李春雨，楊 航

(1.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬龍華中心醫(yī)院，廣東 深圳 518110；2.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430000)

傳統(tǒng)中藥雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook F.)屬于衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，又名斷腸草，主要分布在浙江、江西、安徽、湖南等長(zhǎng)江以南地區(qū)[1]。雷公藤的主要化學(xué)成分包括糖類(lèi)、二萜類(lèi)、倍半萜類(lèi)等[2]，其中雷公藤內(nèi)酯醇(TPL)是目前研究較為充分的一種二萜類(lèi)化合物，又名雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯[3]。據(jù)古籍記載，TPL被用于治療自身免疫性疾病和炎性反應(yīng)相關(guān)疾病，如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等已有上百年歷史，已有雷公藤多苷片、雷公藤片和雷公藤總萜片等被開(kāi)發(fā)成中成藥，其良好的治療效果得到臨床上的一致認(rèn)可。近年來(lái)研究表明，TPL對(duì)肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種癌癥細(xì)胞均有良好的增殖抑制效果[4-7]。miRNAs是一類(lèi)小的內(nèi)源性非編碼RNA，一般通過(guò)與靶向mRNA的3′UTR結(jié)合來(lái)抑制mRNA翻譯或誘導(dǎo)mRNA降解，其被認(rèn)為是調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵癌基因或抑癌基因，能夠廣泛參與到腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[8-9]。最近的研究表明，miR-194能夠抑制肝癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，且miR-194的表達(dá)在肝癌肝細(xì)胞中顯著下調(diào)[10-11]。然而TPL抑制肝癌細(xì)胞增殖是否通過(guò)調(diào)節(jié)miR-194的表達(dá)以及其作用機(jī)制尚不得知。本文旨在探究TPL抑制肝癌HepG2細(xì)胞是否通過(guò)影響miR-194的表達(dá)以及其具體作用機(jī)制，為T(mén)PL抗肝癌進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料：HepG2細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；RPMI-1640培養(yǎng)基和Lipofectamine 2000試劑盒(Invitrogen)；雷公藤內(nèi)酯醇( 南京澤朗生物科技有限公司，純度為99%) ; 胎牛血清(Gibco)；MTT 試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqMan MicroRNA Assays 試劑盒[大連寶生物工程(大連)有限公司]；鼠抗人 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、Bax、Bcl-2和Caspase-3 單克隆抗體(CST)；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的兔抗鼠酶標(biāo)的二抗(碧云天生物科技有限公司)；miR-194 和 U6 引物[生工生物工程(上海) 股份有限公司]；ABI 7500 型PCR儀(Applied Biosystems)；凝膠成像分析儀(Bio-Rad)。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組：將HepG2細(xì)胞從液氮罐中取出、復(fù)蘇，在含10%血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，條件為37℃、5%二氧化碳及飽和濕度。

1.3MTT實(shí)驗(yàn)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以6 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，于37℃、5%二氧化碳及飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基替換為含10 nmol/L、20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L TPL的含藥培養(yǎng)基，空白組替換為新鮮空白培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24 h和48 h，每孔加10 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，每孔加入150 μl DMSO，振板器振動(dòng)10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.4RT-qPCR實(shí)驗(yàn)：當(dāng)70%～80%細(xì)胞融合時(shí)，將細(xì)胞分為3組，分別給予不同濃度(0、20和40 nmol/L)TPL處理細(xì)胞48 h后，采用TRIzol法提取細(xì)胞總mRNA，采用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)總體系為10 μl用TaqMan MicroRNA Assays試劑盒檢測(cè)miR-194 的 表達(dá)，以U6作為內(nèi)參照，miR-194的上游引物序列為5′-GAGTTTGATCATGGCTCAGAGAGTTTGATCCTG-3′，下游引物序列為5′-CGACGGCCAGTCTTACCAGGAAACAGCTATG-3′；U6的上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5`-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，根據(jù)各樣本的平均Ct值，以2-△△Ct表示miRNA相對(duì)表達(dá)水平，所有反應(yīng)均在 ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀完成。

1.5Western印跡實(shí)驗(yàn)：當(dāng)70%～80%細(xì)胞融合時(shí)，將細(xì)胞分為三組，分別給予不同濃度(0、20和40 nmol/L)TPL處理細(xì)胞48 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量測(cè)定。調(diào)整每個(gè)樣本的蛋白量一致，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，用含5 %脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗，封閉過(guò)夜，TBST洗膜3次，10 min/次，再加入相應(yīng)的二抗，封閉1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。將ECL發(fā)光液(A液∶B液=1∶1)混合均勻后滴加于NC膜上，用FluorChem FC3凝膠成像儀顯影拍照，并用Quantity One軟件進(jìn)行半定量分析，以目的蛋白與GAPDH條帶的熒光強(qiáng)度比值，來(lái)表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80% 時(shí)，將細(xì)胞分成5組：對(duì)照組、miR-194 mimic轉(zhuǎn)染 (miR-194 mimic)組、miR-194 mimic陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染(miR-194 NC)組、TPL組和 miR-194 mimic轉(zhuǎn)染+TPL(miR-194 mimic+TPL)組。將 miR-194 mimic和陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至HepG2 細(xì)胞，室溫中放置 20 min 后， 分別加入培養(yǎng)孔，繼續(xù)孵育4 h。其中對(duì)照組不做任何處理；TPL處理組用 40 nmol/L TPL處理細(xì)胞24 h；miR-194 mimic轉(zhuǎn)染 + TPL組在轉(zhuǎn)染后， 更換含有血清的完全培養(yǎng)基， 再用40 nmol/L TPL處理24 h。轉(zhuǎn)染按照 Lipofectamine 2000 試劑盒說(shuō)明，將目的細(xì)胞按5×105/孔接種在24孔板中，于第2天使用Lipofectamine 2000將50 nmol/L miR-194 mimic轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。提取細(xì)胞總 RNA 進(jìn)行熒光定量 PCR 檢測(cè) miR-194，提取總蛋白檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，方法同1.4和1.5。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1TPL抑制HepG2細(xì)胞的增殖：由圖1可知，與Control組相比，各濃度TPL處理HepG2細(xì)胞后，其中20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L TPL處理組在24 h和48 h均能夠顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。

2.2TPL促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡和自噬：由圖2可知，與Control組相比，各濃度TPL處理HepG2細(xì)胞48 h后，凋亡標(biāo)志蛋白Bax/Bcl-2的比值和Caspase-3蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，自噬標(biāo)志蛋白 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和 Beclin-1蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈濃度依賴(lài)性。

1～5：對(duì)照組、10 nmol/L TPL組、20 nmol/L TPL組、40 nmol/L TPL組、80 nmol/L TPL組；與對(duì)照組比較，*P<0.05圖1 不同濃度TPL在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05圖2 不同濃度TPL對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡和自噬的影響

2.3TPL上調(diào)miR-194的表達(dá)：由圖3可知，與對(duì)照組相比，不同濃度的 TPL處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)miR-194的表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4miR-194 轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞的活力、凋亡和自噬的影響：由圖4和圖5可知，與 miR-194 mimic NC 組及對(duì)照組比較， miR-194 mimic 組、TPL處理組以及 miR-194 mimic+TPL處理組的細(xì)胞活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)miR-194的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，凋亡標(biāo)志蛋白Bax/Bcl-2的比值和Caspase-3蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，自噬標(biāo)志蛋白 LC3-II /LC3-I 的比值和Beclin-1蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且 miR-194 mimic+TPL處理組與單獨(dú) miR-194 mimic 組和單獨(dú)TPL組相比其抑制細(xì)胞活力作用更強(qiáng)，凋亡和自噬程度更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1～3：對(duì)照組、20 nmol/L TPL組、40 nmol/L注：與對(duì)照組比較，*P<0.05圖3 不同濃度TPL對(duì)HepG2細(xì)胞中miR-194的影響

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖4 過(guò)表達(dá)miR-194對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡和自噬的影響

A：1～3：對(duì)照組、miR-194 mimic NC組、miR-194 mimic組；B：1～5：對(duì)照組、miR-194 mimic NC組、TPL組、miR-194 mimic組、miR-194 mimic+TPL組；與對(duì)照組比較，*P<0.05圖5 過(guò)表達(dá)miR-194對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

3 討論

肝癌是消化系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率高，在全球范圍內(nèi)，肝癌是第二常見(jiàn)的癌癥死亡原因，每年有70多萬(wàn)人死于肝癌[12-13]。肝癌的主要危險(xiǎn)因素是乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、飲酒、黃曲霉毒素B1和代謝紊亂。肝癌通常是一種惡性腫瘤，預(yù)后差，5年生存率估計(jì)低于9%[14]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，許多中藥及其活性成分是預(yù)防和治療肝癌的潛在來(lái)源，如紅豆杉、人參、靈芝、黃芪、茯苓、半枝蓮等。這些傳統(tǒng)中藥及其活性成分可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、預(yù)防肝癌、免疫調(diào)節(jié)和增強(qiáng)化療藥物的作用等多種途徑影響肝癌的發(fā)生和發(fā)展。TPL是從雷公藤分離出來(lái)的環(huán)氧二萜內(nèi)酯單體，具有抗腫瘤、抗炎、抗免疫抑制作用和抗神經(jīng)性退變等藥理作用[1]。有研究表明，miR-194 在卵巢癌癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中低表達(dá)[15-17]，發(fā)揮抑癌基因的作用，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在肝癌中同樣也發(fā)現(xiàn)了 miR-194 低表達(dá)，因此本文推測(cè) miR-194 在肝癌中可能也通過(guò)參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的某些活動(dòng)來(lái)發(fā)揮抑癌基因的作用，調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)首先證實(shí)了不同濃度的TPL對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，且隨著濃度的升高抑制效果逐漸增強(qiáng)。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬是細(xì)胞程序性死亡的兩種主要表現(xiàn)，在凋亡過(guò)程中，Bcl-2是抗細(xì)胞凋亡基因，Bax是促細(xì)胞凋亡基因，Bcl-2通過(guò)與Bax結(jié)合抑制凋亡并促進(jìn)細(xì)胞存活，它們共同協(xié)調(diào)作用，激活下游基因，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[18]。Caspase-3 是發(fā)揮凋亡功能最主要的蛋白酶之一，位于 Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最下游。通常認(rèn)為 Caspase-3 是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，它的活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆階段[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，TPL能上調(diào)凋亡標(biāo)志蛋白Bax/Bcl-2的比值和Caspase-3蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，TPL能通過(guò)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡來(lái)抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)。LC3和Beclin-1是常用的自噬小體標(biāo)志物，用于評(píng)價(jià)細(xì)胞自噬的水平，LC3主要包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種，LC3-Ⅰ主要分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)自噬體形成時(shí)，自噬基因Atg7可以活化LC3-Ⅰ，活化的LC3-Ⅰ經(jīng)Atg3泛素化修飾后形成LC3-Ⅱ。Beclin1參與自噬的機(jī)制主要是通過(guò)與PI3K形成復(fù)合物參與招募其他蛋白質(zhì)，促進(jìn)自噬體膜的形成[20]。研究發(fā)現(xiàn)，TPL能上調(diào)自噬標(biāo)志蛋白 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和 Beclin-1蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，TPL能通過(guò)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬來(lái)抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)。

本文推測(cè)TPL可以通過(guò)調(diào)節(jié) miR-194 來(lái)促進(jìn) HepG2 細(xì)胞的凋亡和自噬，從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖。為了深入研究這種內(nèi)在調(diào)控聯(lián)系，筆者將miR-194模擬物與陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，再用 40 nmol/L TPL處理，檢測(cè) HepG2 細(xì)胞的活力，凋亡和自噬的變化。結(jié)果顯示與未經(jīng)處理的 HepG2 細(xì)胞及 miR-194 模擬物陰性對(duì)照組比較，miR-194 模擬物、TPL以及 miR-194 模擬物 + TPL均可明顯抑制HepG2細(xì)胞的活力，并促進(jìn)凋亡和自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)上調(diào)；但與TPL組以及 miR-194 模擬物組比較，miR-194 模擬物 + TPL組可明顯增加 TPL 或 miR-194 模擬物的抗腫瘤作用，細(xì)胞增殖的抑制作用更強(qiáng)，凋亡和自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)更顯著增加，提示TPL可能通過(guò)上調(diào) miR-194 抑制 HepG2 細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)凋亡和自噬。

綜上所述，TPL可能通過(guò)上調(diào) miR-194 來(lái)抑制肝癌 HepG2 細(xì)胞的活力，并促進(jìn)其凋亡和自噬。然而，miR-194通過(guò)調(diào)控哪些蛋白的表達(dá)，從而影響HepG2細(xì)胞的增殖，且這種調(diào)控作用是否有其他miRNA參與尚不清楚，還需要課題組進(jìn)一步研究。