岳聚安，高 賀，張啟棟，余華晨，劉 沛，文鵬飛，程立明，郭萬首*

（1.航空總醫(yī)院，北京 1000121；2.中日友好醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，北京 100029）

股骨頭壞死（osteonecrosis of femoral head,ON?FH）已經(jīng)成為一個日益嚴(yán)重的全球性健康問題[1]。目前ONFH的發(fā)病機制尚未完全清楚，但人們普遍認(rèn)為，各種創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性損傷損害了本已不穩(wěn)定的股骨頭微循環(huán)，最終導(dǎo)致骨髓和骨細(xì)胞死亡[2，3]。糖皮質(zhì)激素的使用已成為ONFH最常見的發(fā)病原因[2，3]。盡管激素誘導(dǎo)ONFH發(fā)病機制尚不完全清楚[4]，但有研究表明，激素誘導(dǎo)股骨頭微血管內(nèi)皮細(xì)胞（bone microvascular endothelial cells,BMECs）損傷或功能障礙可能在激素性O(shè)NFH的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[5-7]。MicroRNAs(miRNA)是一類廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源性非編碼的小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平通過RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex,RISC）和其靶基因3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region,3′UTR）結(jié)合來調(diào)節(jié)靶基因行使功能。miRNA受到越來越多的關(guān)注，其不僅調(diào)控生物體的正常發(fā)育、組織平衡、生理功能，也參與疾病的發(fā)生、發(fā)展及康復(fù)等多階段的復(fù)雜過程[3]。淫羊藿苷 （icariin,ICA；C33H40O15；分子量：676.67）是從淫羊藿中提取的黃酮類化合物，可以有效預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、保護血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及預(yù)防激素性O(shè)NFH的發(fā)生[8～10]。作者所在團隊前期體外實驗研究表明ICA可能通過調(diào)控激素誘導(dǎo)BMECs中miRNA-23b表達(dá)失衡及保護BMECs的功能來預(yù)防激素性O(shè)NFH的發(fā)生[11，12]。現(xiàn)階段該課題組通過建立大鼠激素性O(shè)NFH模型及ICA預(yù)防激素性O(shè)NFH模型組，分別提取不同組大鼠股骨頭BMECs進(jìn)行原代培養(yǎng)，通過動物體內(nèi)試驗進(jìn)一步驗證ICA是否可保護BMECs的功能，同時采用mi-RNAs基因芯片進(jìn)一步探尋激素性O(shè)NFH發(fā)生時BMECs中miRNA-23b表達(dá)是否發(fā)生改變；ICA對異常表達(dá)的miRNA-23b是否有調(diào)控作用，來驗證前期研究的結(jié)論及觀點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

該動物實驗研究程序嚴(yán)格遵守世界醫(yī)學(xué)協(xié)會《赫爾辛基宣言》所規(guī)定的國際規(guī)則和條例。實驗前，90只8周齡雌性SPF級SD大鼠（北京華阜康生物科技股份有限公司）置于特定無病原體條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周（環(huán)境溫度 20℃，光照/暗循環(huán) 12 h，濕度48% ）。標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動物飼料飼養(yǎng)。ICA（批號：II0030，中國，索萊寶科技有限公司）；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（貨號：1001，美國，Sciencell）；離心機（型號：8622，日本，久保田）；脂多糖（貨號：L2880，美國Sigma公司）；甲強龍（貨號：H20080284，美國，輝瑞制藥公司）；芯片掃描儀（型號：G2565CA，美國，Agilent公司）；CX41熒光顯微鏡（型號：CX41日本，Olympus公司）。

1.2 體內(nèi)實驗

1.2.1 動物分組與處理

90只雌性SD大鼠采用隨機數(shù)字表法分為三組，每組30只。模型組：腹腔連續(xù)注射2次脂多糖（20 μg/kg），每次間隔24 h，24 h后肌內(nèi)連續(xù)注射3次大劑量甲強龍（40 mg/kg），每次間隔24 h，同時給予與ICA組等量生理鹽水灌胃。ICA組：大鼠給予脂多糖及甲強龍的劑量及時間同模型組，首次肌注脂多糖后給予大鼠ICA（每天60 mg/kg）灌胃，連續(xù)灌注4周?？瞻捉M：僅給予等量生理鹽水腹腔注射、肌注及灌胃。4周后處死大鼠，隨機選擇各組動物進(jìn)行實驗。

1.2.2 骨形態(tài)計量分析

三組大鼠每組隨機取10只大鼠股骨頭行HE染色，病理變化由兩位獨立觀察者進(jìn)行評估。采用im?age-pro-plus圖像分析系統(tǒng)計算單位面積的骨小梁面積百分比、骨小梁寬度和空骨陷窩率。

1.3 體外實驗

1.3.1 BMECs分離與鑒定

采用作者所在實驗室前期建立的BMECs分離培養(yǎng)方法完成大鼠股骨頭BMECs的提取及鑒定[3]：每組20只大鼠均采用脫臼法處死后，75% 酒精浸消毒。后外側(cè)入路取出股骨頭，去除軟骨后，將股骨頭用組織剪切為1 mm3碎骨粒。裝入含有10 ml DMEM培養(yǎng)基的離心管中，DMEM培養(yǎng)基清洗骨粒2次。離心管內(nèi)加入含0.2% I型膠原酶的DMEM培養(yǎng)基2 ml，37℃水浴消化30 min，隨后加入0.25% 胰蛋白酶消化5 min。采用200目細(xì)胞篩過濾，將濾液置于4℃、430×g離心機中離心6 min。將細(xì)胞接種在35 mm直徑培養(yǎng)皿中，放入37℃、5% CO2、95% 濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后磷酸鹽緩沖液沖洗一次棄去未貼壁的細(xì)胞，重新更換培養(yǎng)基，以后每3～5 d更換培養(yǎng)基1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；每組隨機取1份細(xì)胞行流式細(xì)胞儀對股骨頭微血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原CD31和Ⅷ因子相關(guān)抗原（vWF）進(jìn)行鑒定。

1.3.2 BMECs細(xì)胞凋亡檢測

每組取15只大鼠的BMECs行流式細(xì)胞儀凋亡檢測。BMECs培養(yǎng)皿中加不含EDTA的胰蛋白酶消化后離心（2 000 r/min，5 min）。PBS洗滌2次，以1～5×105/管收集細(xì)胞，PBS洗滌1次，離心去除PBS，加入冰預(yù)冷的70% 的乙醇固定，離心棄去固定液，3 ml PBS重懸5 min，400目篩網(wǎng)過濾，離心（1 000 r/min，5 min）棄去PBS，加入1 ml PI染色，4℃冰箱凍存30 min后行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 BMECs細(xì)胞miRNA-23b檢測及生物信息學(xué)分析

每組取3只大鼠BMECs樣本進(jìn)行生物信息學(xué)分析。使用TRIzol試劑（按照說明書操作步驟進(jìn)行操作）對BMECs進(jìn)總RNA提取質(zhì)檢。質(zhì)檢合格的to?tal RNA進(jìn)行純化、去磷酸化及標(biāo)記。隨后使用Agi?lent芯片掃描儀對甩干的芯片進(jìn)行掃描及數(shù)據(jù)提取，分析miRNA-23b表達(dá)量。利用Gene Ontology（GO）軟件對miRNA-23b調(diào)控靶基因進(jìn)行功能注釋分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計量數(shù)據(jù)以±s表示；資料呈正態(tài)分布時，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；資料呈非正態(tài)分布時，采用秩和檢驗；P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織觀察與形態(tài)計量結(jié)果

三組股骨頭組織學(xué)HE染色觀察見圖1?？瞻捉M骨小梁排列整齊，無明顯變薄、破裂（圖1a），小梁內(nèi)可見大量散在藍(lán)色骨細(xì)胞核和微血管（圖1d）。模型組出現(xiàn)早期骨壞死表現(xiàn)，骨小梁稀疏、斷裂，小梁間隙變寬，小梁間隙充滿大量纖維化組織（圖1b），骨小梁內(nèi)可見大量空骨陷窩（圖1e）。ICA組股骨頭解剖結(jié)構(gòu)（圖1d）與空白組組解剖結(jié)構(gòu)相似，骨小梁中可見散在藍(lán)染的細(xì)胞核、空骨陷窩及微血管（圖1f）。

圖1 三組動物股骨頭組織學(xué)觀察（HE） 1a～1c:低倍鏡下所見 1a:空白對照組（×100），骨小梁排列整齊，無明顯變薄及斷裂，散在大量微血管 1b:模型對照組（×100）：骨小梁稀疏、斷裂，空骨陷窩較多，未見微血管 1d～1f:分別為上述三組黑色框部分高倍鏡下（×200）所見 1d:黑色箭頭為骨陷窩，紅色箭頭為微血管 1e:黑色箭頭為空骨陷窩 1f:黑色箭頭為骨細(xì)胞，紅色箭頭為微血管，黃色箭頭為空骨陷窩

組織形態(tài)計量結(jié)果見表1，模型組股骨頭骨小梁的寬度明顯低于空白組與ICA組（P<0.05），空白組股骨頭骨小梁的寬度與ICA組之間無明顯差異（P>0.05）；模型組股骨頭骨小梁面積百分比明顯低于空白組與ICA組（P<0.05），空白組股骨頭骨小梁面積百分比與ICA組之間無明顯差異（P>0.05）；模型組的空骨陷窩率明顯高于ICA組（P<0.05）。

表1 三組大鼠股骨頭形態(tài)計量檢測結(jié)果（±s）與比較

表1 三組大鼠股骨頭形態(tài)計量檢測結(jié)果（±s）與比較

指標(biāo)骨小梁寬度（μ m）骨小梁面積百分比（% ）空骨陷窩率（% ）空白組（n=1 0）8 6 2.1 7±1 5 3.8 2 5 3.4 3±3.3 1 0模型組（n=1 0）4 0 7.5 4±1 4 1.1 7 3 5.6 8±5.6 9 3 2.5 1±1 3.8 1 I C A組（n=1 0）8 3 6.5 0±1 3 2.1 6 5 2.5 9±3.2 2 1 3.7 7±5.5 4 P值0.0 2 4 0.0 1 8 0.0 4 1

2.2 BMECs鑒定

BMECs細(xì)胞鑒定結(jié)果見圖2。接種48 h后換液，熒光顯微鏡下可見少量散在貼壁長梭形細(xì)胞（圖2a），接種5 d后可見明顯細(xì)胞集落（圖2b），接種12 d后細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底，并呈現(xiàn)鋪路石樣外觀（圖2c）。流式細(xì)胞儀檢測BMECs特異性抗原分子，99% 的細(xì)胞同時表達(dá)CD31和vWF（圖2d）[13]。

圖2 股骨頭BMECs培養(yǎng)鑒定 2a:少量散在貼壁長梭形細(xì)胞（×40） 2b:可見明顯細(xì)胞集落（×40） 2c:細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底，并呈現(xiàn)鋪路石樣外觀（×40） 2d:流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞高表達(dá)CD31和vWF

流式細(xì)胞儀BMECs細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果見表2，三組間壞死細(xì)胞百分比的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。BMECs活細(xì)胞比率由高至低依次為：空白組>ICA組>模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中，模型組BMECs活細(xì)胞比率明顯低于空白組和ICA組（P<0.05），而空白組和ICA組活細(xì)胞百分比無顯著差異（P>0.05）。早期凋亡細(xì)胞比率由高至低依次為：模型組>ICA組>空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中，模型組早期凋亡細(xì)胞比率明顯高于空白組（P<0.05），空白組與ICA組早期凋亡細(xì)胞比率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。三組間晚期凋亡細(xì)胞比率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表2 三組大鼠股骨頭BMECs細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果（% ，±s）與比較

表2 三組大鼠股骨頭BMECs細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果（% ，±s）與比較

指標(biāo)壞死細(xì)胞比率活細(xì)胞比率早期凋亡細(xì)胞比率晚期凋亡細(xì)胞比率空白組（n=1 0）9.2 3±6.5 0 7 7.1 5±4.1 6 5.6 4±3.9 7 1 5.3 7±3.7 7模型組（n=1 0）1 1.3 7±5.4 0 5 7.2 4±6.2 1 5.9 2±1 0.3 8 1 4.8 2±7.8 3 I C A組（n=1 0）7.8 9±3.4 9 7 0.1 4±5.5 3 1 0.9 2±6.2 0 1 2.5 1±3.2 3 P值0.3 4 6<0.0 0 1 0.0 2 2 0.1 0 7

2.3 miRNA-23b檢測結(jié)果及生物信息學(xué)分析

miRNA信號變化聚類分析與GO功能注釋詳見圖3。與空白組相比，模型組miRNA-23b表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.032），ICA組miRNA-23b表達(dá)量與空白組比較仍然下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.079）；但miRNA-23b在ICA組中的表達(dá)量高于模型組。因此，ICA對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的BMECs中miRNA-23b的異常表達(dá)有一定的調(diào)控作用。經(jīng)GO數(shù)據(jù)庫對miRNA-23b靶基因參與的細(xì)胞室 （cellular compartment）、分子功能 （molecular function）和生物過程（biological process）進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化描述，詳見圖3b。

圖3 生物信息學(xué)分析 3a:模型組和ICA組與空白組大鼠BMECs比較差異表達(dá)的miRNA聚類分析 3b:GO功能注釋。藍(lán)色條帶代表生物學(xué)過程，黃色條帶代表分子組分，紅色條帶代表分子功能

3 討論

自Lee[14]首次發(fā)現(xiàn)miRNA以來，越來越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)，miRNA也成為了醫(yī)學(xué)研究的熱點。miRNAs在細(xì)胞中對mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)有一定的調(diào)控作用，因此，miRNA的異常表達(dá)與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[15]。miRNA異常表達(dá)的發(fā)現(xiàn)為ONFH的診治及預(yù)防提供了新的思路。BMECs參與骨吸收、新骨形成、血管生成、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物質(zhì)的運輸、維持骨微環(huán)境的平衡等多種生理及病理過程[16]。早在 1948 年，Chandeler等[17]研究發(fā)現(xiàn) ON?FH發(fā)生的原因可能是微血管損傷。Séguin等[18]和Kerachian等[19]也發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙與非創(chuàng)傷性O(shè)N?FH發(fā)病密切相關(guān)。因此，在基因水層面研究股骨頭BMECs具有重要意義，有助于識別藥物作用靶點及相關(guān)信號通路等。

ICA是中藥淫羊藿的有效活性成分，Hu等[20，21]發(fā)現(xiàn)ICA可有效抑制氧化低密度脂蛋白引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡及缺氧引起的腕靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。作者所在團隊體外實驗研究表明ICA可有效抑制激素誘股骨頭BMECs損傷[11]?，F(xiàn)階段本團隊通過動物體內(nèi)實驗研究進(jìn)一步驗證，ICA可有效保護激素誘導(dǎo)的BMEC損傷，降低BMECs的凋亡率。有研究表明，ICA具有性激素樣作用，其可有效促進(jìn)骨組織蛋白合成和成骨細(xì)胞生長，從而有利于骨組織再生及修復(fù)[22，23]。本中心組織的一項多中心隨機雙盲對照試驗證實，服用主要成分為ICA的仙靈骨葆膠囊可有效降低激素性股骨頭壞死的發(fā)病率[22]。本團隊前期實驗研究也表明，ICA可促進(jìn)動物體內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管，促進(jìn)微血管形成，改善微循環(huán)，促進(jìn)骨組織修復(fù)，延緩股骨頭壞死病情的進(jìn)展[24]。作者通過動物實驗也揭示了，ICA可有效的預(yù)防激素性股骨頭壞死的發(fā)生。

miR-23b是一種多功能的非編碼mi-RNA，具有調(diào)控血管生成的作用，尤其在富含血管內(nèi)皮細(xì)胞的組織中高表達(dá)如心臟、肺等[25]。miRNA-23b的靶基因及多條相關(guān)信號通路，在細(xì)胞凋亡、增殖、分化，血管形成及干細(xì)胞分化方面具有重要的調(diào)節(jié)作用[11]。Zhou 等[26]研究發(fā)現(xiàn) miRN-23b 的表達(dá)與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及調(diào)控血管的完整性相關(guān)，miR?NA-23b過表達(dá)可能與血管的新生有關(guān)。趙丁巖等[11]研究表明上調(diào)miRNA-23b可能抑制BMECs的凋亡和促進(jìn)新生血管形成。作者前期體外實驗研究表明，激素可抑制BMECs中miR-23b的表達(dá)；BMECs經(jīng)ICA干預(yù)后，可有效的調(diào)控激素對miR?NA-23b表達(dá)量的影響，同時推測ICA可能通過調(diào)控骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-23b的表達(dá)量來參與激素性股骨頭壞死病理過程的調(diào)控[11]，同時作者也發(fā)現(xiàn)ICA在體外可促進(jìn)微血管生成，而且可以增加激素誘導(dǎo)后大鼠股骨頭微血管的密度。該系列研究提示ICA在預(yù)防糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的ONFH中具有一定的作用[24]?，F(xiàn)階段，本研究通過動物體內(nèi)實驗進(jìn)步驗證了ICA對激素誘導(dǎo)的miR-23b表達(dá)量的下降有一定的調(diào)控作用。這為下一步深入研究股骨頭壞死的發(fā)病機制，探究ICA的作用靶點奠定良好基礎(chǔ)。

該研究存在以下不足之處:（1）體內(nèi)研究表明，ICA對激素誘導(dǎo)miRNA-23b表達(dá)量的下降有一定的調(diào)控作用，但miRNA-23b的表達(dá)量未完全恢復(fù)到正常值，因此ICA的最佳給藥劑量可能需要進(jìn)一步探索；（2）前期研究預(yù)測的miRNA-23b靶基因可能調(diào)控的信號通路及現(xiàn)階段對miRNA-23b靶基因功能注釋分析，需要進(jìn)一步研究；（3）前期實驗已驗證Agi?lent芯片檢測miRNA 表達(dá)量的準(zhǔn)確性[3，11]，因此該研究沒有對miRNA-23b表達(dá)量進(jìn)行PCR驗證。

ICA在動物體內(nèi)可有效的預(yù)防激素誘導(dǎo)的ONFH的發(fā)生，同時可保護BMECs，BMECs中的miRNA-23b可能是ICA預(yù)防激素性股骨頭壞死的作用靶點。