肖語童,肖如紅
(1.岳陽市一人民醫(yī)院電生理科,湖南 岳陽 414000;2.岳陽市一人民醫(yī)院麻醉科,湖南 岳陽 414000)
膿毒癥是一種是由感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征,可發(fā)展為感染性休克和多器官功能障礙綜合征,可危及生命。炎性細(xì)胞的活化和大量炎性介質(zhì)的產(chǎn)生導(dǎo)致膿毒癥發(fā)病過程中多器官的損傷,功能障礙甚至衰竭[1]。具體來說,各種研究表明膿毒癥患者的不良癥狀與心肌功能障礙的發(fā)生密切相關(guān),其中約50%的膿毒癥患者表現(xiàn)出心肌功能障礙[2]。此外,同時(shí)患有膿毒癥和心功能不全的患者死亡率從20%~30%顯著增加到70%~90%[3]。因此,針對心功能不全和心臟損傷可能是預(yù)防和治療膿毒癥的一種新策略。
紫檀芪(PTS)是一種與白藜蘆醇結(jié)構(gòu)類似的抗毒性物質(zhì),主要存在于藍(lán)莓、葡萄和花生等植物中。近年來報(bào)道表明,PTS具有多種生物活性,包括抗炎、抗氧化、抗衰老和抗病毒活性等[4]。此外,PTS還能介導(dǎo)細(xì)胞周期、凋亡和增殖[5]。然而,PTS在膿毒癥中的作用,尤其是PTS控制交感神經(jīng)過度刺激對膿毒癥期間心臟動(dòng)作電位的影響尚未見報(bào)道。為此,本研究擬探討PTS在膿毒癥致大鼠心肌損傷中的作用,并初步探討其可能作用機(jī)制。
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料:無特異性病原體(SPF)雄性Sprague-Dawley大鼠,體重200~250 g,購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證書編號:44002100014706),飼養(yǎng)于中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,大鼠可以自由獲取食物和水,并在室溫和50%~65%相對濕度下保持12 h的光/暗循環(huán)。PTS(純度99%)購自上海義森生物科技有限公司;TNF-α、IL-6、IgE測定試劑盒(ELISA)購自美國Pierce公司;CK-MB測定試劑盒(ELISA)購自美國Abcam公司。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。
1.2膿毒癥模型及分組:大鼠被隨機(jī)分成三組(n=10):假手術(shù)組、膿毒癥組和PTS組。膿毒癥組和PTS組大鼠均行盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)誘導(dǎo)盲腸壞死膿毒癥模型[6]。大鼠禁食12 h后腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)用于手術(shù)前麻醉,常規(guī)消毒后沿腹中線做2 cm切口,在盲腸總長度一半的距離處,用18號注射針頭在腸系膜緣和系膜對側(cè)緣方向各穿孔1次,然后輕輕按壓盲腸,腸內(nèi)容物被輕輕壓入腹腔,恢復(fù)盲腸正常解剖部位,逐層縫合切口,立即皮下注射無菌生理鹽水(3 ml/100 g)以補(bǔ)償體液流失。假手術(shù)組大鼠進(jìn)腹定位盲腸后,但未穿孔盲腸。
手術(shù)前30 min,PTS組大鼠接受PTS腹腔注射(25 mg/kg)1次,假手術(shù)組和膿毒癥組大鼠腹腔注射等量的無菌生理鹽水,每6小時(shí)監(jiān)測一次,連續(xù)觀察24 h。24 h后通過腹腔注射戊巴比妥對所有存活大鼠實(shí)施安樂死,隨后采集血液,分離和冷凍血清,并固定左心室標(biāo)本進(jìn)行下一步檢測。
1.3心室動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間檢查:使用1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠。打開胸腔取出心臟,用Langendorff灌注液(NaCl 118.5 mmol/L,KCl 4.7 mmol/L,CaCl22.5 mmol/L,NaHCO325 mmol/L,MgSO41.2 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,葡萄糖11 g,pH=7.4)進(jìn)行心臟灌注。以1.5 ml/min的速度灌注心臟30 min,吸附電極分別貼于大鼠心房和心室表面。應(yīng)用錦江電子LEAD-2000電生理儀(四川錦江電子科技有限公司)記錄心房和心室局部組織的動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間,記錄心臟灌注指標(biāo),包括心率、心房、心室動(dòng)作電位時(shí)間。在此過程中,溫度控制在37℃以下,并使用5%CO2和95%O2的混合氣體持續(xù)通氣。
1.4組織病理學(xué)觀察和心肌損傷評分(MDS):標(biāo)本從左心室長軸垂直心尖連續(xù)切割。然后,將組織固定于4%多聚甲醛溶液中,對每個(gè)組織樣本進(jìn)行石蠟包埋,5 μm切片后使用蘇木精/伊紅染色,乙醇梯度脫水封閉后進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。心肌損傷的嚴(yán)重程度根據(jù)半定量量表進(jìn)行評估和分級,包括水腫、中性粒細(xì)胞浸潤、出血和肌原纖維分布[7]。由兩位對分組情況不詳?shù)牟±韺W(xué)專家進(jìn)行描述,嚴(yán)重程度表示為MDS。
1.5檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、CK-MB以及IgE含量:按照相應(yīng)ELISA檢測試劑盒的操作說明分別檢測血清中TNF-α、IL-6、CK-MB以及IgE含量。
2.1各組大鼠一般情況:在CLP手術(shù)后6~8 h,存活大鼠均出現(xiàn)不同程度的膿毒癥癥狀,如活動(dòng)障礙、毛發(fā)豎立、呼吸短促、結(jié)膜下滲出和腹瀉等。假手術(shù)組大鼠只表現(xiàn)出活動(dòng)和進(jìn)食減少,在6~12 h內(nèi)恢復(fù)。假手術(shù)組大鼠全部存活,膿毒癥組和PTS組分別有7只和8只存活至CLP術(shù)后24 h。
2.2心肌組織病理學(xué)觀察及心肌損傷評分(MDS)半定量分析:對三組大鼠心肌組織進(jìn)行病理學(xué)檢測,假手術(shù)組大鼠心肌組織經(jīng)蘇木精/伊紅染色后肌肉組織呈多邊形粉紅色纖維,肌肉纖維排列整齊緊湊,少有炎性細(xì)胞浸潤。CLP術(shù)后24 h,膿毒癥組大鼠心肌組織在鏡下出現(xiàn)明顯改變,肌肉組織排列紊亂,伴有大量炎性細(xì)胞浸潤,細(xì)胞間隙增寬。PTS治療可部分改善CLP后導(dǎo)致的病理改變,肌肉纖維排列相對規(guī)律,細(xì)胞間水腫和出血減輕,炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。見圖1A。半定量分析各組MDS結(jié)果表明,膿毒癥組MDS評分高于假手術(shù)組,而PTS治療后顯著降低MDS評分,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1B。
注:與假手術(shù)組比較,①P<0.05,與PTS組比較,②P<0.05圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)表現(xiàn)及MDS評分
2.3PTS對膿毒癥大鼠心肌動(dòng)作電位的影響:各組大鼠心電圖數(shù)據(jù),見圖2A。膿毒癥組大鼠心率較假手術(shù)組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PTS對心率有改善作用,與膿毒癥組相比,PTS組心率明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2B。假手術(shù)組心房和心室動(dòng)作電位時(shí)間明顯短于膿毒癥組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2C。PTS組心房和心室動(dòng)作電位時(shí)間均明顯長于CLP組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2D。然而,P、PR和QRS電位時(shí)間在PTS治療前后無明顯改變。
注:與假手術(shù)組比較,①P<0.05,與PTS組比較,②P<0.05圖2 各組大鼠心電圖、心率、心肌心房及心室組織動(dòng)作電位時(shí)間指數(shù)比較
2.4PTS可顯著降低CLP誘導(dǎo)的血清TNF-α、IL-6、CK-MB以及IgE水平:與假手術(shù)組大鼠相比,膿毒癥組大鼠CLP術(shù)后24 h血清中TNF-α、IL-6、CK-MB以及IgE的含量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而PTS治療后血清中TNF-α、IL-6、CK-MB以及IgE的含量均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。
注:與假手術(shù)組相比,①P<0.05,與PTS組相比,②P<0.05圖3 ELISA法測定各組大鼠血清TNF-α、IL-6、CK-MB及IgE含量
嚴(yán)重的膿毒癥/感染性休克嚴(yán)重威脅著人們的生命和健康,仍然是一種死亡率高、病理生理學(xué)復(fù)雜的臨床疾病。本研究建立大鼠膿毒癥模型,觀察PTS對膿毒癥大鼠心肌功能的影響,結(jié)果表明PTS可減輕炎性反應(yīng)以及調(diào)節(jié)心肌動(dòng)作電位,從而表明,PTS可通過抑制膿毒癥模型大鼠的炎性反應(yīng)和調(diào)節(jié)心臟動(dòng)作電位來抑制膿毒癥。
CLP作為當(dāng)前公認(rèn)的大鼠膿毒癥的金標(biāo)準(zhǔn)模型制作方法[8],膿毒癥早期,機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)大量復(fù)雜的炎性因子,這些因子相互作用形成炎性反應(yīng)瀑布效應(yīng),導(dǎo)致各種組織器官的損傷和功能障礙[9]。在本研究中,膿毒癥模型表現(xiàn)出多種特征,包括動(dòng)物行為、存活率、生理生化指標(biāo)、器官超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞因子水平,表明本研究CLP膿毒癥模型的建立是成功的,與已發(fā)表論文的動(dòng)物模型在細(xì)胞因子水平、臟器功能失調(diào)、超微結(jié)構(gòu)和動(dòng)物行為等方面是一致的[10]。具體而言,膿毒癥組血清TNF-α和IL-6水平顯著高于假手術(shù)組,這與臨床和實(shí)驗(yàn)研究中膿毒癥的促炎細(xì)胞因子風(fēng)暴表型一致。當(dāng)前對PTS的抗炎作用已有較為深入的研究[4],但PTS是否通過抗炎作用從而保護(hù)膿毒癥大鼠心肌功能尚未見報(bào)道。在本研究中,PTS可降低全身促炎細(xì)胞因子的表達(dá),同時(shí)在顯微鏡下觀察到PTS可明顯抑制炎性細(xì)胞在肌肉組織中浸潤。此外,CLP術(shù)后大鼠心肌結(jié)構(gòu)逐漸被破壞,并觀察到不可逆的結(jié)構(gòu)變化,同時(shí)伴隨著血清中CK-MB的含量增高,CK-MB能特異反映心肌損傷,這與鏡下觀察到的心肌組織改變相吻合,PTS作用后可顯著下調(diào)血清中CK-MB水平。
本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥組血清IgE水平明顯高于假手術(shù)組,與以往研究中IgE也參與炎性反應(yīng)一致[11],說明膿毒癥的炎性反應(yīng)涉及多種炎性細(xì)胞和細(xì)胞成分,在不同的環(huán)節(jié)發(fā)揮著重要的作用。以往的研究中沒有觀察到IgE的原因可能有以下幾點(diǎn):一方面,IgE水平很低,常規(guī)方法很難檢測到;另一方面,IgE在膿毒癥中的作用往往被忽視。如當(dāng)細(xì)菌和病毒侵入支氣管上皮細(xì)胞造成損傷時(shí),上皮細(xì)胞可產(chǎn)生IL-33,作用于肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞,促進(jìn)其增殖和成熟,這些細(xì)胞產(chǎn)生更多的炎性因子,從而增加IgE的表達(dá)。胃腸黏膜也可能表現(xiàn)出IgE的增加,導(dǎo)致炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展和惡化。目前的研究結(jié)果表明,血清IgE水平可引起不同組織器官的炎性免疫反應(yīng),不僅是I型超敏反應(yīng),而且是免疫抑制性膿毒癥所致心肌損傷的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)[12]。因此,IgE也可以作為膿毒癥的一個(gè)新的生物標(biāo)志物。在本研究中,PTS治療后,明顯緩解心肌損傷,同時(shí)膿毒癥期間上調(diào)的IgE水平也得以下調(diào)。
在本研究中,膿毒癥組的心率、心房和心室動(dòng)作電位均出現(xiàn)明顯異常,炎性反應(yīng)與抗炎之間的不平衡,免疫功能紊亂,膽堿能抗炎系統(tǒng)激活,迷走神經(jīng)傳入感覺,炎性反應(yīng)信號從中樞傳遞到腦干,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中進(jìn)一步處理,動(dòng)作電位通過傳出迷走神經(jīng)傳出,傳出迷走神經(jīng)對紊亂狀態(tài)進(jìn)行炎性反應(yīng)調(diào)節(jié),從而降低心率,延長心房和心室動(dòng)作電位時(shí)間。而PTS可明顯緩解迷走神經(jīng)的抗炎作用,從而調(diào)節(jié)心率和房室動(dòng)作電位異常。
總之,PTS通過抑制膿毒癥模型大鼠的炎性反應(yīng)和調(diào)節(jié)心臟動(dòng)作電位來抑制膿毒癥,從而證實(shí)了PTS在膿毒癥中的心肌保護(hù)作用及其可能相關(guān)機(jī)制,為膿毒癥的防治提供了新的思路。