劉玉飛，龐丹丹，李友勇，蔣會兵，田易萍，孫云南，陳林波*

苦茶堿代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因的篩選鑒定

劉玉飛1,2，龐丹丹1,2，李友勇1,2，蔣會兵1,2，田易萍1,2，孫云南1,2，陳林波1,2*

1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，云南 勐海 666201；2. 云南省茶學(xué)重點實驗室，云南 勐海 666201

苦茶是我國特異的茶樹資源，主要分布于西南地區(qū)，富含苦茶堿（1,3,7,9-四甲基尿酸）?？嗖鑹A具有鎮(zhèn)靜、催眠和抗抑郁等多種生理活性，其合成關(guān)鍵基因（苦茶堿合成酶基因）已經(jīng)得到克隆和研究，但是苦茶堿代謝調(diào)控機制的研究鮮有報道。為了挖掘與苦茶堿代謝調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，本研究以高苦茶堿（GKC）、低苦茶堿（LKC）茶樹品種以及常規(guī)茶樹品種（YK10）為研究對象，通過HPLC和RNA-seq分別就樣品的嘌呤生物堿含量和基因表達(dá)情況進行分析，并通過熒光定量PCR驗證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。結(jié)果表明，GKC和LKC的苦茶堿含量分別為21.82?mg·g-1和14.70?mg·g-1，而YK10中檢測不到苦茶堿，另外，GKC和LKC的咖啡堿含量均低于15.00?mg·g-1；通過RNA-seq方法，獲得了3?948個GKC vs YK10和LKC vs YK10共同的且表達(dá)趨勢一致的差異基因，這些差異基因是分屬29個家族的96個轉(zhuǎn)錄因子，通過分析最終確定30個候選轉(zhuǎn)錄因子，尤其是屬于NAC和HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的、、、和等轉(zhuǎn)錄因子可能是參與苦茶堿代謝調(diào)控的關(guān)鍵基因。

苦茶；苦茶堿；RNA測序；轉(zhuǎn)錄因子

苦茶（var. kucha）是我國特異的茶樹資源，其鮮葉和以其鮮葉所制作的茶葉都具有獨特的苦味，其主要分布于廣東、廣西、云南、湖南，尤以云南以及南嶺山脈兩側(cè)最多[1-2]，其中云南省南部、東南部的西雙版納州、紅河州分布著大量的苦茶資源[3]?？嗖栊螒B(tài)與栽培茶樹相似，其一般為小喬木，葉片較大[4]。但是制成茶葉的滋味（具有特殊的苦味）和香氣（具有丁香香氣）與栽培茶樹存在明顯的差異[1-2,4]。在苦茶的原生地，苦茶成為當(dāng)?shù)厝嗣裆畹谋匦杵?，認(rèn)為常飲有“退火發(fā)汗、解毒、治病”的藥用功效[1]。

苦茶與常規(guī)茶樹的嘌呤生物堿組成有較大差異，常規(guī)茶樹以咖啡堿為主，其次是可可堿和茶葉堿，而苦茶以苦茶堿（1,3,7,9-四甲基尿酸）為主，已報道的含量可以超過茶葉干重的3%，其次是咖啡堿和可可堿[5-8]?？嗖鑹A與苦茶的苦味顯著相關(guān)[6,9]，同時，多項研究表明苦茶堿具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗抑郁、消炎、鎮(zhèn)痛、減少肝細(xì)胞的應(yīng)激損傷和改善運動能力等多種生物活性[10-15]。苦茶堿生物合成已相對明確，其是由1,3,7-三甲基尿酸經(jīng)甲基化轉(zhuǎn)化而來，而1,3,7-三甲基尿酸來源于咖啡堿的氧化還原。Wang等[4]和陳瀟敏等[16]對苦茶堿合成途徑相關(guān)的基因進行了探究，篩選到可能催化1,3,7-三甲基尿酸甲基化的苦茶堿合成酶基因（，屬于氮甲基轉(zhuǎn)移酶家族基因），同時發(fā)現(xiàn)苦茶堿代謝途徑的多個基因在苦茶和常規(guī)茶樹中存在差異表達(dá)。Zhang等[17]通過轉(zhuǎn)錄組測序、酶活性測定和晶體結(jié)構(gòu)分析獲得了（MN163831），并對其關(guān)鍵活性位點進行了探討，同時指出苦茶中大量積累苦茶堿的原因可能是的高表達(dá)引起，其在苦茶中的表達(dá)量是常規(guī)茶樹的30萬倍左右。

以上研究主要集中在苦茶堿合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因，但是是否存在調(diào)控基因參與苦茶堿的生物合成目前還不明確?；诖?，本研究選擇高苦茶堿（GKC）、低苦茶堿（LKC）和未檢測到苦茶堿（YK10）的茶樹種質(zhì)/品種作為試驗材料，利用高效液相色譜和RNA-Seq進行嘌呤生物堿分析和轉(zhuǎn)錄組測序，篩選鑒定與苦茶堿代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因。本研究結(jié)果將有助于揭示苦茶堿代謝的調(diào)控機制、解析苦茶富集苦茶堿的分子機制，并有利于后期苦茶茶樹品種的選育。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年7月10日，采摘高苦茶堿（GKC）、低苦茶堿（LKC）和未檢測到苦茶堿（YK10）的茶樹種質(zhì)/品種的一芽二葉，迅速液氮固樣，然后保存于–80℃冰箱，用于進一步的轉(zhuǎn)錄組測序；同時采摘一部分樣品微波固樣，然后75℃烘至足干，磨碎用于生物堿含量的測定。LKC和YK10樹齡約為30?a，GKC樹齡為5?a，每年秋冬對其進行修剪。GKC、LKC和YK10分別來源于云南省的景洪市、金平縣和勐?？h，現(xiàn)均保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所。

1.2 生物堿含量測定

采用高效液相色譜法測定生化樣中生物堿（可可堿、咖啡堿和苦茶堿）含量，各樣品均獨立重復(fù)3次。樣品提取方法具體為：稱取0.100?g磨碎茶樣，置于15?mL離心管中，加入10?mL 75%甲醇水溶液，70℃水浴10?min，中間搖勻3次，然后12?000?r·min-1離心10?min，取上清液過0.45?mm有機濾膜，收集濾液于液相瓶中，用于生物堿含量的測定。液相色譜測定條件參照J(rèn)in等[18]的方法。

1.3 RNA序列與差異基因分析

RNA提取與轉(zhuǎn)錄組測序均由北京諾禾致源科技有限公司完成，具體方法參見Liu等[19]方法，使用的參考基因組見文獻[20]。用DESeq2工具[21]進行差異基因的分析，將兩個樣品表達(dá)量差異大于等于兩倍（|log2(Fold change)|≥1）、-value <0.05定義為差異基因（DEG）。利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫，以整個基因組為背景，通過clusterProfile軟件對DEGs進行GO與KEGG富集分析。

1.4 差異轉(zhuǎn)錄因子鑒定

利用PlantTFDB（Plant transcription factor database）軟件[22]，對差異基因中的轉(zhuǎn)錄因子進行預(yù)測。用于預(yù)測的序列為差異基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基因序列，比對的參考物種為擬南芥。利用Excel對獲得的轉(zhuǎn)錄因子進行統(tǒng)計分析。

1.5 qRT-PCR驗證

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品中生物堿含量分析

由表2可知，GKC和LKC都含有較高的苦茶堿，分別為21.82?mg·g-1和14.70?mg·g-1，而常規(guī)茶樹YK10未檢測出苦茶堿；3個樣品中咖啡堿的含量趨勢與苦茶堿相反，高低依次為YK10>LKC>GKC，并且GKC和LKC均低于15.00?mg·g-1。GKC相比于LKC和YK10含有較高的可可堿，其含量超過10.00?mg·g-1。YK10生物堿總量最高為52.15?mg·g-1，LKC生物堿總量最低為27.29?mg·g-1。

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

本研究分別構(gòu)建了YK10、LKC和GKC的cDNA文庫，每個樣品重復(fù)3次，并進行轉(zhuǎn)錄組測序（表3）。3個樣品的平均測序錯誤率約為0.03%，分別測序獲得了41?518?584、43?661?820、43?933?787個原始reads，去除測序接頭和低質(zhì)量reads分別得到40?638?848、42?657?323、42?859?093個高質(zhì)量reads。另外，3個樣品的堿基百分比Q20超過97.93，而Q30超過93.99；GC含量為42.46%～43.17%。將高質(zhì)量reads與參考基因組比對，比對率超過81.27%。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測序獲得數(shù)據(jù)質(zhì)量好，并且與參考基因組比對率高，可以用于進一步的研究。

表1 熒光定量PCR引物序列

表2 3份樣品中嘌呤生物堿含量

注：每列中不同大寫字母表示樣品間化合物含量差異極顯著（

Note: Different capital letters within a column are highly significant difference at<0.01. ND: not detected

表3 測序質(zhì)量評估

2.3 差異基因分析

差異基因（DEGs）分析結(jié)果顯示（圖1），GKC與YK10（GKC vs YK10）相比有11?872個DEGs，其中5?647個基因上調(diào)，6?225個基因下調(diào)；LKC與YK10（LKC vs YK10）相比有10?514個DEG，其中上調(diào)和下調(diào)的基因數(shù)分別為5?011和5?503。其中在GKC vs YK10和LKC vs YK10表達(dá)趨勢一致的上調(diào)基因有1?374個，下調(diào)基因有2?574個。這些基因在GKC vs YK10和LKC vs YK10中表達(dá)趨勢一致，可能與苦茶中高苦茶堿的積累相關(guān)。

2.4 差異基因富集分析

對GKC vs YK10和LKC vs YK10中表達(dá)趨勢一致的3?948個DEGs進行GO和KEGG富集分析。GO富集分析的結(jié)果顯示，有1?393個差異基因被富集到了GO條目，一共注釋到1?048個GO條目，這些條目可以歸為分子功能、細(xì)胞組分和生物過程3個大的類別，其中富集差異基因最多的類別是生物過程，其次是分子功能。圖2-A顯示了每個類別前十個GO條目，其中主要富集的條目有碳氧裂解酶活性（Carbon-oxygen lyase activity）、鎂離子結(jié)合（Magnesium ion binding）、腺苷琥珀酸合酶活性（Adenylosuccinate synthase activity）、核黃素合酶復(fù)合物（Riboflavin synthase complex）和嘌呤核苷二磷酸代謝過程（Purine nucleoside bisphosphate metabolic process）。另外，在富集的條目中，還發(fā)現(xiàn)多個基因被富集到-腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶活性（-adenosylmethionine-dependent methyltransferase activity）和-甲基轉(zhuǎn)移酶活性（-methyltransferase activity），這些基因可能在茶樹嘌呤生物堿代謝中發(fā)揮著重要作用。

KEGG富集分析結(jié)果顯示（圖2-B），差異基因被富集到111個代謝通路，主要富集的代謝通路有黃酮類生物合成（Flavonoid biosynthesis）、嘌呤代謝（Purine metabolism）、磷酸戊糖途徑（Pentose phosphate pathway）和谷胱甘肽代謝（Glutathione metabolism）等。另外，還發(fā)現(xiàn)多個基因被富集到異喹啉生物堿的生物合成（Isoquinoline alkaloid biosynthesis）和托烷（Tropane）、哌啶（Piperidine）和吡啶生物堿（Pyridine alkaloid）的生物合成。

注：A：差異基因火山圖；B：上、下調(diào)表達(dá)基因的Venn圖

注：A：GO注釋；B：KEGG代謝通路

2.5 差異轉(zhuǎn)錄因子鑒定與表達(dá)量分析

轉(zhuǎn)錄因子是重要的調(diào)控因子，可以與功能基因的調(diào)控區(qū)域直接或間接結(jié)合，從而激活或抑制基因表達(dá)，進而調(diào)控多種生物學(xué)過程。通過植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（PlantTFDB）對獲得的3?948個差異基因中的轉(zhuǎn)錄因子基因進行鑒定，一共獲得96個編碼轉(zhuǎn)錄因子基因，這些轉(zhuǎn)錄因子屬于29個不同的家族（圖3）。轉(zhuǎn)錄因子家族包含差異基因數(shù)最多是bHLH（差異基因數(shù)13，占轉(zhuǎn)錄因子總數(shù)的比例13.54%），其次是MADS、MYB和FAR1，分別有9個差異基因。另外，bZIP、HD-ZIP、NF-YB、TCP和WRKY家族也包含多個轉(zhuǎn)錄因子基因。

鑒定到的96個轉(zhuǎn)錄因子基因，其中35個上調(diào)表達(dá)，61個下調(diào)表達(dá)（圖4）。這96個轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量（FPKM）在YK10、GKC或者LKC至少一個樣品中大于等于10的有30個。在這30個轉(zhuǎn)錄因子中，MYB（CSS0007879、CSS0031950、CSS0005261和CSS0012202）和NAC（CSS0012182、CSS0013789、CSS0041233和novel.16084）家族的基因最多，其次是MADS（CSS0037110、CSS0013985和CSS0034462）。另外，還包括bZIP（CSS0008967和novel.5903）、HD-ZIP（CSS0014547）和ZF-HD（CSS0043409）等家族基因。

2.6 qRT-PCR分析

為了驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，從篩選到的96個轉(zhuǎn)錄組因子基因中選取10個設(shè)計定量引物，并進行qRT-PCR分析。定量結(jié)果表明，基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致（圖5），說明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果是可靠的。

3 討論

苦茶是我國的特異茶樹資源，富含苦茶堿是其有別于常規(guī)茶樹最典型的生化特征。本研究對“國家大葉茶樹資源圃（勐海）”保存的兩份苦茶種質(zhì)進行生物堿的測定，發(fā)現(xiàn)它們均含有較高的苦茶堿，與金基強等[24]研究一致，常規(guī)茶樹YK10中并沒有檢測到苦茶堿，兩份苦茶種質(zhì)的咖啡堿含量均低于15?mg·g-1，并且苦茶堿的含量與咖啡堿的含量趨勢相反，這與Wang等[4]的研究結(jié)果一致，咖啡堿是苦茶堿合成的前體物，推測可能是咖啡堿在苦茶中部分轉(zhuǎn)化為苦茶堿所致。以往研究表明咖啡堿具有提神興奮的作用，但是敏感群體攝入大量咖啡堿會引起失眠等不良的生理反應(yīng)，而苦茶堿具有安神抗抑郁等生理功效[11-12]。因此，本研究中的含高、低咖啡堿的兩個茶樹種質(zhì)，可以作為后期苦茶堿提取的生物來源，也可以用于開發(fā)低咖啡堿高苦茶堿的功能性茶產(chǎn)品。

圖3 差異基因中不同轉(zhuǎn)錄因子統(tǒng)計分析

注：A：在GKC、LKC和YK10中的FPKM均小于10；B：在GKC、LKC和YK10至少有1個FPKM大于等于10

苦茶富含苦茶堿的內(nèi)在分子機制，一直是困擾茶葉研究者的重大問題，2020年，Zhang等[17]通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選鑒定到了苦茶堿合成酶基因（），并通過結(jié)構(gòu)分析，初步解析了CsTcS催化1,3,7-三甲基尿酸形成苦茶堿的機制。Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)普洱茶和苦茶均含有CsTcS的催化底物1,3,7-三甲基尿酸，并發(fā)現(xiàn)在普洱茶中表達(dá)量極低，不及苦茶中的萬分之一，因此推測苦茶中富含苦茶堿是因為在苦茶中高表達(dá)引起，我們的定量結(jié)果也同樣表明在苦茶中高表達(dá)，并且相比于LKC，在GKC中具有更高的表達(dá)量，說明的高表達(dá)可能與苦茶中富集苦茶堿相關(guān)。另外，多項研究還表明，嘌呤生物堿代謝途徑相關(guān)的多個基因在苦茶與常規(guī)茶樹中差異表達(dá)[4,16]，本研究也同樣發(fā)現(xiàn)嘌呤生物堿代謝等與苦茶堿代謝相關(guān)途徑中的基因差異表達(dá)（圖2）。以上研究說明苦茶堿的生物合成可能受到調(diào)控因子的影響。

以往的研究表明，多種調(diào)控因子可以影響基因的表達(dá)，其中轉(zhuǎn)錄因子是研究最多也是最為重要的一種[25]。通過轉(zhuǎn)錄組分析，本研究發(fā)現(xiàn)至少有屬于29個不同家族的96個轉(zhuǎn)錄因子基因在GKC、LKC和YK10間差異表達(dá)。對這96個轉(zhuǎn)錄因子基因進一步篩選，獲得30個候選基因（至少在1個樣品中的FPKM≥10），候選轉(zhuǎn)錄因子中有多個屬于NAC、HD-ZIP、bHLH、MADS和MYB等家族的基因（圖4）。劉平[26]通過酵母單雜篩選到3個屬于NAC和HD-ZIP家族的轉(zhuǎn)錄因子，推測它們可能參與調(diào)控茶樹嘌呤生物堿代謝關(guān)鍵氮甲基轉(zhuǎn)移酶基因（）?？弟暗萚27]發(fā)現(xiàn)沉默（HD-ZIP家族轉(zhuǎn)錄因子）基因，茶樹葉片愈傷組織中的基因出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，并且咖啡堿的含量顯著下降，推測可能通過調(diào)控影響茶樹咖啡堿的含量?？Х葔A是苦茶堿合成的前體物質(zhì)，NAC和HD-ZIP等轉(zhuǎn)錄因子影響咖啡堿的合成和積累，可以間接調(diào)控苦茶堿的合成。另外，茶樹中NMT家族不僅編碼區(qū)高度相似，其啟動子區(qū)也具有一定的相似性[8,28]，的啟動子上也可能具有NAC和HD-ZIP等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，并受相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。最終，本研究獲得的30個候選的轉(zhuǎn)錄因子，尤其是NAC和HD-ZIP家族基因很可能參與苦茶堿的代謝，這些轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)⑹窍乱徊窖芯靠嗖鑹A生物合成調(diào)控的重點。

圖5 qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

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The Screening and Identification of Key Transcription Factor Genes for Theacrine Metabolism

LIU Yufei1,2, PANG Dandan1,2, LI Youyong1,2, JIANG Huibing1,2, TIAN Yiping1,2,SUN Yunnan1,2, CHEN Linbo1,2*

1. Tea Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Menghai 666201, China; 2. Yunnan Provincial Key Laboratory of Tea Science, Menghai 666201, China

Kucha is a unique tea resource rich in theacrine (1,3,7,9-tetramethyluric acid) in southwest China. Theacrine has a variety of physiological activities such as sedation, hypnosis and antidepressant. Theacrine synthesis enzyme, the key gene for theacrine biosynthesis, had been cloned and studied. However, there were few reports on the regulation mechanism of theacrine metabolism. In order to obtain the transcription factors related to theacrine metabolism, kucha (GKC and LKC) and normal tea cultivar (YK10) were used as research materials. Purine alkaloid content and related gene expressions in the samples were detected by HPLC and RNA-seq, respectively. And the reliability of the transcriptome data were verified by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). The results show that the contents of theacrine in GKC and LKC were 21.82?mg·g-1and 14.70?mg·g-1, respectively, while the content of theacrine in YK10 was not detected. In addition, the caffeine contents of GKC and LKC were both lower than 15.00?mg·g-1. Based on RNA-seq, 3?948 differentially expressed genes (DEGs) had the consistent expression trends in GKC vs YK10 and LKC vs YK10. These DEGs included 96 transcription factors belonging to 29 families. Among them, 30 candidate transcription factors might be the key genes involved in the regulation of theacrine metabolism, especially NAC and HD-ZIP family transcription factors such as,,,and.

Kucha, theacrine, RNA-seq, transcription factor

S571.1

A

1000-369X(2022)01-041-10

2021-05-10

2021-06-20

國家自然科學(xué)基金（U20A2045、32060699）、云南省重大科技專項（202002AE320001）、財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、云南省茶學(xué)重點實驗室開放基金項目（2020YNCX004）

劉玉飛，男，研究實習(xí)員，主要從事茶樹資源改良研究，chaye18@163.com。*通信作者：chenlinbo2002@sina.com

（責(zé)任編輯：趙鋒）