靳桂紅 王道軍 馬 朝

肺癌是我國高死亡率的惡性腫瘤，可分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細胞肺癌，其中NSCLC約占所有肺癌的80%[1-2]。由于NSCLC早期發(fā)病癥狀并不具備特異性，確診時多已處于中晚期，以鉑類為基礎治療的方法仍是NSCLC患者的主要選擇的，但此類化療方案在不同NCSLC患者中療效差異較大[3-4]，有研究發(fā)現(xiàn)[5]，療效差異與基因多態(tài)性存在密切關聯(lián)。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTFHR)是一碳代謝途徑的限速酶，在DNA的復制和修復中發(fā)揮作用。目前有報道發(fā)現(xiàn)[6]，不同的突變類型會導致MTFHR酶活性存在差異性，進而影響臨床療效。而C677T位點突變是MTFHR最常見的突變類型，多項研究發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因多態(tài)性與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在相關性[7-8]。因此本研究主要探討以鉑類為基礎治療的NSCLC的療效及其與MTHFR C677T基因多態(tài)性的相關性，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象及臨床資料

選取2013年4月～2018年7月我院經(jīng)病理確診且行手術切除的NSCLC患者180例為研究組。納入標準：①東部腫瘤協(xié)作組(eastern cooperative oncology group，ECOG)標準評分0～2分；②病理分期為Ⅱ或Ⅲ期；③化療前血常規(guī)、肝腎功能、心功能未見明顯異常；④手術切除術后接受鉑類藥物為基礎的輔助化療；⑤預計生存周期>3個月。排除標準：①術后未接受鉑類藥物為基礎的輔助化療；②小細胞肺癌者；③不能完成隨訪者；④術后接受輔助放療者；⑤合并其他惡性腫瘤者。所有患者于術前或化療前采集靜脈血樣本，置于抗凝管中，-80 ℃保存待測。另選擇同期于我院進行體檢的健康人100名作為健康對照組，兩組年齡、性別等資料比較，差異無顯著性(P>0.05)。

1.2 化療方案

術后4～6個周根據(jù)研究組患者手術恢復情況予以第1d順鉑75 mg/m2，聯(lián)合培美曲塞500 mg/m2(非鱗癌)或長春瑞濱25～30 mg/m2第1 d和第8 d。21 d為1個周期，共進行≥4個周期的治療。

1.3 DNA提取及基因檢測

DNA提?。翰杉疎DTA抗凝血250 μl轉移至1.5 ml離心管，10000 rpm/min離心1 min，吸去上清后，加入250 μl Elution Buffer，顛倒數(shù)次混勻后再加入20 μg蛋白酶K(20 mg/ml)溶液，加入200 μl Buffer BL，立即渦旋振蕩充分混勻。將以上混合物加入一條吸附柱AC中，將樣品液放入DNA Mini Column中，以12000 rpm/min離心30 s，棄去廢液，加入500 μl Buffer KB，以12000 rpm/min離心30 s，棄去廢液；再加入 600 μl Wash Buffer，以12000 rpm/min離心30 s，棄去廢液；將吸附柱AC放回收集管中，以12000 rpm/min離心2 min，盡量去除漂洗液；取出吸附柱AC，放入1.5 ml離心管，加入120 μl洗脫緩沖液Elution Buffer，水浴箱(65 ℃)5 min，以12000 rpm/min離心1 min。收集DNA溶液，置于-80 ℃保存。基因檢測：采用Axygene全血基因組DNA抽提試劑盒抽提基因組DNA，采用直接測序法測定MTHFR C677T基因多態(tài)性，引物序列上游：5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3'，下游：5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'。交由上海生工生物工程有限公司合成后，待反應完成后送往公司進行測序。

1.4 隨訪及預后判定

研究組所有患者均在以鉑類為基礎的化療治療開始后進行隨訪，隨訪方式為電話隨訪或復診時，頻率為每3個月1次，以患者發(fā)生復發(fā)、轉移或全因死亡作為隨訪終點，截止日期與2020年11月30日。總生存期(OS)計算：患者發(fā)生腫瘤復發(fā)、轉移或全因死亡或末次隨訪時間與初次隨訪時間時間差。無復發(fā)生存期(RFS)：定義為從開始接受手術切除治療的時間到患者出現(xiàn)疾病復發(fā)或者任何原因引起的死亡。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 MTHFR C677T基因型分布頻率

將納入研究的180例NSCLC患者進行MTHFR C677T基因分型，CC基因型40例(22.22%)，CT基因型73例(40.56%)，TT基因型67例(37.22%)，基因型頻率分布進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(P>0.05)。研究組MTHFR C677TCC基因型頻率高于對照組(P<0.05)，CT、TT基因型在兩組間的分布頻率無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 MTHFR C677T基因型分布頻率(例，%)

2.2 MTHFR C677T基因型等位基因頻率

研究組C等位基因頻率明顯高于對照組，T等位基因頻率低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 MTHFR C677T基因型等位基因頻率(例，%)

2.3 MTHFR C677T不同基因型NSCLC患者預后比較

截止隨訪時間，180例研究組患者共有9例失訪(CC型3例，CT型2例，TT型4例)。所有患者隨訪時間12～59個月，平均38個月。所有患者中位生存期為31個月，MTHFR C677T基因型CC、CT、TT基因型中位生存時間分別為20個月、25個月、30個月，差異存在顯著性(P<0.05)。

2.4 術后接受鉑類藥物為基礎輔助化療的NSCLC患者OS的影響因素

在校正影響OS單因素分析結果中的年齡、性別、ECOG評分、組織學類型后，發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因型CC是OS的獨立影響因素(HR=1.07，P=0.012)，見表3。

表3 術后接受鉑類藥物為基礎輔助化療的NSCLC患者總生存期的影響因素

3 討論

NSCLC患者常采用肺癌根治術聯(lián)合化學藥物進行治療，對降低NSCLC復發(fā)率、延長患者生存時間具有顯著效果[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，以鉑類為基礎的化療方案主要用機制是通過破壞細胞復制所必需且關鍵的葉酸依賴性代謝過程，從而抑制細胞復制，發(fā)揮抗腫瘤作用，但會因個體差異產(chǎn)生不同的治療效果，因此探討個體基因組差異與藥物敏感性的關系，進而制定個性化的治療方案，對提高治療效果、延長生存期具有重要意義。

MTHFR是一碳代謝途徑的限速酶，主要參與葉酸的代謝和DNA的合成，同時在DNA的復制和修復中發(fā)揮著重要作用[13-14]，能不可逆地催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為 5-甲基四氫葉酸，因此MTHFR活性與葉酸代謝具有密切關聯(lián)，進而影響NSCLC患者以鉑類為基礎的化療療效[15-16]。多項研究發(fā)現(xiàn)的近20個MTHFR基因突變位點中，C677T是研究較多的位點之一[17-18]。本研究結果中，180例NSCLC患者進行MTHFR C677T基因分型，CC基因型40例(22.22%)，CT基因型73例(40.56%)，TT基因型67例(37.22%)，入組病例具有一定的人群代表性，與既往文獻報道相近[19-20]。

既往研究發(fā)現(xiàn)[21-22]，乳腺癌患者MTHFR C677T基因多態(tài)性中的TT型化療有效率明顯高于CC型，同時在CAF方案化療組患者中MTHFR 基因 C677T 的 TT 型、CT 型患者的化療有效率均明顯高于CC型患者，可見MTHFR C677T基因多態(tài)性對指導乳腺癌患者個體化治療具有重要價值。Pastorelli等[23]發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因CC型患者較 TT型患者擁有更好的近期療效。而但 Tiseo等[24]研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T 基因 TT 型患者擁有更長的總生存期。國內一項關于MTHFR C677T基因多態(tài)性與以培美曲塞為基礎治療晚期非小細胞肺癌療效相關性的META分析中發(fā)現(xiàn)[25]，MTHFR C677T基因CC型的晚期NSCLC患者采用培美曲塞為基礎化療的客觀緩解率較其他基因型更高。本研究結果中，MTHFR C677T基因型CC、CT、TT基因型中位生存時間分別為20個月、25個月、30個月，CC型中位生存時間明顯低于CT/TT型，與Smit等[26]報道一致。同時本研究通過采用COX風險比例模型分析OS的獨立影響因素，結果顯示：在校正影響OS單因素分析結果中的年齡、性別、ECOG評分、組織學類型后，發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因型CC是OS的獨立影響因素，提示MTHFR C677T基因型CC是OS的獨立危險因素，分析原因可能是此類突變的基因型MTHFR活性提高，造成葉酸代謝水平增加，進而導致以鉑類藥物的作用靶點增加，有助于提高療效[27-28]。但考慮到本次研究均為亞洲人種，樣本量較少，結果有待進一步探討。

綜上所述，MTHFR C677T基因型與以鉑類為基礎治療的NSCLC療效存在相關性，基因型CC是影響患者OS的獨立危險因素，對接受以鉑類為基礎治療的NSCLC患者的預后具有一定的臨床指導意義。