎo)致患者預(yù)后不良［10］。MGP同時富集于細胞因子受體信號通路、血管平滑肌收縮信號通路、CCR5信號通路、NK7信號通路等，因此我們推測MGP可能通過這些信號通路調(diào)控卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。

CD8可特異性標(biāo)記細胞毒性T細胞。細胞毒性T細胞是一種在體內(nèi)識別腫瘤抗原并分泌針對效應(yīng)細胞的細胞因子的寡克隆T細胞群，并與免疫浸潤有關(guān)，因此在腫瘤清除中起積極作用。PD-L1和CD8+T細胞聯(lián)合誘導(dǎo)凋亡，并與過表達PDK1的卵巢癌細胞共培養(yǎng)可導(dǎo)致PD-L1表達增加，而PDK1的缺失則產(chǎn)生相反的作用［11］。我們通過GSEA分析MGP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中幾條與免疫密切相關(guān)，包括biocarta_NKT_信號通路、biocarta_TH1TH2_信號通路和biocarta_IL17_信號通路等，這些通路在MGP高表達組中均有富集。通過分析mRNA的表達，腫瘤微環(huán)境中存在抗腫瘤和免疫抑制因子，卵巢癌組織中CD4+T細胞浸潤水平對生存率有影響，Kaplan-Meier生存曲線有顯著差異［12］。噬菌體在宿主對腫瘤的防御中起積極作用，免疫細胞浸潤影響卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，尤其是T淋巴細胞的浸潤［13］。一些淋巴細胞促進腫瘤的發(fā)展，而另一些淋巴細胞則抑制腫瘤的發(fā)展。但兩者之間的機制尚不清楚，還需要進一步研究。

(續(xù)表2)

使用消炎藥可能降低卵巢癌的風(fēng)險。阿司匹林等非甾體抗炎藥可能通過限制巨噬細胞的分化，發(fā)揮M2型巨噬細胞的免疫抑制作用，從而降低卵巢癌患者的風(fēng)險。我們的數(shù)據(jù)顯示卵巢癌患者與巨噬細胞浸潤水平顯著相關(guān)，提示MGP可能與腫瘤相關(guān)巨噬細胞的極化有關(guān)。MGP影響腫瘤血管生成，MGP的表達水平與腫瘤血管形成有關(guān)。本研究顯示MGP表達增加與CD4+T細胞和CD8+T細胞浸潤呈正相關(guān)。同時卵巢癌中CD8+T細胞、CD4+T細胞浸潤水平與中性粒細胞和MGP表達均顯著相關(guān)。因此，我們推測MGP有激活CD4+T細胞和CD8+T細胞的潛力。此外，MGP表達與T細胞和B細胞標(biāo)記基因的相關(guān)性提示MGP與卵巢癌腫瘤的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。首先，T細胞基因標(biāo)記（如CCR7和CD3E），輔助T細胞Th1標(biāo)記（如STAT4、INF-γ和INF-α）和Th2標(biāo)記（如GATA-3、STAT6、STAT5A和IL13）均與MGP表達顯著相關(guān)。這些結(jié)果揭示了MGP在免疫調(diào)節(jié)中的作用。MGP有激活巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的潛力。MGP表 達 與KIR3DL1、KIR3DL2、CD68、CD115、IL-10、HLA-DPB1等巨噬細胞和樹突狀細胞基因標(biāo)志物的表達呈正相關(guān)。這些相關(guān)性提示了MGP調(diào)控卵巢癌免疫細胞功能的潛在分子機制。

本文首次證實MGP在卵巢癌預(yù)后中具有重要作用，同時證實MGP基因高表達與患者預(yù)后差密切相關(guān)。MGP表達與卵巢癌免疫細胞浸潤水平密切相關(guān)，并調(diào)控多種免疫相關(guān)信號通路。在未來的研究中，需要進一步研究MGP在卵巢癌細胞中的功能，并對其分子機制進行深入探討。

作者貢獻聲明崔洪全數(shù)據(jù)分析，論文撰寫。張瀟藝，陳彬數(shù)據(jù)下載和整理。馮其貞論文審核和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。