杜 顏,李思盈,韓世博,艾云鶴
(東北農(nóng)業(yè)大學 資環(huán)學院,黑龍江 哈爾濱 150038)
傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)主要分硝化、反硝化兩個處理階段,硝化階段好氧,反硝化階段則被認為是嚴格的厭氧階段。直到20世紀70年代,J.M.Krul等人才首次證明了好氧反硝化反應(yīng)現(xiàn)象的存在。
因好氧反硝化可以在有氧條件下進行反硝化,故在脫氮工藝中可省去缺氧池,從而減少構(gòu)筑物,縮小占地空間,降低建設(shè)成本;其次,反硝化過程中會產(chǎn)生一定的堿度,可以與硝化過程中產(chǎn)生的酸中和,無需另外向反應(yīng)池中投加堿,節(jié)省了直接成本;再次好氧反硝化菌的繁殖周期短,反應(yīng)速度快,節(jié)省反應(yīng)步驟,縮短了反應(yīng)時間,減少了含氮化合物的逸出,為實際生產(chǎn)中的脫氮工藝拓展了思路,具有很好的應(yīng)用價值及廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。
本研究從活性污泥中篩選出了6株好氧反硝化細菌,對此6株菌進行了單株菌的反硝化性能研究,并將其中對各種環(huán)境適用性好的3株菌進行混合,進行了混合菌群的反硝化效果實驗,以期為好氧反硝化研究提供一定的幫助。
1.1.1 菌株來源
冬季從東北農(nóng)業(yè)大學生活污水處理廠取污水處理反應(yīng)器中的活性污泥若干,經(jīng)過馴化和篩選,得到好氧反硝化菌6株。
1.1.2 主要試劑及儀器
乙二胺二乙酸二鈉(哈爾濱市化工試劑廠);ZnSO4(天津市瑞金特有限公司);CaCl2(天津市致遠化學試劑有限公司);FeSO4(天津市恒星化學試劑有限公司);CoCl2(天津市化學試劑三廠)。以上試劑均為分析純。
T6型紫外可見分光光度計(普析儀器科技有限公司);SPX-150B型生化培養(yǎng)箱(上海博迅設(shè)備廠);BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅設(shè)備廠)。
1.1.3 培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基KNO31g、KH2PO41g,F(xiàn)eCl20.5g,CaCl20.02g,MgSO41g,琥珀酸鈉8.5g,用蒸餾水稀釋至1L。
BTB培養(yǎng)基 丁二酸鈉8.5 g,KNO31g,KH2PO41g,CaCl20.2g,MgSO41g,F(xiàn)eCl20.5g,1%溴百里酚藍溶液1mL,瓊脂20g,定容至1L,調(diào)節(jié)pH值至7.2。
乙酸鈉培養(yǎng)基 乙酸鈉2.16g,NaNO30.61g,K2HPO41.76g,MgSO40.20g,CaCl20.02g,F(xiàn)eSO40.005g,瓊脂18g,用蒸餾水稀釋至1L,調(diào)節(jié)pH值為7.2。
檸檬酸鈉培養(yǎng)基 檸檬酸鈉1.0g,KNO31.0g,KH2PO41.0g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05g,CaCl20.2g,MgSO41.0g,瓊脂18g,1%溴百里香酚藍1mL,用蒸餾水稀釋至1L,調(diào)節(jié)pH值為6.8。
1.1.4 其它試劑
微量元素溶液 乙二胺四乙酸50.0g(AR哈爾濱 市 化 工 試 劑 廠),ZnSO42.2g,CaCl25.5g,MnCl25.06g,F(xiàn)eSO45.0g,CuSO41.57g,CoCl21.01g。
模擬廢 水水樣 葡 萄 糖0.206g,(NH4)2SO40.235g,K2HPO40.1g,Na2HPO40.1g·L-1,MgSO40.1g,微量元素溶液1mL·L-1,1% Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O溶液1mL。
1.2.1 好氧反硝化菌的篩選
菌液的富集 取50mL活性污泥放于無菌三角瓶中,加入450mL的LB培養(yǎng)基,室溫下曝氣8h,轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱30℃、150r·min-1培養(yǎng)8h,再室溫下曝氣8h后,放置30min,取上清液進行篩選實驗。
好氧反硝化菌株的初篩 取富集好的菌液上清液1mL,稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6,將稀釋好的菌液各取1mL接種于BTB培養(yǎng)基上,培養(yǎng)1d后,挑取培養(yǎng)基周圍變?yōu)樗{色且生長情況良好的菌落,劃線接種于檸檬酸鈉培養(yǎng)基上,繼續(xù)培養(yǎng)1d,以相同方法挑取生長情況良好的菌落接種于乙酸鈉培養(yǎng)基繼續(xù)純化培養(yǎng)1d,選取生長情況良好的菌落作為目的菌[4]。
好氧反硝化菌株的復(fù)篩 挑取目的菌加入無菌水,制成菌懸液,紫外分光光度計測定OD600,加入模擬廢水水樣、微量元素溶液,30℃培養(yǎng)1d,測定NO3-N去除率。
1.2.2 菌株的觀察及簡單鑒定 將分離、純化好的菌株接種于檸檬酸鈉培養(yǎng)基上,24h后觀察其個體形態(tài)、菌落形態(tài),并進行革蘭式染色鑒定。
1.2.3 菌株的脫氮特性研究 采用固定單因素法研究碳源、C/N比、pH值、接種量、溫度等影響因素對好氧反硝化作用的影響。
1.2.4 好氧反硝化菌群的脫氮性能研究 將篩選出來的6株菌等比例混合,在單菌株確定的最佳工藝條件下,測定其脫氮性能。
式中C1:反應(yīng)前NO3-N的含量,mg·L-1;C2:反應(yīng)后NO3-N的含量,mg·L-1。
1.2.5 分析鑒定方法 本實驗中硝酸鹽-采用水質(zhì)硝酸鹽氮的測定紫外分光光度法(HJ/T 346-2007)進行測定。
經(jīng)過好氧反硝化菌的富集篩選、分離純化,最終得到去除NO3-N效果良好的6株菌,分別命名為DN-1、DN-2、DN-3、DN-4、DN-5、DN-6,菌落特征見表1。
表1 細菌分離篩選結(jié)果Tab.1 Results of bacterial isolation and screening
由表1可見,篩選出的優(yōu)勢菌均為革蘭氏陰氏菌,其中5株菌為短桿菌,1株菌為球菌。
2.2.1 不同碳源對NO3-N去除率的影響 為保證好氧反硝化菌的正常生長及脫氮作用的正常進行,在反應(yīng)過程中需要提供一定的碳源,因此,最佳碳源和C/N比的選擇對反應(yīng)尤為重要。本研究分別選擇了乙酸鈉、葡萄糖、檸檬酸鈉3種有機物為碳源,以5%的接種量,在反應(yīng)溫度30℃,150r·min-1下培養(yǎng)48h,考察了不同碳源對NO3-N去除率的影響,結(jié)果見圖1。
圖1 不同碳源對NO3-N去除率的影響Fig.1 Influence of different carbon sources for nitrate-N removal rate
由圖1可知,不同碳源下DN-1、DN-2、DN-5這3株菌的NO3-N去除率由低到高的順序是乙酸鈉<葡萄糖<檸檬酸鈉,DN-3、DN-4兩株菌的NO3-N去除率由低到高的順序是乙酸鈉<檸檬酸鈉<葡萄糖,DN-6的NO3-N去除率由低到高的順序是葡萄糖<檸檬酸鈉<乙酸鈉,其中DN-1、DN-2、DN-3 3株菌當檸檬酸鈉為唯一碳源時的去除效果更加明顯,而DN-3、DN-4、DN-6這3株菌雖然檸檬酸鈉為碳源時去除率不是最大的,但也只是略低于其去除率最高的碳源。在6株菌中只有DN-6對3種碳源都有很好的利用率,而其它5株菌對乙酸鈉的利用率均不高。綜合以上原因,后續(xù)實驗中均以檸檬酸鈉為唯一碳源進行測定。
2.2.2 不同C/N比對NO3-N去除率的影響 選擇檸檬酸鈉為唯一碳源,以5%的接種量,反應(yīng)溫度30℃,150r·min-1下培養(yǎng)48h,考察了C/N比為4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1時,NO3-N去除率的情況,結(jié)果見圖2。
圖2 不同C/N比對NO3-N去除率的影響Fig.2 Effect of different C/N ratio on NO3-N removal rate
由圖2可見,DN-1、DN-3、DN-4、DN-6這4株菌NO3-N去除率的變化趨勢均是隨著C/N比的增加,去除率逐漸升高而后下降,這4株菌的最佳C/N比分別為8∶1、12∶1、8∶1、8∶1,DN-2菌株對NO3-N去除率隨著C/N比的增加而上升,C/N比為16∶1和20∶1去除效果比較接近,C/N比為20∶1時去除率最高,而DN-5菌株對NO3-N去除率隨著C/N比的增加而下降,去除效果最好的是C/N比為4∶1,即該種菌的C/N比最低。在好氧反硝化反應(yīng)過程中,C/N比過低,能源不足,提供的電子流小,影響了菌體生長,降低了反硝化效果,但C/N比過高,不僅資源浪費,而且過高的C/N比還會影響反硝化的效果[5],故C/N比過低或過高均不適合脫氮效率的提高,綜合考慮以上因素,將本實驗的C/N比定為8∶1。
2.2.3 不同pH值對NO3-N去除率的影響 選擇檸檬酸鈉為唯一碳源,C/N比為8∶1,以5%的接種量,反應(yīng)溫度30℃,150r·min-1下培養(yǎng)48h,考察了pH值為5、6、7、8、9時,NO3-N去除率的情況,結(jié)果見圖3。
圖3 不同pH值對NO3-N去除率的影響Fig.3 Effect of different pH ratio on NO3-N removal rate
由圖3可見,DN-1、DN-2、DN-3、DN-4、DN-6這5株菌NO3-N去除率的變化趨勢均是隨著pH值的增加,去除率逐漸升高而后略有下降,DN-1、DN-2、DN-3、DN-4這4株菌的最佳pH值為8,DN-6在pH值為7時去除率最高,為98.6%,DN-5的情況較為特殊,隨著pH值的增加,去除率一直增加,在pH值為8和9時,去除率相同,均為95.6%。在此6株菌中,DN-3、DN-6兩株菌的pH值適用范圍最寬,在pH值為5時,去除率可達到86%以上,在pH值為9時,去除率更是達到95.6%以上??傮w來說,這6株菌均在pH值為7~9處有最佳去除率。酸度過高或者過低不利于大多數(shù)菌的生長,這主要是因為pH值變化時,影響了微生物中酶的活性,改變了微生物的電解質(zhì)平衡,從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取能力,故不利于其生長[6]。此結(jié)果也說明,篩選出的好氧反硝化菌在中性偏弱堿性的環(huán)境中更易去除NO3-N。綜合考慮以上因素,將本實驗的最佳pH值定為8。
2.2.4 不同溫度對NO3-N去除率的影響 選擇檸檬酸鈉為唯一碳源,C/N比為8∶1,以5%的接種量,pH值為8,150r·min-1下培養(yǎng)48h,考察了反應(yīng)溫度為15、20、30℃時,NO3-N去除率的情況,結(jié)果見圖4。
圖4 不同溫度對NO3-N去除率的影響Fig.4 Effect of different temperatures on NO3-N removal rate
由圖4可知,6株菌NO3-N去除率的變化趨勢均是隨著溫度的增加逐漸升高,當溫度由15℃升高到30℃時,DN-4和DN-5兩株菌的NO3-N去除率受溫度影響變化比較大,去除率分別增加了10.97%和11.31%,而DN-2和DN-6兩株菌的NO3-N去除率受溫度影響比較小,當溫度由15℃升高到30℃時,去除率分別增加了2.09%和2.79%。結(jié)果表明,升高溫度對于NO3-N的去除有一定的效果,但相對來說,篩選出的菌株在15~30℃,均能保持比較高的活性,這與取樣的季節(jié)為冬季,水體溫度較低,菌株已受到一定的自然馴化不無關(guān)系。
2.2.5 不同接種量對NO3-N去除率的影響 選擇檸檬酸鈉為唯一碳源,C/N比為8∶1,溫度為30℃,pH值為8,150r·min-1下培養(yǎng)48h,考察了接種量為2%、5%、7%和10%時,NO3-N去除率的情況,結(jié)果見圖5。
由圖5可見,DN-1、DN-2、DN-3、DN-4、DN-6這5株菌NO3-N去除率的變化趨勢均是隨著接種量的增加,去除率逐漸升高而后略有下降,其最佳接種量分別為7%、5%、7%、5%、7%,只有DN-2在2%處即達到最大去除率97.37%,繼續(xù)增加接種量,其去除率反而下降。出現(xiàn)上述情況的原因是,如果在反應(yīng)過程中接種量不足,菌的數(shù)量少,會達不到脫氮的預(yù)期效果;而接種量過大,則會引起競爭現(xiàn)象,營養(yǎng)物質(zhì)不足,使部分細菌死亡[7]。所以,選擇適量的接種量,對于脫氮的效果很關(guān)鍵??紤]到在接種量為2%時,6株菌的去除率均已達到93%以上,故工藝最佳接種量定為2%。
圖5 不同接種量對NO3-N去除率的影響Fig.5 Effect of different inoculation amount on NO3-N removal rate
2.2.6 好氧反硝化菌群的脫氮特性研究 依據(jù)上述實驗研究結(jié)果,選擇各種碳源利用高并且溫度、pH值適用范圍廣的DN-6,C/N比需求最低的DN-5,和在最小接種量下NO3-N去除率仍可達97.4%的DN-2,以相同比例將3株菌混合組成好氧反硝化菌群,選擇檸檬酸鈉為唯一碳源,C/N比為4∶1,溫度為30℃,pH值為8,接種量為2%,150r·min-1下培養(yǎng)48h后,進行NO3-N去除率的情況研究,復(fù)合菌與單株菌的NO3-N去除率的對比見圖6。
由圖6可知,復(fù)合菌群的NO3-N的去除率達98.6%,好于任何一株單株菌。主要的原因是在混合菌群中,各種菌的共存和相互作用產(chǎn)生了群體感應(yīng)、互利共生等作用,使混合菌的脫氮能力有了一定程度的提高。另外,在實際水處理過程中,水質(zhì)成分一般比較復(fù)雜,單株菌的降解能力有限,利用菌群中各種菌的協(xié)同作用,會對脫氮性能有很大的提高[8-11]。
本研究篩選分離得到了6株好氧反硝化細菌,并選擇其中適用性好的3株菌組成復(fù)合菌群,結(jié)論如下:
(1)篩選得到的6株菌均在檸檬酸鈉為碳源的情況下有較好的脫氮效果,DN-6對3種碳源都有很好的利用率。
(2)C/N比為8∶1時,6株菌的脫氮效果綜合考慮比較理想。
(3)溫度高對于脫氮有利,相對來說,6菌株適用的溫度范圍比較大。
(4)將篩選出的3株菌制成復(fù)合菌群,效果明顯好于單株菌。
實驗表明,選擇好氧反硝化菌群更有利于脫氮效果的提高,在實際應(yīng)用中,由于其適應(yīng)能力更強,將具有更好的應(yīng)用價值。