劉明廣，李 琳

(阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生化工程系,安徽 阜陽 236031)

高大環(huán)柄菇(Macrotepiotaprocera)又稱高腳環(huán)柄菇、高柄環(huán)菇、棉花菇等,國外別稱陽傘蘑菇,在分類上屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、傘菌亞門(Agaricomycoina)、傘菌綱(Agaricomycetes)、傘菌亞綱(Agaricomycetidae)、傘菌目(Agaricales)、傘菌科(Agaricaceae)、大環(huán)柄菇屬(Macrolepiota)[1],是亞熱帶地區(qū)的一種大型腐生菌,也是一種土生的珍惜食用菌[2],其籽實(shí)體高大,質(zhì)地脆嫩，風(fēng)味宜人,是很受歡迎的野生食用菌.高大環(huán)柄菇廣泛分布在溫帶、亞熱帶地區(qū)，如英國南部、愛爾蘭、波蘭、塞爾維亞、歐洲與美國，在英國北部與蘇格蘭側(cè)多分布于有遮蔽的海岸區(qū)域.我國的高大環(huán)柄菇主要分布在遼寧、廣東、河南、江蘇、海南、福建、山東、浙江、廣西、湖南、四川、安徽、黑龍江、吉林等地[3].高大環(huán)柄菇含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)成分,尤以人體必需的8種氨基酸含量高而著稱[4]，具有較好的食用價值.在藥用方面，高大環(huán)柄菇含有木瓜蛋白酶、豆莢蛋白和多種組織蛋白酶等化學(xué)成分,這些成分具有半胱氨酸蛋白酶拮抗作用[5].最新研究發(fā)現(xiàn)脫皮大環(huán)柄菇揮發(fā)油化學(xué)成分獨(dú)特,含1種醇類化合物、1種酯類化合物和7種酮類化合物,丙酮粗提物因含有生物堿、萜類、甾醇等活性成分，且具有有效的抗氧化活性[6].因此，開展高大環(huán)柄菇開發(fā)研究具有重要的意義.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種:高大環(huán)柄菇由北京市食用菌工程技術(shù)研究中心提供,編號為京zb2115036.

儀器：LS-75HD立式壓力蒸汽滅菌鍋(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司),HFsafe1500LC生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司),SPX-328生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)、HYC-198S醫(yī)用冷藏箱(青島海爾科技有限公司),BSM-120.4電子天平(上海卓精電子科技有限公司).碳源試驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀0.5 g,硫酸鎂0.5 g,酵母浸粉2.0 g,瓊脂粉19.0 g,蒸餾水1 L;氮源試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀0.5 g,硫酸鎂0.5 g,葡萄糖18.0 g,瓊脂粉19.0 g,蒸餾水1 L;無機(jī)鹽試驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基:酵母浸粉2 g,葡萄糖18 g,瓊脂粉19 g,維生素B1100 mg,蒸餾水1 L;生長因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀0.5 g,硫酸鎂0.5 g,酵母浸粉2.0 g,葡萄糖18.0 g,瓊脂粉19.0 g,蒸餾水1 L;溫度試驗(yàn)培養(yǎng)基配方：PDA培養(yǎng)基1 L加入蛋白胨5.0 g,硫酸鎂 0.5 g;菌種活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

提前10天將高大環(huán)柄菇菌種接種在PDA培養(yǎng)基進(jìn)行活化備用.

1.2.2 碳源試驗(yàn)設(shè)計

在碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,設(shè)置蔗糖(18 g/L)、乳糖(18 g/L)、木糖(18 g/L)、麥芽糖(18 g/L)、果糖(18 g/L)、葡萄糖(18 g/L)和對照組(CK)7 個處理，用直徑為5 mm的無菌打孔器取高大環(huán)柄菇平板邊緣菌落接入不同碳源的培養(yǎng)皿中央，每個處理接種5個培養(yǎng)皿，25℃恒溫培養(yǎng).培養(yǎng)7天后,記錄菌絲生長長勢和菌落特征,用十字劃線法量取菌落直徑.

1.2.3 氮源試驗(yàn)設(shè)計

在氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)上,設(shè)置6 個氮源處理,即酵母浸粉(2 g/L)、氯化銨(2 g/L)、豆餅粉(2 g/L)、蛋白胨(2 g/L)、牛肉膏(2 g/L)和對照組(CK),每個處理接種5個培養(yǎng)皿，接種、培養(yǎng)和數(shù)據(jù)采集方法同1.2.2 .

1.2.4 無機(jī)鹽試驗(yàn)設(shè)計

在無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,設(shè)置硫酸鎂(0.5 g/L)、硝酸銨(0.5 g/L)、磷酸二氫鉀(0.5 g/L)、碳酸鈣(0.5 g/L)、氯化銨(0.5 g/L)和對照組(CK)6個處理，每個處理接種5個培養(yǎng)皿，接種、培養(yǎng)和數(shù)據(jù)采集方法同1.2.2 .

1.2.5 生長因子試驗(yàn)設(shè)計

在生長因子基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,設(shè)置維生素B6(0.01 g/L)、維生素B2(0.01 g/L)、維生素B1(0.01 g/L)、肌醇(0.01 g/L)和對照組(CK)6個處理，每個處理接種5個培養(yǎng)皿,接種、培養(yǎng)和數(shù)據(jù)采集方法同1.2.2 .

1.2.6 pH試驗(yàn)設(shè)計

PDA培養(yǎng)基滅菌后,用0.2 mol/L Na2HPO4·2H2O和0.1 mol/L檸檬酸調(diào)配成7個pH梯度：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8,每個梯度接種5個培養(yǎng)皿,接種、培養(yǎng)和數(shù)據(jù)采集方法同1.2.2 .

1.2.7 溫度試驗(yàn)設(shè)計

在溫度試驗(yàn)培養(yǎng)基上,設(shè)置6個溫度梯度,每一溫度梯度接種5個培養(yǎng)皿.接種后分別放在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃的生化培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),接種和數(shù)據(jù)采集方法同1.2.2 .

1.2.8 正交試驗(yàn)設(shè)計

從氮源、碳源、無機(jī)鹽和pH值四個因素中分別選出影響度排在前三的單因素組建4因素3水平試驗(yàn)的正交培養(yǎng)基組合,列出正交試驗(yàn)直觀分析表,組合的順序用試驗(yàn)號表示，每個組合接種5個培養(yǎng)皿,接種、培養(yǎng)和數(shù)據(jù)采集方法同1.2.2 .

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響

從表1可以看出高大環(huán)柄菇在6種不同碳源培養(yǎng)基上都能生長，在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長速度最快,生長長勢最好,菌絲白色平貼;在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲白色平貼,但其生長速度與蔗糖的差異顯著，在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長緩慢,生長長勢也最差,其生長速度比對照組慢.說明不同碳源對高大環(huán)柄菇的菌絲生長速度有重要影響.

表1 不同碳源對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響

2.2 不同氮源對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響

從表2可以看出高大環(huán)柄菇在5種不同氮源培養(yǎng)基上都能生長,與對照組相比添加氮源能促進(jìn)菌絲的生長,在酵母浸粉培養(yǎng)基上生長速度最快,生長長勢最好,菌落特征也好,其次是在牛肉膏培養(yǎng)基上,而在豆餅粉培養(yǎng)基上生長是最差,生長速度也最慢.

表2 不同氮源對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響

2.3 不同無機(jī)鹽對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響

從表3可以看出,在5個不同處理的無機(jī)鹽培養(yǎng)基上高大環(huán)柄菇都能生長,在碳酸鈣培養(yǎng)基上菌絲生長長勢最好,生長速度也最快,其次是在磷酸二氫鉀培養(yǎng)基里，在對照組培養(yǎng)基里菌絲生長長勢最差,生長速度最慢,說明添加適量的這幾種無機(jī)鹽能促進(jìn)菌絲生長.

表3 不同無機(jī)鹽對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響

2.4 不同生長因子對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響

從表4可以看出,高大環(huán)柄菇在維生素B2培養(yǎng)基上生長長勢最好,生長速度最快,其次是在空白對照培養(yǎng)基上,在其他培養(yǎng)基上生長速度變慢,生長長勢變差，說明其他幾種生長因子不適合該菌株生長,表現(xiàn)出抑制該菌株生長.

2.5 不同pH值對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響

從圖1可以看出在pH值從5.0到6.5的培養(yǎng)基里菌絲生長速度逐步加快,在pH值為6.5的培養(yǎng)基里菌絲生長速度達(dá)到最大,生長長勢也最好.pH值從6.5到8.0的培養(yǎng)基里菌絲生長速度逐步變慢，pH值為6與6.5的菌絲生長速度顯著,pH值為6.5與7.0的菌絲生長速度也顯著,表明該菌株的最適生長pH值為6.5.同大多數(shù)食用菌一樣,該菌株喜歡中性略偏酸性的環(huán)境,不同pH值條件下菌絲生長速度不同,但菌落顏色等特征差別不大(表5),說明pH值影響該菌株的生長速度,對菌落特征影響不大.

圖1 不同pH對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響

表5 不同pH對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響

2.6 不同溫度對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響

在10℃菌絲生長非常緩慢,從10℃到25℃菌絲生長速度逐漸加快,在25℃菌絲生長速度達(dá)到最快,生長長勢也最好,20℃和25℃條件下菌絲生長速度差異顯著,25℃和30℃條件下菌絲生長速度差異也顯著(表6),說明25℃是該菌株菌絲的最適溫度.隨著溫度的升高，菌絲生長速度很快下降，35℃菌絲停止生長(圖2)，說明溫度對該株高大環(huán)柄菇菌絲生長速度影響明顯.

圖2 不同溫度對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響

表6 不同溫度對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析

從高大環(huán)柄菇菌絲生長的4因素3水平正交試驗(yàn)(表7)可以看出,1號、2號、5號和8號的菌絲生長長勢最好，4號和8號菌絲生長長勢一般，3號、6號和9號菌絲生長長勢最差.氮源對該菌株影響的極差最大,R=1.523,pH排第二，無機(jī)鹽排第三,最后是碳源.綜合考慮,確定了四因素的最佳配方組合,碳源 X1,氮源 X2,無機(jī)鹽 X2,pH X1,即蔗糖,酵母浸粉,磷酸二氫鉀,pH 6.5.

表7 高大環(huán)柄菇菌絲生長的正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

從高大環(huán)柄菇菌絲在不同氮源的生長情況看，在蛋白胨、酵母浸粉和牛肉膏有機(jī)氮源上生長情況好于無機(jī)氮源氯化銨,可能與有機(jī)氮源中含有的微量元素、核苷酸、維生素等一些非氮成分能夠促進(jìn)菌絲生長有關(guān)[7].該試驗(yàn)中最佳氮源為酵母浸粉,而非蛋白胨,這與以往的報道結(jié)果相近[8],這是由于兩者培養(yǎng)基的無機(jī)鹽含量不同造成的.從該菌株的4因素3水平的正交結(jié)果可知,氮源對該菌株影響的極差最大,其次是pH值,再次是無機(jī)鹽,最后是碳源,綜合分析,確定了最佳培養(yǎng)配方組合為:蔗糖,酵母浸粉,磷酸二氫鉀,pH 6.5,這與無機(jī)鹽單因素分析結(jié)果是碳酸鈣不一致，多個因素相互作用的正交試驗(yàn)結(jié)果有時與單因素試驗(yàn)結(jié)果不同,也很常見.

通過不同碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子、pH值和溫度對該株高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響,篩選出了菌絲生長的最適單因素培養(yǎng)條件和最佳培養(yǎng)組合條件,為該菌株的培養(yǎng)和馴化提供了依據(jù).但該菌株的最佳原種配方、最佳栽培配方、最佳栽培培養(yǎng)基配方以及最佳育菇環(huán)境參數(shù)還不清楚,這些還有待進(jìn)一步研究.