陳 杰，魏 勇，王晨豫，曹夢園，解津剛，齊亞銀＊

1 石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000

2 新疆天澳牧業(yè)有限公司，新疆奎屯 833200

關鍵字：乳房炎；大腸桿菌；分離鑒定；藥敏試驗

0 引言

奶牛乳房炎是奶牛乳腺發(fā)生的一種炎癥反應，是由病原微生物感染、環(huán)境因素、飼養(yǎng)管理因素、奶牛自身及遺傳因素等綜合因素作用引起的一種疾病，也是奶牛場最常見的疾病之一[1，2]，對奶牛場危害極大。奶牛乳房炎致病菌以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主，由這三種病原菌引起的乳房炎發(fā)病率在90%以上[3]。根據炎癥的嚴重程度，奶牛乳房炎大體上可以分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎。臨床型乳房炎，在視覺上可見明顯的受感染表征，如乳汁的異常，包括顏色改變，存在凝塊或呈片狀；乳腺發(fā)生異常，包括乳腺表面組織顏色改變，呈現腫脹形態(tài)；奶牛狀態(tài)的異常，包括體溫、食欲及飲水量[4]。而隱性乳房炎，雖然在臨床體征上沒有明顯的變化，很難及時診斷，但對奶牛的奶產量和乳質量均帶來了嚴重的影響[5]。在一個牛群中，隱性乳房炎的發(fā)病率約為90%[6]。

本研究從新疆地區(qū)3 個規(guī)?；膛鲋胁杉榉垦啄膛５纳r乳，通過分離鑒定樣品中的致病菌，對其進行藥敏試驗，為新疆地區(qū)奶牛乳房炎致病菌流行情況提供參考，同時為新疆地區(qū)奶牛乳房炎的臨床治療和預防提供合理的用藥指導。

1 試驗材料

1.1 主要試劑及藥品

LB肉湯培養(yǎng)基（上海生工生物工程股份有限公司），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色液（珠海貝索生物技術有限公司），2×Taq Plus Master mix Ⅱ（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），DNA Marker Ⅰ、2K DNA Marker（北京全式金生物技術有限公司），SuperRed核酸染液（合肥蘭杰柯科技有限公司），細菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），引物（北京睿博興科生物技術有限公司），藥敏試紙（杭州濱和微生物試劑有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

光學顯微鏡（Olympus公司），高壓滅菌器（Hirayama公司），電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），旋渦混合器（Scientific Industries公司），電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），超凈工作臺（上海鴻都電子科技有限公司），離心機（Sigma公司），隔水式恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）、全自動振蕩培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司），PCR擴增儀（Techne公司），電泳儀（北京市六一儀器廠），凝膠成像儀（Biorad公司），微量移液器及大容量移液槍（英國Bibby科技有限公司），牛博士Ⅲ型體細胞檢測儀器[華誠睿光（中國）生物科技有限公司]。

2 試驗方法

2.1 樣品采集

2021年8—9月，在新疆地區(qū)選擇存欄1 100~1 400頭的3 個規(guī)模化奶牛場，并根據奶牛的DHI數據，篩選出體細胞數≥500 萬個/mL的臨床型乳房炎奶牛進行奶樣采集（所選牛只均未投喂含有抗生素的飼草料，并且未經過獸醫(yī)治療）；再使用牛博士體細胞檢測儀，對臨床型乳房炎奶樣進行二次確診。其中A牧場、B牧場、C牧場符合條件的奶樣分別為79 份、81 份和83 份，總共243份。

2.2 乳房炎致病菌的分離純化

將奶樣充分渦旋振蕩均勻，移取50 μL，轉種于800 μL的LB肉湯培養(yǎng)基內，在37 ℃，180 r/min條件的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24 h后，劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24 h后，挑取玫紅色單個菌落轉種于LB肉湯培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)18~24 h后，將增菌液再次在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24 h后，挑取紫黑色帶金屬光澤的單菌落進行涂片，革蘭氏染色，顯微鏡下鏡檢，將呈中等大小的革蘭氏陰性桿菌的單菌落再次轉種于LB肉湯培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)18~24 h。

2.3 分離菌形態(tài)學觀察

使用接種環(huán)分別將純化后的菌液均勻涂抹在載玻片中央，將載玻片置于酒精燈外焰3~5 cm處固定，經革蘭氏染色法染色后，在100 倍油鏡下觀察菌株形態(tài)。

2.4 分離菌株的PCR鑒定

依照DNA提取試劑盒操作步驟提取分離細菌的DNA，并對提取的細菌DNA進行PCR擴增，引物合成參考相關文獻[7]，引物序列及條件見表1，反應體系為25 μL：2×Taq Plus Master mix Ⅱ12.5 μL，雙蒸水8.5 μL，上下游引物各1 μL，細菌DNA模板2 μL。反應程序為：大腸桿菌：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。擴增PCR產物片段小于700 bp的使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳條件為1×TAE電泳液，120 V，90 mA，40 min。用凝膠成像儀對電泳后的瓊脂糖凝膠進行分析。

表1 PCR擴增條件及引物序列

2.5 分離菌株的藥物敏感性試驗

主要藥敏試紙選擇為：頭孢噻肟、青霉素、萬古霉素、鏈霉素、慶大霉素、諾氟沙星、丁胺卡那霉素、氨芐西林、四環(huán)素、阿莫西林、環(huán)丙沙星等。將分離純化后的大腸桿菌，接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床內增菌培養(yǎng)24 h后，用生理鹽水將菌液濃度調節(jié)至（1~2）×10 CFU/mL。按照紙片法的操作，吸取適量菌液涂布在瓊脂平板上，取出不同藥敏紙片，貼于瓊脂表面，不同藥敏紙片的間距≥24 mm。將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測量瓊脂上的抑菌環(huán)直徑。評判結果參照美國臨床實驗室國家標準化管理委員會標準（CLSI2008）。

3 結果與分析

3.1 分離菌株的初步鑒定及形態(tài)學特征

純化后的菌液劃線于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)為玫紅色、邊緣光滑、濕潤的菌落；伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)為紫黑色帶金屬光澤的菌落；經革蘭氏染色后，在顯微鏡下呈現中等大小的革蘭氏陰性桿菌（圖1）。

圖1 大腸桿菌的菌落特征和形態(tài)結構

3.2 PCR 鑒定結果

擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，產物大小與預期一致，為264 bp（圖2）；3 個規(guī)?；膛鏊杉?43 份奶樣經PCR鑒定為大腸桿菌的共有187 株，其中A場66 株、B場62 株、C場59 株。

圖2 部分大腸桿菌PCR結果

3.3 藥敏試驗檢測結果

由表3可知，大腸桿菌對頭孢噻肟、鏈霉素、慶大霉素、丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星高度敏感。

表3 不同藥物對大腸桿菌的平均抑菌直徑

4 討論

奶牛乳房炎的發(fā)生可對奶牛產奶量和乳品質造成嚴重影響[8]。大腸桿菌被認為是引起國內奶牛乳房炎的第二大病原菌，僅次于金黃色葡萄球菌[9]。大腸桿菌廣泛存在于自然環(huán)境中，如圈舍的墊料、奶牛的糞便等[10]。由于奶牛場管理不善，圈舍環(huán)境不良而導致的大腸桿菌性奶牛乳房炎的發(fā)病率相對較高，多發(fā)于泌乳高峰期和高產奶牛，并且發(fā)病無明顯的季節(jié)性[11]，常呈現急性經過[12]。當奶牛場出現乳房炎時，會造成一系列負面效應，如牛奶品質下降、奶牛淘汰率升高、治療用藥成本增加、牛奶中藥物殘留增多等，極大地降低了奶牛場的經濟效益[13]。研究表明，控制大腸桿菌性乳房炎，可有效提高奶牛產奶量[14]。因此對奶牛乳房炎的主要致病菌進行分離鑒定，提供合理的預防、治療方案相當重要。