馮琬淇，張福順，劉乃新

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜(Beta vulgaris L.)為莧科(Amaranthaceae)甜菜屬(Beta L.)。糖甜菜、根甜菜、葉甜菜、飼料甜菜是4種栽培變種，糖甜菜是世界上重要的糖料作物[1]，也是新興的能源作物，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和發(fā)展地方經(jīng)濟(jì)中同樣有著重要地位[2]；根甜菜和葉甜菜均可食用，尤其是根甜菜有很高的藥用價(jià)值[3-4]和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5-6]，現(xiàn)有多個(gè)國(guó)家進(jìn)行種植[7]；而飼料甜菜由于其含糖量低，塊根大而主要被用于畜牧業(yè)。

分子標(biāo)記技術(shù)是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來(lái)的一種基于蛋白質(zhì)和核酸分子突變的理想的遺傳標(biāo)記形式[8]。SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有帶型整齊、退火溫度高、重復(fù)性好、共顯性及操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)而得到了廣泛的應(yīng)用[9-10]。為了測(cè)定不同品種SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，多態(tài)片段的分離常用瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳方法來(lái)檢測(cè)[11-12]。

毛細(xì)管電泳是最近幾年發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，并不斷成熟，主要用于多肽、蛋白質(zhì)、核酸、離子和藥物的分離和測(cè)定[13]，技術(shù)原理是利用電場(chǎng)作為驅(qū)動(dòng)力，毛細(xì)管作為通道，根據(jù)分子量或堿基逐個(gè)分離，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品和多個(gè)標(biāo)記，大大提高了檢測(cè)效率和精確度[14-15]。2010年梁俊等[16]使用了SSR標(biāo)記和毛細(xì)管電泳對(duì)甘蔗進(jìn)行了遺傳分析，結(jié)果表明SSR分子標(biāo)記與毛細(xì)管技術(shù)結(jié)合，相比別的分子標(biāo)記技術(shù)或電泳技術(shù)，具有更準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)；2011年陳雅瓊等[17]利用SSR熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳對(duì)煙草進(jìn)行了遺傳分析，結(jié)果表明熒光檢測(cè)法克服了銀染法的不足，具有簡(jiǎn)便、可靠及高通量的優(yōu)點(diǎn)；2017年郭正兵等[18]通過(guò)SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳分析了30份無(wú)花果品種遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)了30份無(wú)花果品種資源表現(xiàn)出比較豐富的遺傳多樣性；2018年胡依依等[19]進(jìn)行了聚丙烯酰胺凝膠與毛細(xì)管電泳檢測(cè)龍須菜SSR位點(diǎn)的比較研究經(jīng)，測(cè)序檢驗(yàn)，PAGE結(jié)果均準(zhǔn)確，而毛細(xì)管電泳分型結(jié)果出現(xiàn)誤差。在樣本量少，SSR位點(diǎn)的變異小時(shí),使用PAGE檢測(cè)SSR位點(diǎn)更為準(zhǔn)確。

本研究選擇8個(gè)甜菜品種，8對(duì)SSR引物，利用聚丙烯酰胺電泳和毛細(xì)管電泳兩種檢測(cè)平臺(tái)，來(lái)檢驗(yàn)引物對(duì)品種的鑒定效果，為進(jìn)一步甜菜品種鑒定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取8個(gè)不同的甜菜品種，具體實(shí)驗(yàn)材料見(jiàn)表1。將種子播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，在室溫20℃，光照3500 lux的條件下培養(yǎng)10天，待幼苗長(zhǎng)至5 cm左右剪下，用無(wú)菌水沖洗干凈并晾干備用。

表1 甜菜品種信息表

1.2 主要試劑及儀器

PCR擴(kuò)增所用的主要試劑2xTaq PCRM ix、50 bp Marker購(gòu)自大連寶生物有限公司；引物由擎科生物有限公司合成。主要儀器有JY-JX5北京君意東方電泳儀，Nanodrop one超微量分光光度計(jì)，Thermal Cycler C1000 Touch型PCR儀，ABI3730高通量基因分析儀。

1.3 甜菜基因組DNA模板的提取

用CTAB法提取基因組DNA[20]，樣品放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SSR引物擴(kuò)增

選擇8個(gè)SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，具體引物信息見(jiàn)表2。常規(guī)反應(yīng)體系：在20μL的反應(yīng)體系中包括：100 μmol/L的上下游引物各 1μL，M IX（2×DNA Polymerase、Buffer、dNTPM ixture），2×Taq PCR M ix 10μL，10 ng/μL的DNA模板2.0μL，滅菌超純水補(bǔ)足至20μL，旋渦振蕩混勻。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3m in；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次；最后再72℃延伸5m in。

1.5 SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

1.5.1 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行檢測(cè)。在180V恒壓條件下電泳50m in。用改良的銀染法進(jìn)行染色顯影[21]。然后放置在白光板上拍照保存。

1.5.2 毛細(xì)管電泳檢測(cè) 將表2中SB13、Bvv23和GTT1合成ROX標(biāo)記的熒光引物，BvCA2、SB15和Bvv45合成FAM（藍(lán)）標(biāo)記的熒光引物，SSD6、SB06合成HEX（綠）標(biāo)記的熒光引物，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，等體積混合不同熒光標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻后從混合液中吸取1μL加入到DNA分析儀專用96孔板孔中，板中各孔分別加入0.1μL分子量?jī)?nèi)標(biāo)和8.9μL去離子甲酰胺。將樣品在PCR儀上95℃變性5m in后取出，立即置于碎冰上，冷卻10m in以上，離心10 s后放置到DNA分析儀上，隨后利用ABI3730XLDNA序列分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，檢測(cè)目的產(chǎn)物的片段大小，得到初始數(shù)據(jù)后用Gene Marker V2.2.0進(jìn)行分析并得到峰圖。

表2 SSR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 PAGE膠檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)PAGE膠上不同個(gè)體之間的差異性條帶可以得到每條條帶上的等位基因數(shù)目，等位基因數(shù)目為3個(gè)的多態(tài)性SSR位點(diǎn)包括BVV45、SB15和SSD6，等位基因數(shù)目為2個(gè)的多態(tài)性SSR位點(diǎn)包括BVV23、GTT1、SB06和SB13，而非多態(tài)性SSR引物包括BVCA2，如圖1所示。

圖1 引物PAGE膠檢測(cè)結(jié)果

2.2 毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)毛細(xì)管電泳分型結(jié)果分析，引物BvCA2、Bvv23分別在8個(gè)個(gè)體中出現(xiàn)2條不同分子量的DNA片段，引物SB13、SB06、GTT1、Bvv45分別在8個(gè)個(gè)體中出現(xiàn)3條不同分子量的DNA片段，引物SB15在8個(gè)個(gè)體中出現(xiàn)7條不同分子量的DNA片段。引物SSD6在8個(gè)個(gè)體中出現(xiàn)4條不同分子量的DNA片段，部分分型結(jié)果如下。圖2、圖3分別為SSR熒光標(biāo)記電泳檢測(cè)法對(duì)引物Bvv45、SB15擴(kuò)增產(chǎn)物分析的結(jié)果。結(jié)果表明，Bvv45分別在8個(gè)個(gè)體中出現(xiàn)3種分型結(jié)果如圖2，即140、212、231 bp；SB15引物在8個(gè)個(gè)體中出現(xiàn)了7種分型結(jié)果如圖3，即138、143、147、152、153、154、168 bp，總體信號(hào)清晰，可以直觀的看出不同峰型的堿基數(shù)，易于判斷，可以用于鑒定8個(gè)體多態(tài)性的檢測(cè)。

圖2 引物Bvv45特征峰圖

圖3 引物SB15特征峰圖

2.3 兩種方法的檢測(cè)結(jié)果比較

表3顯示8個(gè)品種在8對(duì)SSR引物上的毛細(xì)管電泳和PAGE結(jié)果的比較，PAGE與毛細(xì)管電泳分型結(jié)果一致的位點(diǎn)包括SB13，而分型結(jié)果不一致的位點(diǎn)包括BvCA2、BVV23、BVV45、GTT1、SB06、SB15和SSD6，不同引物兩種檢測(cè)方法的匹配比率分別是75%、87.5%、50%、75%、25%、100%、37.5%、50%。毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記法各分子樣品中均含有分子量?jī)?nèi)標(biāo)，因此可以準(zhǔn)確的知道DNA片段的分子大小，當(dāng)檢測(cè)樣品多時(shí)具有較高準(zhǔn)確性；PAGE電泳檢測(cè)不同樣品的分子量時(shí)，只能用肉眼觀察出與Marker比較估測(cè)得出大致分子量，不能得出準(zhǔn)確分子量。

表3 8個(gè)甜菜品種在8對(duì)SSR引物上的毛細(xì)管電泳和PAGE結(jié)果比較

3 討論與結(jié)論

3.1 PAGE電泳檢測(cè)SSR的方法探究

用PAGE進(jìn)行電泳時(shí)，可以選用6%或8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行檢測(cè)：有研究表明[22]，8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果由于凝膠濃度偏高，以致條帶模糊、不齊整，泳道痕跡明顯。6%的非變性聚丙烯酰胺的結(jié)果明顯，沒(méi)有拖尾，而且能將條帶均勻分開(kāi)，因此本實(shí)驗(yàn)采用6%的非變性聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳。

并且判斷SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，需要得到穩(wěn)定清晰的譜帶，因此在做膠技巧、電泳時(shí)間、上樣量、銀染時(shí)間等因素上進(jìn)行探究，得到以下經(jīng)驗(yàn)：做膠時(shí)的玻璃板要徹底清洗干凈，不能在上面有明顯的膠塊，否則在電泳結(jié)束時(shí)取下凝膠會(huì)使玻璃板與凝膠難以分離；緩沖液要定時(shí)更換，否則電泳時(shí)會(huì)使條帶偏離難以辨認(rèn)，影響結(jié)果的判斷；上樣時(shí)，一定要保證手穩(wěn)，輕按移液器，讓樣品緩慢輕柔地沉入進(jìn)樣孔內(nèi)，待全部樣品擠出槍頭后再緩慢拿走移液器，這樣可以防止出現(xiàn)條帶拖尾的現(xiàn)象；在銀染時(shí)間上，也需要時(shí)刻注意，切勿染色太久，會(huì)導(dǎo)致凝膠顏色過(guò)深難以分辨條帶，也不可以染色時(shí)間過(guò)短，導(dǎo)致條帶與凝膠分離不開(kāi)；電泳時(shí)間要控制在90min左右，時(shí)間過(guò)短不能使目標(biāo)條帶分離，會(huì)聚集在一起難以辨認(rèn)，而電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使目標(biāo)條帶跑到非變性凝膠外面以至于彌散存在。

3.2 PAGE電泳與毛細(xì)管電泳檢測(cè)SSR方法比較

毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記法各分子樣品中均含有分子量?jī)?nèi)標(biāo)，因此可以準(zhǔn)確的知道DNA片段的分子大小，當(dāng)檢測(cè)樣品多時(shí)具有較高準(zhǔn)確性，但是有的樣品的檢測(cè)結(jié)果丟失，峰圖雜亂沒(méi)有目標(biāo)峰，如GTT1引物的4號(hào)樣本和SB06引物的4號(hào)和7號(hào)樣本，然而PAGE電泳檢測(cè)目標(biāo)條帶明顯，因此可以排除無(wú)效等位基因的可能[23]，比較分析原因可能是由于在進(jìn)行熒光PCR時(shí)，加入的樣品較少或忘記加入熒光引物，如果只依靠毛細(xì)管電泳結(jié)果則無(wú)法判斷是否有無(wú)效等位基因。PAGE電泳檢測(cè)不同樣品的分子量時(shí)，只能用肉眼與Marker比較估測(cè)得出大致分子量，不能得出準(zhǔn)確分子量。

利用PAGE電泳進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需要一板96孔板中的64格，進(jìn)行電泳時(shí)只需兩塊玻璃膠，大約一小時(shí)后即可完成電泳銀染的過(guò)程，因此效率較高，而進(jìn)行毛細(xì)管電泳時(shí)，需要將PCR樣品送到生物公司再進(jìn)行檢測(cè)，隨后的數(shù)據(jù)整理過(guò)程也費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此，PAGE電泳具有效率高的優(yōu)點(diǎn)。

目前，利用毛細(xì)管電泳熒光比較法的高通量、智能化等優(yōu)點(diǎn)，分子標(biāo)記技術(shù)得到了迅速發(fā)展，該方法具有較高的靈敏度能夠較好地區(qū)分出不同的等位變異。傳統(tǒng)的PAGE檢驗(yàn)方式在樣本數(shù)量較多時(shí)不僅耗時(shí)、費(fèi)力，同時(shí)在對(duì)大量多批次的數(shù)據(jù)采集和分析過(guò)程中也有較大的缺陷，主要體現(xiàn)在對(duì)不同的等位變異數(shù)無(wú)法精確鑒定，對(duì)各個(gè)批次反映的數(shù)量也無(wú)法統(tǒng)一管理。毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)的創(chuàng)新之處在于：與銀染技術(shù)相比，熒光法具有更高的精度和效率，它能準(zhǔn)確地計(jì)算出微衛(wèi)星等位突變的擴(kuò)增片段，使其與高效自動(dòng)化技術(shù)相結(jié)合，并能有效地降低銀染對(duì)環(huán)境的影響。

本研究實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的特殊情況在跑PAGE膠是會(huì)出現(xiàn)不同程度的脫帶，會(huì)導(dǎo)致銀染所呈現(xiàn)的結(jié)果不清晰，讀帶不完整，因此可以看出普通的PAGE電泳具有實(shí)驗(yàn)上的誤差，不夠方便靈敏。熒光檢測(cè)技術(shù)的限制因素在于PCR需要運(yùn)送時(shí)間，數(shù)據(jù)分析也較為費(fèi)力。

但是，由于毛細(xì)管檢測(cè)法技術(shù)的費(fèi)用較高，相比之下銀染技術(shù)比較經(jīng)濟(jì)，常規(guī)使用的聚丙烯酰胺凝膠電泳法和銀染法可以很好的分辨出不同的種類，從而大大減少了測(cè)試費(fèi)用。利用熒光法進(jìn)行快速、高效、自動(dòng)化的毛細(xì)管電泳技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)前生命科學(xué)的一個(gè)熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，毛細(xì)管電泳技術(shù)操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，特別是DNA片段多態(tài)性的檢測(cè)，能更全面、準(zhǔn)確地反映出DNA的多態(tài)性和多態(tài)性。試驗(yàn)結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的銀染方法相比，這種方法具有更好的應(yīng)用前景。結(jié)果表明，該技術(shù)正朝著簡(jiǎn)便、快速、高通量、自動(dòng)化、智能化的方向發(fā)展。

綜上，通過(guò)比較PAGE膠與毛細(xì)管熒光檢測(cè)技術(shù)兩種技術(shù)，當(dāng)樣品較少時(shí)利用PAGE電泳的方法來(lái)檢測(cè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，既能節(jié)省成本又能節(jié)省時(shí)間，還能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，而樣品較多并且經(jīng)費(fèi)充足時(shí)，可以使用毛細(xì)管電泳的方法，可以減少操作人員與有毒害的聚丙烯酰胺凝膠、銀染液接觸，將操作人員從大量枯燥重復(fù)的實(shí)驗(yàn)中解脫開(kāi)來(lái)，自動(dòng)上樣的毛細(xì)管電泳可以提高工作效率，并且避免了由于人工操作引起的誤差[24]。