亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        雷公藤內(nèi)酯醇通過(guò)調(diào)控miR-194的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡和自噬

        2022-02-22 09:16:50李春雨
        吉林醫(yī)學(xué) 2022年1期
        關(guān)鍵詞:肝癌

        李春雨,楊 航

        (1.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬龍華中心醫(yī)院,廣東 深圳 518110;2.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科,湖北 武漢 430000)

        傳統(tǒng)中藥雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook F.)屬于衛(wèi)矛科雷公藤屬植物,又名斷腸草,主要分布在浙江、江西、安徽、湖南等長(zhǎng)江以南地區(qū)[1]。雷公藤的主要化學(xué)成分包括糖類(lèi)、二萜類(lèi)、倍半萜類(lèi)等[2],其中雷公藤內(nèi)酯醇(TPL)是目前研究較為充分的一種二萜類(lèi)化合物,又名雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯[3]。據(jù)古籍記載,TPL被用于治療自身免疫性疾病和炎性反應(yīng)相關(guān)疾病,如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等已有上百年歷史,已有雷公藤多苷片、雷公藤片和雷公藤總萜片等被開(kāi)發(fā)成中成藥,其良好的治療效果得到臨床上的一致認(rèn)可。近年來(lái)研究表明,TPL對(duì)肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種癌癥細(xì)胞均有良好的增殖抑制效果[4-7]。miRNAs是一類(lèi)小的內(nèi)源性非編碼RNA,一般通過(guò)與靶向mRNA的3′UTR結(jié)合來(lái)抑制mRNA翻譯或誘導(dǎo)mRNA降解,其被認(rèn)為是調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵癌基因或抑癌基因,能夠廣泛參與到腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[8-9]。最近的研究表明,miR-194能夠抑制肝癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲,且miR-194的表達(dá)在肝癌肝細(xì)胞中顯著下調(diào)[10-11]。然而TPL抑制肝癌細(xì)胞增殖是否通過(guò)調(diào)節(jié)miR-194的表達(dá)以及其作用機(jī)制尚不得知。本文旨在探究TPL抑制肝癌HepG2細(xì)胞是否通過(guò)影響miR-194的表達(dá)以及其具體作用機(jī)制,為T(mén)PL抗肝癌進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1實(shí)驗(yàn)材料:HepG2細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC);RPMI-1640培養(yǎng)基和Lipofectamine 2000試劑盒(Invitrogen);雷公藤內(nèi)酯醇( 南京澤朗生物科技有限公司,純度為99%) ; 胎牛血清(Gibco);MTT 試劑盒(碧云天生物科技有限公司);PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqMan MicroRNA Assays 試劑盒[大連寶生物工程(大連)有限公司];鼠抗人 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、Bax、Bcl-2和Caspase-3 單克隆抗體(CST);辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的兔抗鼠酶標(biāo)的二抗(碧云天生物科技有限公司);miR-194 和 U6 引物[生工生物工程(上海) 股份有限公司];ABI 7500 型PCR儀(Applied Biosystems);凝膠成像分析儀(Bio-Rad)。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

        1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組:將HepG2細(xì)胞從液氮罐中取出、復(fù)蘇,在含10%血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),條件為37℃、5%二氧化碳及飽和濕度。

        1.3MTT實(shí)驗(yàn):將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以6 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中,于37℃、5%二氧化碳及飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后,將培養(yǎng)基替換為含10 nmol/L、20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L TPL的含藥培養(yǎng)基,空白組替換為新鮮空白培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)24 h和48 h,每孔加10 μl MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去上清,每孔加入150 μl DMSO,振板器振動(dòng)10 min,用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

        1.4RT-qPCR實(shí)驗(yàn):當(dāng)70%~80%細(xì)胞融合時(shí),將細(xì)胞分為3組,分別給予不同濃度(0、20和40 nmol/L)TPL處理細(xì)胞48 h后,采用TRIzol法提取細(xì)胞總mRNA,采用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)總體系為10 μl用TaqMan MicroRNA Assays試劑盒檢測(cè)miR-194 的 表達(dá),以U6作為內(nèi)參照,miR-194的上游引物序列為5′-GAGTTTGATCATGGCTCAGAGAGTTTGATCCTG-3′,下游引物序列為5′-CGACGGCCAGTCTTACCAGGAAACAGCTATG-3′;U6的上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列為5`-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,每組設(shè)3個(gè)重復(fù),根據(jù)各樣本的平均Ct值,以2-△△Ct表示miRNA相對(duì)表達(dá)水平,所有反應(yīng)均在 ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀完成。

        1.5Western印跡實(shí)驗(yàn):當(dāng)70%~80%細(xì)胞融合時(shí),將細(xì)胞分為三組,分別給予不同濃度(0、20和40 nmol/L)TPL處理細(xì)胞48 h后,提取各組細(xì)胞總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量測(cè)定。調(diào)整每個(gè)樣本的蛋白量一致,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上,用含5 %脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h,加入相應(yīng)的一抗,封閉過(guò)夜,TBST洗膜3次,10 min/次,再加入相應(yīng)的二抗,封閉1 h,TBST洗膜3次,10 min/次。將ECL發(fā)光液(A液∶B液=1∶1)混合均勻后滴加于NC膜上,用FluorChem FC3凝膠成像儀顯影拍照,并用Quantity One軟件進(jìn)行半定量分析,以目的蛋白與GAPDH條帶的熒光強(qiáng)度比值,來(lái)表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

        1.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn):當(dāng)細(xì)胞融合至70%~80% 時(shí),將細(xì)胞分成5組:對(duì)照組、miR-194 mimic轉(zhuǎn)染 (miR-194 mimic)組、miR-194 mimic陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染(miR-194 NC)組、TPL組和 miR-194 mimic轉(zhuǎn)染+TPL(miR-194 mimic+TPL)組。將 miR-194 mimic和陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至HepG2 細(xì)胞,室溫中放置 20 min 后, 分別加入培養(yǎng)孔,繼續(xù)孵育4 h。其中對(duì)照組不做任何處理;TPL處理組用 40 nmol/L TPL處理細(xì)胞24 h;miR-194 mimic轉(zhuǎn)染 + TPL組在轉(zhuǎn)染后, 更換含有血清的完全培養(yǎng)基, 再用40 nmol/L TPL處理24 h。轉(zhuǎn)染按照 Lipofectamine 2000 試劑盒說(shuō)明,將目的細(xì)胞按5×105/孔接種在24孔板中,于第2天使用Lipofectamine 2000將50 nmol/L miR-194 mimic轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。提取細(xì)胞總 RNA 進(jìn)行熒光定量 PCR 檢測(cè) miR-194,提取總蛋白檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá),方法同1.4和1.5。

        1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果

        2.1TPL抑制HepG2細(xì)胞的增殖:由圖1可知,與Control組相比,各濃度TPL處理HepG2細(xì)胞后,其中20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L TPL處理組在24 h和48 h均能夠顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。

        2.2TPL促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡和自噬:由圖2可知,與Control組相比,各濃度TPL處理HepG2細(xì)胞48 h后,凋亡標(biāo)志蛋白Bax/Bcl-2的比值和Caspase-3蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),自噬標(biāo)志蛋白 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和 Beclin-1蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且呈濃度依賴(lài)性。

        1~5:對(duì)照組、10 nmol/L TPL組、20 nmol/L TPL組、40 nmol/L TPL組、80 nmol/L TPL組;與對(duì)照組比較,*P<0.05圖1 不同濃度TPL在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

        注:與對(duì)照組比較,*P<0.05圖2 不同濃度TPL對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡和自噬的影響

        2.3TPL上調(diào)miR-194的表達(dá):由圖3可知,與對(duì)照組相比,不同濃度的 TPL處理HepG2細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)miR-194的表達(dá)均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        2.4miR-194 轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞的活力、凋亡和自噬的影響:由圖4和圖5可知,與 miR-194 mimic NC 組及對(duì)照組比較, miR-194 mimic 組、TPL處理組以及 miR-194 mimic+TPL處理組的細(xì)胞活力明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),細(xì)胞內(nèi)miR-194的表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),凋亡標(biāo)志蛋白Bax/Bcl-2的比值和Caspase-3蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),自噬標(biāo)志蛋白 LC3-II /LC3-I 的比值和Beclin-1蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且 miR-194 mimic+TPL處理組與單獨(dú) miR-194 mimic 組和單獨(dú)TPL組相比其抑制細(xì)胞活力作用更強(qiáng),凋亡和自噬程度更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        1~3:對(duì)照組、20 nmol/L TPL組、40 nmol/L注:與對(duì)照組比較,*P<0.05圖3 不同濃度TPL對(duì)HepG2細(xì)胞中miR-194的影響

        與對(duì)照組比較,*P<0.05圖4 過(guò)表達(dá)miR-194對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡和自噬的影響

        A:1~3:對(duì)照組、miR-194 mimic NC組、miR-194 mimic組;B:1~5:對(duì)照組、miR-194 mimic NC組、TPL組、miR-194 mimic組、miR-194 mimic+TPL組;與對(duì)照組比較,*P<0.05圖5 過(guò)表達(dá)miR-194對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

        3 討論

        肝癌是消化系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,死亡率高,在全球范圍內(nèi),肝癌是第二常見(jiàn)的癌癥死亡原因,每年有70多萬(wàn)人死于肝癌[12-13]。肝癌的主要危險(xiǎn)因素是乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、飲酒、黃曲霉毒素B1和代謝紊亂。肝癌通常是一種惡性腫瘤,預(yù)后差,5年生存率估計(jì)低于9%[14]。越來(lái)越多的證據(jù)表明,許多中藥及其活性成分是預(yù)防和治療肝癌的潛在來(lái)源,如紅豆杉、人參、靈芝、黃芪、茯苓、半枝蓮等。這些傳統(tǒng)中藥及其活性成分可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、預(yù)防肝癌、免疫調(diào)節(jié)和增強(qiáng)化療藥物的作用等多種途徑影響肝癌的發(fā)生和發(fā)展。TPL是從雷公藤分離出來(lái)的環(huán)氧二萜內(nèi)酯單體,具有抗腫瘤、抗炎、抗免疫抑制作用和抗神經(jīng)性退變等藥理作用[1]。有研究表明,miR-194 在卵巢癌癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中低表達(dá)[15-17],發(fā)揮抑癌基因的作用,抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展,在肝癌中同樣也發(fā)現(xiàn)了 miR-194 低表達(dá),因此本文推測(cè) miR-194 在肝癌中可能也通過(guò)參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的某些活動(dòng)來(lái)發(fā)揮抑癌基因的作用,調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

        本實(shí)驗(yàn)首先證實(shí)了不同濃度的TPL對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,且隨著濃度的升高抑制效果逐漸增強(qiáng)。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬是細(xì)胞程序性死亡的兩種主要表現(xiàn),在凋亡過(guò)程中,Bcl-2是抗細(xì)胞凋亡基因,Bax是促細(xì)胞凋亡基因,Bcl-2通過(guò)與Bax結(jié)合抑制凋亡并促進(jìn)細(xì)胞存活,它們共同協(xié)調(diào)作用,激活下游基因,發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[18]。Caspase-3 是發(fā)揮凋亡功能最主要的蛋白酶之一,位于 Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最下游。通常認(rèn)為 Caspase-3 是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路,它的活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆階段[19]。本研究發(fā)現(xiàn),TPL能上調(diào)凋亡標(biāo)志蛋白Bax/Bcl-2的比值和Caspase-3蛋白的表達(dá),結(jié)果表明,TPL能通過(guò)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡來(lái)抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)。LC3和Beclin-1是常用的自噬小體標(biāo)志物,用于評(píng)價(jià)細(xì)胞自噬的水平,LC3主要包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種,LC3-Ⅰ主要分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),當(dāng)自噬體形成時(shí),自噬基因Atg7可以活化LC3-Ⅰ,活化的LC3-Ⅰ經(jīng)Atg3泛素化修飾后形成LC3-Ⅱ。Beclin1參與自噬的機(jī)制主要是通過(guò)與PI3K形成復(fù)合物參與招募其他蛋白質(zhì),促進(jìn)自噬體膜的形成[20]。研究發(fā)現(xiàn),TPL能上調(diào)自噬標(biāo)志蛋白 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和 Beclin-1蛋白的表達(dá),結(jié)果表明,TPL能通過(guò)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬來(lái)抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)。

        本文推測(cè)TPL可以通過(guò)調(diào)節(jié) miR-194 來(lái)促進(jìn) HepG2 細(xì)胞的凋亡和自噬,從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖。為了深入研究這種內(nèi)在調(diào)控聯(lián)系,筆者將miR-194模擬物與陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中,再用 40 nmol/L TPL處理,檢測(cè) HepG2 細(xì)胞的活力,凋亡和自噬的變化。結(jié)果顯示與未經(jīng)處理的 HepG2 細(xì)胞及 miR-194 模擬物陰性對(duì)照組比較,miR-194 模擬物、TPL以及 miR-194 模擬物 + TPL均可明顯抑制HepG2細(xì)胞的活力,并促進(jìn)凋亡和自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)上調(diào);但與TPL組以及 miR-194 模擬物組比較,miR-194 模擬物 + TPL組可明顯增加 TPL 或 miR-194 模擬物的抗腫瘤作用,細(xì)胞增殖的抑制作用更強(qiáng),凋亡和自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)更顯著增加,提示TPL可能通過(guò)上調(diào) miR-194 抑制 HepG2 細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)凋亡和自噬。

        綜上所述,TPL可能通過(guò)上調(diào) miR-194 來(lái)抑制肝癌 HepG2 細(xì)胞的活力,并促進(jìn)其凋亡和自噬。然而,miR-194通過(guò)調(diào)控哪些蛋白的表達(dá),從而影響HepG2細(xì)胞的增殖,且這種調(diào)控作用是否有其他miRNA參與尚不清楚,還需要課題組進(jìn)一步研究。

        猜你喜歡
        肝癌
        LCMT1在肝癌中的表達(dá)和預(yù)后的意義
        結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的作用
        中成藥(2016年8期)2016-05-17 06:08:14
        過(guò)表達(dá)親環(huán)素J 促進(jìn)肝癌的發(fā)生
        103例中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌療效觀(guān)察
        miR-196a在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其促增殖作用
        microRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展及診治中的作用
        Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
        3例微小肝癌MRI演變回顧并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
        原發(fā)性肝癌腦轉(zhuǎn)移一例
        Glisson蒂橫斷聯(lián)合前入路繞肝提拉法在肝右葉巨大肝癌切除術(shù)中的應(yīng)用
        免费在线观看av不卡网站 | 亚洲日韩乱码中文无码蜜桃臀| 国产成人精品无码一区二区老年人 | 久久国产A√无码专区亚洲| 国产免费三级三级三级| 国产一区二区三区日韩在线观看| 久久久久夜夜夜精品国产| 中文字幕无码家庭乱欲| 亚洲AV小说在线观看| 人妻少妇被粗大爽视频| 男人和女人做爽爽免费视频| 国产午夜福利短视频| 无码高潮少妇毛多水多水免费| 亚洲一品道一区二区三区| 影音先锋男人av鲁色资源网| 男女男在线精品网站免费观看 | 刚出嫁新婚少妇很紧很爽| 国产精品人妻一码二码| 亚洲国产美女精品久久| 日韩精品有码中文字幕| 日日噜噜夜夜狠狠久久丁香五月 | 天堂资源中文最新版在线一区| 中文字幕第八页| 亚洲中文字幕乱码在线视频| 丰满少妇高潮惨叫久久久| 热re99久久精品国产99热| 午夜精品久视频在线观看| 东京热加勒比视频一区| 国产伦精品免编号公布| 国产亚洲精品自在久久蜜tv | 亚洲国产精品悠悠久久琪琪| 亚洲国产91高清在线| 国产精品扒开腿做爽爽爽视频| 亚洲av无码成人yellow| 一区二区三区国产亚洲网站 | 国产又色又爽又刺激在线播放| 青春草国产视频| 亚洲免费一区二区av| 日本成本人片免费网站| 爽妇网国产精品| 91久久国产精品综合|