葉 倩，朱富偉，萬 凱，黃聰靈，唐雪妹

（1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測(cè)技術(shù)研究所，廣州 510640；2廣東省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

0 引言

復(fù)合蔬果汁飲品，旨在提供多種維生素、礦物質(zhì)的同時(shí)兼具有豐富的口感而備受青睞。但由于復(fù)合蔬果汁原料為多種新鮮蔬菜水果，而蔬菜水果在種植過程中不可避免的施用農(nóng)藥，同時(shí)盲目或過量地使用這些農(nóng)藥而造成的環(huán)境污染、農(nóng)藥超標(biāo)等問題使得蔬果汁中農(nóng)藥殘留存在一定的隱患。吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)、啶 蟲 脒 (acetamiprid)、噠 螨 靈(pyridaben)作為廣譜類的殺菌劑、殺蟲劑以及殺螨劑，目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，在初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品中也有一定的檢出率。吡唑醚菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，通過抑制線粒體呼吸作用，使細(xì)胞缺乏正常代謝所需能量，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1]。啶蟲脒作為煙堿類殺蟲劑，主要作用于昆蟲神經(jīng)結(jié)合部后膜,通過與乙酰膽堿受體結(jié)合使昆蟲興奮-痙攣-麻痹-死亡，同時(shí)對(duì)抗有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯類殺蟲劑的害蟲有特效[2]。噠螨靈作為一種噠嗪酮類殺螨劑，因其對(duì)食植性害螨具有明顯的防治效果而被廣泛應(yīng)用。目前中國(guó)對(duì)吡唑醚菌酯、啶蟲脒、噠螨靈在飲料類中只規(guī)定了茶葉、茉莉花、咖啡豆、啤酒花中的限量，而蔬果汁中并無相應(yīng)的限量規(guī)定[3]。因此，建立快速、靈敏的檢測(cè)方法，對(duì)監(jiān)測(cè)復(fù)合蔬果汁中農(nóng)藥的殘留具有一定的重要意義。

目前，吡唑醚菌酯和噠螨靈主要通過氣相色譜(GC)[4-7]、液相色譜(LC)[8-11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS)[12-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[14-16]等檢測(cè)方法進(jìn)行。啶蟲脒報(bào)道的比較多的檢測(cè)方法主要集中于液相色譜法(LC)[11,17]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LCMS/MS)[16,18]。由于氣相色譜法、液相色譜法的靈敏度較低，易受干擾，準(zhǔn)確度較低，在基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單的作物上的單個(gè)殺菌劑殘留分析中發(fā)揮著重要作用。質(zhì)譜法的選擇性和靈敏度相對(duì)較高，在果蔬、谷物、茶葉、中藥材、飲料、肉類等復(fù)雜基質(zhì)的多殘留分析中發(fā)揮著主要作用。復(fù)合蔬果汁基質(zhì)相對(duì)于一般的植物源、動(dòng)物源基質(zhì)酸性較大，含水量較高。本研究采用SPE凈化技術(shù)與LC-MS/MS結(jié)合，建立了一種快速、靈敏地檢測(cè)復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、啶蟲脒和噠螨靈殘留的定量分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)步驟

1.1 儀器與試劑

SHIMADZU 8050液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本島津公司）；漩渦振蕩器(德國(guó)海道爾夫公司)；離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；超純水儀（美國(guó)密理博公司）；電子天平(梅特勒-托利多儀器(中國(guó))有限公司)；氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）。

色譜級(jí)乙腈、二氯甲烷、甲醇（德國(guó)默克公司）；色譜級(jí)甲酸（美國(guó)西格瑪公司）；SPE-NH2固相萃取柱（美國(guó)安捷倫公司）；分析純乙酸、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉（廣州化學(xué)試劑廠）。尼龍濾膜（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)、噠螨靈(pyridaben)和啶蟲脒(acetamiprid)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1000mg/L(純度≥99.0%)，購(gòu)置于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

復(fù)合蔬果汁購(gòu)于本地超市。分別以番茄，芒果和橙子作為基底液的3種復(fù)合蔬果汁，在外觀顏色上分別呈現(xiàn)紅色、黃色、橙色。

1.2 樣品的提取以及凈化

提?。悍Q取10.00 g樣品，用20m L酸化乙腈溶液（含體積分?jǐn)?shù)1%乙酸），渦旋振蕩5m in進(jìn)行提取，后加入4.00 g無水硫酸鎂、2.00 g無水乙酸鈉，再次渦旋振蕩2 m in；以4500 r/m in離心5 m in[19]，取上清液10 m L于另一干凈離心管中，氮吹至凈干，使用2m L二氯甲烷-甲醇（體積比95:5）混合液復(fù)溶，等待下一步凈化。

凈化：首先采用4m L二氯甲烷-甲醇（體積比95:5）混合液對(duì)所使用的SPE-NH2凈化柱進(jìn)行活化，當(dāng)溶劑液面達(dá)到凈化柱吸附層表面時(shí)，且溶劑未完全流凈時(shí)，加入提取待凈化溶液，用4m L二氯甲烷-甲醇（體積比95:5）混合液洗滌離心管后，再次對(duì)SPE-NH2凈化柱進(jìn)行洗脫，重復(fù)2次，收集洗脫液，用氮?dú)獯凳占降南疵撘褐两?，用乙腈定容?m L，使用尼龍濾膜過濾后，等待儀器測(cè)定。

1.3 LC-MS/MS條件

色譜柱：島津Shim-pack XB-18色譜柱(2.1mm×50mm,2.6μm)。液相色譜及串聯(lián)質(zhì)譜儀器條件[19-20]見表1；吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表2。

表1 LC-MS/MS條件

表2 吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液，用適宜溶劑配制成儲(chǔ)備液，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ捎?種目標(biāo)物在所用儀器的靈敏度不同，因此分別使用經(jīng)測(cè)定不含目標(biāo)化合物的復(fù)合蔬果汁基質(zhì)溶液將吡唑醚菌酯和噠螨靈配制為 0.001、0.005、0.010、0.050、0.10、0.50 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；將啶蟲脒配制為0.005、0.010、0.050、0.10、0.50、1.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以1.3節(jié)所述儀器條件進(jìn)行檢測(cè)，以各待測(cè)目標(biāo)化合物的定量離子響應(yīng)值為縱坐標(biāo)(y)，以對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)得到各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線[21]，以便得到3種待測(cè)物的線性方程以及相關(guān)系數(shù)(R2)。

1.5 正確度和精密度

稱取經(jīng)測(cè)定不含吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒的復(fù)合蔬果汁樣品10.00 g，使用標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液進(jìn)行0.010、0.10和0.50mg/kg 3個(gè)濃度的添加[21]，每個(gè)添加濃度重復(fù)6次。渦旋混勻后，按照1.2節(jié)所述條件進(jìn)行樣品前處理。計(jì)算各添加濃度平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，用以考察方法的正確度和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑優(yōu)化

介于3種復(fù)合蔬果汁組成上的差別，致使不同復(fù)合蔬果汁在組成成份以及pH值存在一定的差異。試驗(yàn)采用乙腈和酸化乙腈進(jìn)行了提取溶劑優(yōu)化。結(jié)果如圖1所示：使用乙腈提取時(shí)，吡唑醚菌酯的回收率為88.5%～118.6%，RSD為3.6%～16.0%；噠螨靈的回收率為97.4%～111.6%，RSD為4.5%～15.7%；啶蟲脒的回收率處于73.1%～125.6%之間，RSD為7.3%～13.4%；使用含1%(v%)乙酸的乙腈溶液提取時(shí)3種農(nóng)藥的回收率在87.5%～106.8%之間，RSD為1.3%～9.5%，回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均優(yōu)于使用乙腈的提取效果。分析其原因，可能是由于提取液中所含有的乙酸與后續(xù)提取中所加入的無水乙酸鈉形成了一個(gè)緩沖體系，穩(wěn)定了提取體系的同時(shí)對(duì)目標(biāo)物的提取也產(chǎn)生了一定的促進(jìn)作用，確切原因需要進(jìn)一步的研究考證。

圖1 不同提取溶劑對(duì)不同復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈、啶蟲脒的提取效果影響

2.2 SPE柱洗脫液的優(yōu)化

基于3種復(fù)合蔬果汁成分以及pH上的差異，試驗(yàn)對(duì)比了采用氨基SPE柱進(jìn)行樣品凈化時(shí)，分別使用二氯甲烷-甲醇和乙腈-甲苯作為洗脫液時(shí)對(duì)3種農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果如圖2所示：使用二氯甲烷-甲醇為洗脫液時(shí)3種被試物的回收率為87.5%～106.8%，RSD為1.3%～9.5%；采用乙腈-甲苯為洗脫液時(shí)3種被試物的回收率為67.8%～119.9%，RSD為0.6%～14.5%。相比之下二氯甲烷-甲醇為洗脫液時(shí)3種被試物的回收率及RSD相對(duì)穩(wěn)定。本研究中最終使用二氯甲烷-甲醇為洗脫液，氨基SPE柱進(jìn)行樣品凈化。

圖2 不同洗脫溶劑對(duì)不同復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈、啶蟲脒的洗脫效果影響

2.3 線性方程、檢出限和定量限

使用1.4節(jié)所述方法配制吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒系列梯度基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到3種目標(biāo)化合物的線性方程。結(jié)果表明（表3）：吡唑醚菌酯和噠螨靈在0.001～0.50mg/L、啶蟲脒在0.005～1.0mg/L范圍內(nèi)，3種目標(biāo)化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)在0.9984以上。定量限(LOQ)為最低添加濃度0.010mg/kg。

2.4 正確度和精密度

用復(fù)合蔬果汁空白基質(zhì)分別添加0.01、0.10、0.50mg/kg 3個(gè)濃度的上述3種農(nóng)藥，以測(cè)定方法的正確度和精密度。按照1.2節(jié)方法進(jìn)行前處理，1.3節(jié)方法進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明（表3）：添加0.010、0.10、0.50mg/kg 3個(gè)濃度時(shí)，3種目標(biāo)農(nóng)藥的平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別介于80.6%～113.4%、0.5%～9.3%之間，可以滿足復(fù)合蔬果汁中目標(biāo)農(nóng)藥的定性、定量分析要求[22]。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

為了提高目標(biāo)化合物的測(cè)定準(zhǔn)確度，需要對(duì)不同基質(zhì)產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)作出評(píng)價(jià)，并選擇合適的方法減小基質(zhì)效應(yīng)的影響。本研究采用基質(zhì)效應(yīng)=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)-純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)）/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)×100[23]的方式對(duì)試驗(yàn)中所產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在0.10mg/L時(shí)，3種農(nóng)藥在3種復(fù)合蔬果汁中的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表3：吡唑醚菌酯在3種復(fù)合蔬果汁中都表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，且3種蔬果汁中的差異相對(duì)較大，其中橙汁為基底液的復(fù)合蔬果汁中表現(xiàn)最強(qiáng)，達(dá)到56.8%。噠螨靈在3種復(fù)合蔬果汁中既有增強(qiáng)效應(yīng)也有減弱效應(yīng)，番茄、芒果為基底液的復(fù)合蔬果汁中表現(xiàn)出較弱的基質(zhì)減弱效應(yīng)-2.1%～-4.0%；而橙汁為基底液的復(fù)合蔬果汁中則表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)24.2%。啶蟲脒在3種復(fù)合蔬果汁中既有增強(qiáng)效應(yīng)也有減弱效應(yīng)，番茄、芒果為基底液的復(fù)合蔬果汁中表現(xiàn)出較強(qiáng)的基質(zhì)減弱效應(yīng)-56.0%～-54.0%；而橙汁為基底液的復(fù)合蔬果汁中則表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)14.2%。分析發(fā)現(xiàn)，3種農(nóng)藥在橙汁為基底液的復(fù)合蔬果汁中均表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。在番茄、芒果為基底液的復(fù)合蔬果汁中則有所不同，分析是否與基質(zhì)的成分以及酸堿度(pH)有關(guān)，或者其他可能的原因需進(jìn)一步研究分析確證。因此為保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，本論文中采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)，進(jìn)而消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

表3 復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒殘留測(cè)定方法確認(rèn)(n＝6)

3 討論與結(jié)論

本研究建立了LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒殘留的方法。目前文獻(xiàn)中對(duì)這3種目標(biāo)物的殘留測(cè)定主要集中于蔬菜、水果等初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品以及土壤中，對(duì)于加工后農(nóng)產(chǎn)品的報(bào)道相對(duì)較少。因此，本方法建立的在酸性較強(qiáng)且含水量較高的基質(zhì)中同時(shí)測(cè)定吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒3種不同種類農(nóng)藥殘留的方法在一定程度上彌補(bǔ)了這個(gè)空缺。同時(shí)，本研究中的目標(biāo)物是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的3種殺菌劑、殺螨劑、殺蟲劑，對(duì)后續(xù)相似基質(zhì)中同類目標(biāo)物的殘留分析提供一定參考數(shù)據(jù)。

本研究中的基質(zhì)酸性較強(qiáng)且含水量較高，對(duì)于一些酸不穩(wěn)定的殘留物來說，在酸性條件下是否會(huì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物是否也同樣會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生一定的潛在危害，是否需要一并測(cè)定，需進(jìn)一步進(jìn)行研究討論。因此，使用該方法時(shí)可以根據(jù)目標(biāo)物在酸性環(huán)境是否會(huì)產(chǎn)生代謝物進(jìn)行考慮，必要時(shí)可對(duì)相關(guān)代謝物也一并進(jìn)行測(cè)定。本研究是否適用于在酸性條件下不穩(wěn)定易降解的目標(biāo)物，本文并沒有進(jìn)一步進(jìn)行研究，這也需進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的角度，單個(gè)農(nóng)產(chǎn)品的攝入，對(duì)人體健康產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，與同時(shí)攝入多種農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)也存在差異。同時(shí)攝入多種農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)產(chǎn)生疊加效應(yīng)，因此需進(jìn)一步進(jìn)行探討。

本研究通過優(yōu)化樣品提取和凈化方法，建立了LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒殘留的方法。本方法提供了在酸性較強(qiáng)且含水量較高的基質(zhì)中同時(shí)測(cè)定吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒3種不同種類農(nóng)藥殘留的方法，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)，從而有效降低了檢測(cè)過程中串聯(lián)質(zhì)譜所產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度的影響。樣品前處理相對(duì)簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高，方法的線性關(guān)系在0.9984以上、在添加濃度為0.010、0.10和0.50 mg/kg時(shí)，3種目標(biāo)物的回收率為80.6%～113.4%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)介于0.5%～9.3%之間，正確度和精密度等指標(biāo)均可滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求[22]，該方法適用于復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒等同類農(nóng)藥殘留的同時(shí)檢測(cè)分析。