張甲翠 馬和平 段曉晏 王佳寧

肺腺癌對鉑類耐藥是影響預(yù)后的主要問題，Keap1/Nrf2/ARE信號通路在鉑類耐藥中發(fā)揮重要作用[1]。在活性氧的刺激下，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2[2]與Keap1解偶聯(lián)，Nrf2入核結(jié)合于肌腱纖維瘤蛋白(sMaf)形成異二聚體后啟動ARE靶基因轉(zhuǎn)錄[3]，啟動超氧化物歧化酶(SOD)、血紅素氧化酶-1(H0-1)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSH)等Ⅱ相解毒酶[4]轉(zhuǎn)錄，提高細胞抗氧化應(yīng)激能力[5]，增強腫瘤細胞的代謝活動和生長，促進腫瘤增殖[6]；導(dǎo)致癌細胞凋亡減少，使腫瘤耐藥作用加強[7-9]。ABCC1在MDR中發(fā)揮了非常重要的作用[10,11]，ABCCs常與II相解毒酶表達的調(diào)控具有協(xié)同作用[12-13]。Nrf2活性受MAPKs信號通路的調(diào)控[14,15]，但MAPKs直接磷酸化Nrf2，并不引起顯著的Nrf2激活，且因不同腫瘤細胞而不同， Nrf2活化入核與磷酸化的ERK、JNK、p38形成二聚體，再激活Nrf2下游基因的轉(zhuǎn)錄[16]；不同機體臟器部位Nrf2基因激活的途徑亦不同[17]。二甲雙胍能降低糖尿病患者合并卵巢癌、肺癌、肝癌等腫瘤風(fēng)險[18,19]；可通過調(diào)控細胞周期蛋白及其相關(guān)因子的表達,阻滯不同腫瘤細胞[20-22]于細胞G0/G1期或 G1/S期；亦可抑制不同病理類型的肺癌細胞增殖[23],并呈劑量依賴性，僅在小細胞癌細胞系中具有誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。目前國內(nèi)外對二甲雙胍影響耐鉑類肺腺癌細胞中Nrf2基因的表達的機制鮮有報道。本研究推測Nrf2/ARE信號通路在肺腺癌鉑類耐藥表達中發(fā)揮重要作用，這將有助于我們在源頭上尋找多藥耐藥過程中的關(guān)鍵基因,為腫瘤的臨床精準化療提供理論依據(jù)和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

人肺腺癌細胞株A549、A549/DDP(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞庫，上海)；RPMI 1640干粉培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清為 Hyclon產(chǎn)品(上海魯汶生物工程)；RNA反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScript RTreagent Kit RR047A試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒采用SYBR PrimeScript (Perfect Real Time) RR086A試劑盒(TakaRa公司，大連)，二甲雙胍(上海生工生物工程股份有限公司)；所有引物由上海博彩生物科技有限公司合成，見表1。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肺腺癌細胞(A549 和A549/DDP)培養(yǎng)于10%胎牛血清(FBS)RPMI 1640中，含青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 mg/ml)，在5%CO2，37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 基因表達檢測 A549和A549/DDP細胞接種于6孔板中，以1×105細胞/孔的密度培養(yǎng)24 h后收集細胞，根據(jù)說明書推薦的方法用Trizol試劑提取細胞總RNA，再轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒進行定量多聚酶鏈反應(yīng)。在95 ℃，1 min，1個循環(huán)；95 ℃，5 s，40個循環(huán)；60 ℃，30 s，40個循環(huán)的條件下對反應(yīng)液進行Real-time PCR擴增(Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀，美國)，測定A549和A549/DDP細胞間GSTA1，HO-1，ABCC-1，Nrf-2,SOD基因表達水平；不同濃度二甲雙胍(0、1、5、10 mM)刺激細胞4小時后，分別提取兩株細胞RNA檢測Nrf2、GSTA1和ABCC1基因水平變化。

1.3.2 Western Blot實驗 A549、A549/DDP細胞培養(yǎng)后抽提總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，配膠后進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜并封閉，分別于4 ℃孵育不同抗體和內(nèi)參抗體過夜，TBST分別洗滌膜3次后再孵育相應(yīng)的二抗后，再用TBST洗滌膜3次，將PVDF膜正面向上鋪于成像儀，用Bio-Rad ChemiDoc MP凝膠成像分析系統(tǒng)成像顯影，蛋白譜帶強度使用ImageJ軟件分析。

1.3.3 細胞增殖實驗(CCK-8)及凋亡檢測 分別制備A549細胞和A549/DDP細胞懸液后接種96孔板，細胞密度為1×104cells/well，予二甲雙胍(0、1、5、10 mM)共培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入10 μl CCK8孵育4 h，用flexstation 3酶標儀(Molecular Devices公司，加利福尼亞，美國)在450 nm波長處測量并記錄每孔中的吸光度；分別將A549、A549/DDP細胞接種于24孔板中，細胞密度為5×104cells/ml，經(jīng)不同濃度二甲雙胍作用24 h或48 h后，胰酶消化收集細胞，重懸于binding buffer中,加入5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl propidium iodide (PI),室溫避光20 min，上機用流式細胞儀BD FACSAriaTM II flow cytometer (BD biosciences,California,USA)檢測細胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 A549與A549/DDP細胞株間各耐藥基因的基因和蛋白表達差異

前期經(jīng)GSTA1、HO-1、ABCC1、ABCC-1、Nrf2、SOD基因水平篩選，對A549與A549/DDP細胞株進行基因表達檢測，發(fā)現(xiàn)A549與A549/DDP細胞株的Nrf2、ABCC1 Mrp-1、GSTA1基因水平的表達有明顯差異,通過Western Blot實驗進行總蛋白和蛋白水平驗證，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與基因水平篩選一致(圖1)。且在A549/DDP細胞株中的表達水平比A549顯著增高,以上結(jié)果提示，Nrf2、ABCC-1、GSTA1在肺腺癌順鉑耐藥細胞株表達水平比敏感株顯著增高。

注： A549:人肺癌細胞；DDP:順氯氨鉑；Nrf2:核因子E2相關(guān)因子；GSTA1:谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A1；ABCC1:藥物轉(zhuǎn)運蛋白；GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶。圖1 A549與A549/DDP細胞株間各耐藥基因在基因和蛋白表達差異

為了進一步明確不同濃度二甲雙胍刺激后各耐藥基因的變化情況。用不同濃度二甲雙胍(0、1、5、10 mM)刺激A549和A549/DDP細胞株，4 h后提取RNA檢測各基因水平變化，并通過Western Blot實驗進行蛋白水平驗證，發(fā)現(xiàn)隨著二甲雙胍濃度增高，A549細胞(圖2A)和A549/DDP細胞株(圖2B)的Nrf2、GSTA1和ABCC-1基因水平和蛋白水平的表達均逐步降低。結(jié)果提示二甲雙胍能夠明顯抑制各耐藥基因的表達。

圖2 不同濃度二甲雙胍影響A549、A549/DDP細胞間耐藥基因在基因和蛋白水平表達差異

2.2 不同濃度二甲雙胍對A549、A549/DDP細胞增殖抑制及凋亡的影響

對A549與A549/DDP細胞株均予以不同濃度二甲雙胍(0、1、5、10 mM)刺激，進行細胞增殖實驗及凋亡檢測。 隨著二甲雙胍濃度增高，A549細胞增殖能力逐步減弱，尤其濃度為5 mM和10 mM時，增殖能力明顯減弱(圖3A)；而二甲雙胍濃度為10 mM時，A549/DDP細胞增殖能力才能明顯減弱(圖3B)。且當(dāng)二甲雙胍濃度為5 mM和10 mM時，A549細胞48 h后凋亡率(圖3E)較24 h凋亡率(圖3C)明顯升高，但相同條件下A549/DDP細胞(圖3D、3F)凋亡率在48 h時較24 h僅輕度升高(P均<0.05)，提示二甲雙胍誘導(dǎo)耐藥細胞的凋亡率明顯低于非耐藥細胞，且作用的最佳時間點是48 h。

圖3 不同濃度二甲雙胍對A549、A549/DDP細胞增殖抑制及凋亡的影響

3 討論

我們研究發(fā)現(xiàn)人肺腺癌A549、A549/DDP細胞Nrf2及下游抗氧化基因中Nrf2、GSTA1、ABCC-1基因蛋白水平存在顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P均<0.01)。Nrf2可以在Nrf2誘導(dǎo)劑刺激下，通過與MRP2基因明確的ARE位點結(jié)合，提高ABCC2的表達[24]。而MRP1可以將GSTA1與抗癌藥物形成GSH復(fù)合物泵出胞外[25-27]，阻礙細胞內(nèi)抗癌藥物與靶位點結(jié)合降低細胞內(nèi)抗癌藥物濃度，致腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性[28,29]。下調(diào)耐順鉑的人肺腺癌細胞MRP表達后，對順鉑的耐藥性顯著降低[30]。GSTA1可能促進DNA的修復(fù)低[28];GSTA1可與鉑或鉑-DNA絡(luò)合物結(jié)合，降低順鉑的毒性，促進腫瘤細胞解毒。應(yīng)用GST抑制劑可以增強順鉑對耐藥細胞株的細胞毒作用[31]。GSTs屬于Ⅱ相共軛酶，它們能將有活性的親電子代謝產(chǎn)物解毒，它們的效應(yīng)依賴于谷胱甘肽的水平，后者取決于GCL和GSTA1合酶[32]。

二甲雙胍可能主要通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ，小分子干擾RNA抑制AMPK的表達后，可逆轉(zhuǎn)二甲雙胍的抗腫瘤增殖作用[33-34]。本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能抑制肺腺癌A549細胞的增殖，促進其凋亡，并呈時間和濃度依賴性(P<0.01)，但對A549/DDP細胞，僅在高濃度二甲雙胍時顯示前述作用(P<0.05)。經(jīng)二甲雙胍刺激，A549、A549/DDP細胞GSTA1、ABCC-1、Nrf2基因、蛋白水平表達存在差異(P均<0.05)，我們研究進一步印證了二甲雙胍抗腫瘤效應(yīng)。