陳俊輝，石永強

(江蘇省南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院溧水分院消化科，江蘇 溧水 211200)

胃癌是臨床上最常見的消化道惡性腫瘤，我國是胃癌的高發(fā)區(qū)之一，其發(fā)病率、死亡率均較世界平均水平高2倍[1]。調(diào)查顯示，我國胃癌發(fā)病率、死亡率高居惡性腫瘤的第2位、第3位，而且呈年輕化趨勢。早期胃癌經(jīng)根治性治療后的5年生存率可高于90%，但由于胃癌早期無特異性癥狀、胃鏡常規(guī)體檢未普及、相關(guān)知識缺乏等諸多因素，大于80%胃癌患者確診時已達進展期，預(yù)后極差[2]。因此，積極探索胃癌生物學(xué)特性及其分子機制，并尋找可能的評價胃癌診斷及預(yù)后，或潛在的治療靶點的分子標志物具有重要臨床價值。長鏈非編碼RNA( long non-coding RNA，lnc RNA)指長度超過200 nt的非編碼RNA，可以在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點之一。研究顯示，Lnc RNA 在胃癌的生物學(xué)活性中扮演多重角色，可能成為評價胃癌診斷及預(yù)后的標志物或治療的靶點[3]。Lnc RNA結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(colon cancer associated transcript 2,CCAT2)在多種惡性腫瘤中異常高表達，被認為是一種促癌因子[4]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 可調(diào)控自噬而影響疾病進程[5]。目前，CCAT2與胃癌自噬的相關(guān)文獻較少，故本研究采用實時熒光定量 PCR( Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測胃癌組織中CCAT2、自噬相關(guān)基因Beclin1和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)mRNA的表達水平，并探討 CCAT2 與胃癌臨床特征及自噬的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料：收集本院2016年1月～2018年12月在南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院診治的胃癌患者40例。納入標準：經(jīng)病理診斷為胃癌，采用美國癌癥聯(lián)合委員會( AJCC)臨床分期標準[6]：年齡30～70歲，男女不限；術(shù)前均未接受放化療等抗腫瘤治療；臨床相關(guān)資料完整；知情同意。排除標準：胃良性腫瘤；合并其他器官惡性腫瘤。其中男24例，女16例，平均年齡65.42歲；TNM 分期:Ⅰ期5例，Ⅱ期13例，Ⅲ期19例，Ⅳ期3例；分化程度：低分化15例，高中分化25例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2標本采集：將手術(shù)所取癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)加入RNA- later保護液，-80℃冰箱凍存?zhèn)錂z。

1.3qRT-PCR法檢測CCAT2、Beclin1、LC3mRNA：取1 mm3組織標本，剪碎并加入裂解液研磨，采用Trizol法提取總RNA。離心取上清液，采用OD260/280分光光度法觀察每個RNA 樣品的純度。取1 μg總RNA采用 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒完成cDNA合成。以cDNA為模板，CCAT2 引物參考文獻[7]進行設(shè)計，Beclin1和LC3引物參考文獻[8]進行設(shè)計，以GAPDH 為內(nèi)參照。采用兩步法標準PCR擴增程序： 第一步即預(yù)變性，95℃ 30 s，1個循環(huán);第二步即PCR反應(yīng)，95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，采用 2-ΔΔCt法計算目標基因的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1胃癌組織中的CCAT2、Beclin1、LC3的表達情況：胃癌組織中CCAT2 mRNA 2.84±0.72顯著高于癌旁正常組織的1.63±0.51，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=，P=0.000)；胃癌組織中Beclin1 mRNA(0.28±0.02)顯著低于癌旁正常組織1.47±0.13，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=，P=0.000)；胃癌組織中LC3 mRNA 0.47±0.05，顯著低于癌旁正常組織的1.36±1.11，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=，P=0.000)。

2.2CCAT2、Beclin1、LC3的表達與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性：胃癌組織中的CCAT2 表達與胃癌直徑大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、胃癌分化程度、侵犯深度等因素無關(guān)(P>0.05)。Beclin1表達與胃癌直徑大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、胃癌分化程度、侵犯深度等因素無關(guān)(P>0.05)。LC3表達與胃癌直徑大小、TNM分期、分化程度明顯相關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯深度等因素無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 胃癌組織中CCAT2、Beclin1、LC3表達和臨床病理特征的關(guān)系

2.3胃癌組織中CCAT2、Beclin1、LC3表達的相關(guān)性分析：胃癌組的CCAT2水平與Beclin1、LC3水平呈明顯負相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(r=-0.674，0.513，均P<0.05)。

3 討論

CCAT2作為一種新的致癌LncRNA，該基因定位于富含調(diào)控元件標記物的高度保守的8q24基因組區(qū)域；最初被發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中呈現(xiàn)高表達，而在正常結(jié)腸組織中呈低表達；后越來越多的研究證實，CCAT2在非小細胞肺癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、食管癌、肝癌等多種腫瘤組織中存在異常高表達，并與腫瘤進展及不良預(yù)后有關(guān)，提示CCAT2可能作為一種新的腫瘤標志物[9-13]。 研究發(fā)現(xiàn)，敲除CCAT2基因可誘導(dǎo)癌細胞凋亡，抑制癌細胞增殖及侵襲，提示CCAT2可能作為一種新的腫瘤治療靶點[14]。而國內(nèi)關(guān)于CCAT2在胃癌中表達情況的報道不多，故探討CCAT2 在胃癌中表達情況及與臨床特征的相關(guān)性具有的重要臨床價值。

本研究結(jié)果顯示，CCAT2胃癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織。有研究顯示，CCAT2在胃癌患者血清中呈高表達[15]。上述結(jié)果提示，CCAT2 作為致癌因素在胃癌中發(fā)揮重要作用，可能成為一種新的胃癌腫瘤標志物。本研究結(jié)果顯示，CCAT2 表達水平與胃癌直徑大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，而與年齡、性別、胃癌分化程度、侵犯深度等因素無關(guān)。與余招焱等研究結(jié)果一致[16]。上述結(jié)果提示，CCAT2的高表達可能促進胃癌細胞的增殖、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，可能成為一種新的胃癌治療靶點。

自噬是腫瘤細胞的發(fā)生程序性死亡的一種主要形式，也是目前腫瘤相關(guān)基礎(chǔ)及臨床研究的熱點之一[17]。Beclin1作為自噬核心復(fù)合物的重要組成部分，在維持自噬活性中起到重要作用，是調(diào)節(jié)腫瘤自噬活性的關(guān)鍵因素之一[18]。研究發(fā)現(xiàn)，Beclin1能通過激活自噬過程從而抑制腫瘤的發(fā)生；反之，干擾Beclin1的生物活性使得腫瘤的自噬水平降低[19]。LC3作為編碼自噬相關(guān)蛋白的重要基因之一，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成，是公認的自噬體特異性標記蛋白[20]。所以檢測Beclin1、LC3的表達水平可反映自噬水平。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中Beclin1、LC3呈低表達，反映胃癌中自噬水平降低，與羅小月等研究結(jié)果一致[21]。本研究結(jié)果顯示，Beclin1、LC3表達水平均與胃癌直徑大小、TNM分期有關(guān)，提示自噬水平降低可能促進腫瘤進展。相關(guān)分析結(jié)果顯示，CCAT2表達水平與Beclin1、LC3表達水平呈負相關(guān)關(guān)系，提示CCAT2可能通過降低胃癌細胞自噬活性，進而促進胃癌細胞的增殖及轉(zhuǎn)移。自噬對胃癌細胞起著促進和抑制的雙重作用，在特定情況下自噬導(dǎo)致胃癌細胞存活亦或死亡仍存在爭議[22]。目前關(guān)于CCAT2 上游及下游基因的調(diào)控及具體致癌機制尚未完全闡明。研究顯示，CCAT2可能通過 PTEN/PI3K/AKT、Wnt /β-catenin等信號通路發(fā)揮致癌作用[23]。而在不同影響因素條件下，不同信號通路作用下，CCAT2調(diào)控自噬的過程并不十分清楚，還有許多細節(jié)需要進一步研究。

綜上所述，CCAT2在胃癌組織中表達異常增高，并與胃癌直徑大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；CCAT2與Beclin1、LC3呈負相關(guān)關(guān)系，提示CCAT2 在胃癌中發(fā)揮促癌作用，其機制可能與抑制胃癌細胞自噬有關(guān)。