肖語童，肖如紅

(1.岳陽市一人民醫(yī)院電生理科，湖南 岳陽 414000;2.岳陽市一人民醫(yī)院麻醉科，湖南 岳陽 414000)

膿毒癥是一種是由感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，可發(fā)展為感染性休克和多器官功能障礙綜合征，可危及生命。炎性細(xì)胞的活化和大量炎性介質(zhì)的產(chǎn)生導(dǎo)致膿毒癥發(fā)病過程中多器官的損傷，功能障礙甚至衰竭[1]。具體來說，各種研究表明膿毒癥患者的不良癥狀與心肌功能障礙的發(fā)生密切相關(guān)，其中約50%的膿毒癥患者表現(xiàn)出心肌功能障礙[2]。此外，同時(shí)患有膿毒癥和心功能不全的患者死亡率從20%～30%顯著增加到70%～90%[3]。因此，針對心功能不全和心臟損傷可能是預(yù)防和治療膿毒癥的一種新策略。

紫檀芪(PTS)是一種與白藜蘆醇結(jié)構(gòu)類似的抗毒性物質(zhì)，主要存在于藍(lán)莓、葡萄和花生等植物中。近年來報(bào)道表明，PTS具有多種生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗衰老和抗病毒活性等[4]。此外，PTS還能介導(dǎo)細(xì)胞周期、凋亡和增殖[5]。然而，PTS在膿毒癥中的作用，尤其是PTS控制交感神經(jīng)過度刺激對膿毒癥期間心臟動(dòng)作電位的影響尚未見報(bào)道。為此，本研究擬探討PTS在膿毒癥致大鼠心肌損傷中的作用，并初步探討其可能作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料：無特異性病原體(SPF)雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200～250 g，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證書編號：44002100014706)，飼養(yǎng)于中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大鼠可以自由獲取食物和水，并在室溫和50%～65%相對濕度下保持12 h的光/暗循環(huán)。PTS(純度99%)購自上海義森生物科技有限公司；TNF-α、IL-6、IgE測定試劑盒(ELISA)購自美國Pierce公司；CK-MB測定試劑盒(ELISA)購自美國Abcam公司。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2膿毒癥模型及分組：大鼠被隨機(jī)分成三組(n=10)：假手術(shù)組、膿毒癥組和PTS組。膿毒癥組和PTS組大鼠均行盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)誘導(dǎo)盲腸壞死膿毒癥模型[6]。大鼠禁食12 h后腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)用于手術(shù)前麻醉，常規(guī)消毒后沿腹中線做2 cm切口，在盲腸總長度一半的距離處，用18號注射針頭在腸系膜緣和系膜對側(cè)緣方向各穿孔1次，然后輕輕按壓盲腸，腸內(nèi)容物被輕輕壓入腹腔，恢復(fù)盲腸正常解剖部位，逐層縫合切口，立即皮下注射無菌生理鹽水(3 ml/100 g)以補(bǔ)償體液流失。假手術(shù)組大鼠進(jìn)腹定位盲腸后，但未穿孔盲腸。

手術(shù)前30 min，PTS組大鼠接受PTS腹腔注射(25 mg/kg)1次，假手術(shù)組和膿毒癥組大鼠腹腔注射等量的無菌生理鹽水，每6小時(shí)監(jiān)測一次，連續(xù)觀察24 h。24 h后通過腹腔注射戊巴比妥對所有存活大鼠實(shí)施安樂死，隨后采集血液，分離和冷凍血清，并固定左心室標(biāo)本進(jìn)行下一步檢測。

1.3心室動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間檢查：使用1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠。打開胸腔取出心臟，用Langendorff灌注液(NaCl 118.5 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，葡萄糖11 g，pH=7.4)進(jìn)行心臟灌注。以1.5 ml/min的速度灌注心臟30 min，吸附電極分別貼于大鼠心房和心室表面。應(yīng)用錦江電子LEAD-2000電生理儀(四川錦江電子科技有限公司)記錄心房和心室局部組織的動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間，記錄心臟灌注指標(biāo)，包括心率、心房、心室動(dòng)作電位時(shí)間。在此過程中，溫度控制在37℃以下，并使用5%CO2和95%O2的混合氣體持續(xù)通氣。

1.4組織病理學(xué)觀察和心肌損傷評分(MDS)：標(biāo)本從左心室長軸垂直心尖連續(xù)切割。然后，將組織固定于4%多聚甲醛溶液中，對每個(gè)組織樣本進(jìn)行石蠟包埋，5 μm切片后使用蘇木精/伊紅染色，乙醇梯度脫水封閉后進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。心肌損傷的嚴(yán)重程度根據(jù)半定量量表進(jìn)行評估和分級，包括水腫、中性粒細(xì)胞浸潤、出血和肌原纖維分布[7]。由兩位對分組情況不詳?shù)牟±韺W(xué)專家進(jìn)行描述，嚴(yán)重程度表示為MDS。

1.5檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、CK-MB以及IgE含量：按照相應(yīng)ELISA檢測試劑盒的操作說明分別檢測血清中TNF-α、IL-6、CK-MB以及IgE含量。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠一般情況：在CLP手術(shù)后6～8 h，存活大鼠均出現(xiàn)不同程度的膿毒癥癥狀，如活動(dòng)障礙、毛發(fā)豎立、呼吸短促、結(jié)膜下滲出和腹瀉等。假手術(shù)組大鼠只表現(xiàn)出活動(dòng)和進(jìn)食減少，在6～12 h內(nèi)恢復(fù)。假手術(shù)組大鼠全部存活，膿毒癥組和PTS組分別有7只和8只存活至CLP術(shù)后24 h。

2.2心肌組織病理學(xué)觀察及心肌損傷評分(MDS)半定量分析：對三組大鼠心肌組織進(jìn)行病理學(xué)檢測，假手術(shù)組大鼠心肌組織經(jīng)蘇木精/伊紅染色后肌肉組織呈多邊形粉紅色纖維，肌肉纖維排列整齊緊湊，少有炎性細(xì)胞浸潤。CLP術(shù)后24 h，膿毒癥組大鼠心肌組織在鏡下出現(xiàn)明顯改變，肌肉組織排列紊亂，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞間隙增寬。PTS治療可部分改善CLP后導(dǎo)致的病理改變，肌肉纖維排列相對規(guī)律，細(xì)胞間水腫和出血減輕，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。見圖1A。半定量分析各組MDS結(jié)果表明，膿毒癥組MDS評分高于假手術(shù)組，而PTS治療后顯著降低MDS評分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1B。

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.05，與PTS組比較,②P<0.05圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)表現(xiàn)及MDS評分

2.3PTS對膿毒癥大鼠心肌動(dòng)作電位的影響：各組大鼠心電圖數(shù)據(jù)，見圖2A。膿毒癥組大鼠心率較假手術(shù)組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PTS對心率有改善作用，與膿毒癥組相比，PTS組心率明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2B。假手術(shù)組心房和心室動(dòng)作電位時(shí)間明顯短于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2C。PTS組心房和心室動(dòng)作電位時(shí)間均明顯長于CLP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2D。然而，P、PR和QRS電位時(shí)間在PTS治療前后無明顯改變。

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.05，與PTS組比較，②P<0.05圖2 各組大鼠心電圖、心率、心肌心房及心室組織動(dòng)作電位時(shí)間指數(shù)比較

2.4PTS可顯著降低CLP誘導(dǎo)的血清TNF-α、IL-6、CK-MB以及IgE水平：與假手術(shù)組大鼠相比，膿毒癥組大鼠CLP術(shù)后24 h血清中TNF-α、IL-6、CK-MB以及IgE的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而PTS治療后血清中TNF-α、IL-6、CK-MB以及IgE的含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

注：與假手術(shù)組相比,①P<0.05，與PTS組相比,②P<0.05圖3 ELISA法測定各組大鼠血清TNF-α、IL-6、CK-MB及IgE含量

3 討論

嚴(yán)重的膿毒癥/感染性休克嚴(yán)重威脅著人們的生命和健康，仍然是一種死亡率高、病理生理學(xué)復(fù)雜的臨床疾病。本研究建立大鼠膿毒癥模型，觀察PTS對膿毒癥大鼠心肌功能的影響，結(jié)果表明PTS可減輕炎性反應(yīng)以及調(diào)節(jié)心肌動(dòng)作電位，從而表明，PTS可通過抑制膿毒癥模型大鼠的炎性反應(yīng)和調(diào)節(jié)心臟動(dòng)作電位來抑制膿毒癥。

CLP作為當(dāng)前公認(rèn)的大鼠膿毒癥的金標(biāo)準(zhǔn)模型制作方法[8]，膿毒癥早期，機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)大量復(fù)雜的炎性因子，這些因子相互作用形成炎性反應(yīng)瀑布效應(yīng)，導(dǎo)致各種組織器官的損傷和功能障礙[9]。在本研究中，膿毒癥模型表現(xiàn)出多種特征，包括動(dòng)物行為、存活率、生理生化指標(biāo)、器官超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞因子水平，表明本研究CLP膿毒癥模型的建立是成功的，與已發(fā)表論文的動(dòng)物模型在細(xì)胞因子水平、臟器功能失調(diào)、超微結(jié)構(gòu)和動(dòng)物行為等方面是一致的[10]。具體而言，膿毒癥組血清TNF-α和IL-6水平顯著高于假手術(shù)組，這與臨床和實(shí)驗(yàn)研究中膿毒癥的促炎細(xì)胞因子風(fēng)暴表型一致。當(dāng)前對PTS的抗炎作用已有較為深入的研究[4]，但PTS是否通過抗炎作用從而保護(hù)膿毒癥大鼠心肌功能尚未見報(bào)道。在本研究中，PTS可降低全身促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，同時(shí)在顯微鏡下觀察到PTS可明顯抑制炎性細(xì)胞在肌肉組織中浸潤。此外，CLP術(shù)后大鼠心肌結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，并觀察到不可逆的結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)伴隨著血清中CK-MB的含量增高，CK-MB能特異反映心肌損傷，這與鏡下觀察到的心肌組織改變相吻合，PTS作用后可顯著下調(diào)血清中CK-MB水平。

本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥組血清IgE水平明顯高于假手術(shù)組，與以往研究中IgE也參與炎性反應(yīng)一致[11]，說明膿毒癥的炎性反應(yīng)涉及多種炎性細(xì)胞和細(xì)胞成分，在不同的環(huán)節(jié)發(fā)揮著重要的作用。以往的研究中沒有觀察到IgE的原因可能有以下幾點(diǎn)：一方面，IgE水平很低，常規(guī)方法很難檢測到；另一方面，IgE在膿毒癥中的作用往往被忽視。如當(dāng)細(xì)菌和病毒侵入支氣管上皮細(xì)胞造成損傷時(shí)，上皮細(xì)胞可產(chǎn)生IL-33，作用于肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和成熟，這些細(xì)胞產(chǎn)生更多的炎性因子，從而增加IgE的表達(dá)。胃腸黏膜也可能表現(xiàn)出IgE的增加，導(dǎo)致炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展和惡化。目前的研究結(jié)果表明，血清IgE水平可引起不同組織器官的炎性免疫反應(yīng)，不僅是I型超敏反應(yīng)，而且是免疫抑制性膿毒癥所致心肌損傷的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)[12]。因此，IgE也可以作為膿毒癥的一個(gè)新的生物標(biāo)志物。在本研究中，PTS治療后，明顯緩解心肌損傷，同時(shí)膿毒癥期間上調(diào)的IgE水平也得以下調(diào)。

在本研究中，膿毒癥組的心率、心房和心室動(dòng)作電位均出現(xiàn)明顯異常，炎性反應(yīng)與抗炎之間的不平衡，免疫功能紊亂，膽堿能抗炎系統(tǒng)激活，迷走神經(jīng)傳入感覺，炎性反應(yīng)信號從中樞傳遞到腦干，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中進(jìn)一步處理，動(dòng)作電位通過傳出迷走神經(jīng)傳出，傳出迷走神經(jīng)對紊亂狀態(tài)進(jìn)行炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)，從而降低心率，延長心房和心室動(dòng)作電位時(shí)間。而PTS可明顯緩解迷走神經(jīng)的抗炎作用，從而調(diào)節(jié)心率和房室動(dòng)作電位異常。

總之，PTS通過抑制膿毒癥模型大鼠的炎性反應(yīng)和調(diào)節(jié)心臟動(dòng)作電位來抑制膿毒癥，從而證實(shí)了PTS在膿毒癥中的心肌保護(hù)作用及其可能相關(guān)機(jī)制，為膿毒癥的防治提供了新的思路。