李煥娟，?？?，周 冰，楊絨娟，潘貴珍，周德剛

(洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司，國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南洛陽(yáng) 471003)

雙葛止瀉口服液由金銀花、葛根等經(jīng)提取、濃縮、純化及制劑成型而成的中藥口服溶液，功能清熱燥濕，解毒止瀉，用于仔豬濕熱泄瀉，實(shí)驗(yàn)室研究其具有止瀉、抗炎的作用。在獸藥生產(chǎn)、貯藏和使用過(guò)程中，為防止雙葛止瀉口服液中微生物生長(zhǎng)繁殖，需要加入適宜的抑菌劑用以增加抑菌作用。抑菌劑是指抑制微生物生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)，有時(shí)也稱(chēng)防腐劑[1]。在口服制劑中，苯甲酸鈉因其對(duì)酵母、霉菌和部分細(xì)菌都有較好的抑制作用而被廣泛應(yīng)用[2-3]，其用量范圍一般為0.1%～0.5%[4]。由于抑菌劑都具有一定的毒性，制劑中抑菌劑的量應(yīng)為最低有效量[1]。

抑菌劑的抑菌有效性主要是通過(guò)抑菌效力檢查法進(jìn)行測(cè)定的。抑菌效力檢查是對(duì)供試品中微生物的存活情況的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)過(guò)程。既要研究供試品被微生物污染后在短時(shí)間內(nèi)抑菌劑對(duì)大量入侵微生物的抑制或殺滅的情況，又要研究隨著時(shí)間的推移微生物對(duì)周?chē)h(huán)境產(chǎn)生耐受或抑菌劑的穩(wěn)定性發(fā)生改變后，供試品中微生物的總量是否仍能夠被控制在合理范圍內(nèi)。

本研究依據(jù)《中國(guó)獸藥典》2015年版一部附錄“1121抑菌效力檢查法”的要求，對(duì)雙葛止瀉口服液中的抑菌劑用量進(jìn)行篩選，用以確定抑菌劑的最低有效用量。參考《中國(guó)獸藥典》2015年版二部附錄“1102非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”和附錄“1104非無(wú)菌獸藥微生物限度標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)方法適用性研究，確定供試品合適的微生物計(jì)數(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 YP10002型電子天平，金諾天平儀器有限公司；YXQ-LS-100A型全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；電熱恒溫水浴鍋，型號(hào)SSW-420-2S，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，型號(hào)DNP-9272BS-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；雙人超凈工作臺(tái)，型號(hào)SW-CJ-2FD，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；集菌儀，型號(hào)HTY-602，浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司；微量移液器，規(guī)格100 μL、1000 μL、5 mL，德國(guó)Eppendorf公司；

1.1.2 培養(yǎng)基及稀釋液 胰酪大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基，批號(hào)20170116；胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)20161018；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)20160924；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，批號(hào)20160224；pH值7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液，批號(hào)20160321；均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。培養(yǎng)基適用性檢查符合《中國(guó)獸藥典》2015年版要求。

1.1.3 菌種 金黃色葡萄球菌〔CMCC(B) 26003〕、銅綠假單胞菌〔CMCC(B) 10104〕、大腸埃希菌〔CMCC(B) 44102〕、白色念珠菌〔CMCC(F) 98001〕、黑曲霉菌〔CMCC(F) 98003〕，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。

1.1.4 試藥 雙葛止瀉口服液，規(guī)格：每1 mL相當(dāng)于原生藥0.45 g，250 mL/瓶。按照雙葛止瀉口服液制備工藝制備苯甲酸鈉含量分別為0.1%、0.2%、0.3%和0.5%的樣品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌液的制備 取經(jīng)35 ℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及大腸埃希菌的胰酪大豆胨瓊脂斜面培養(yǎng)物適量，另取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物適量，加入適量的無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液，制成含菌數(shù)約為107～108CFU/mL的菌懸液(用于抑菌效力檢查)。取上述菌懸液用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液稀釋成含菌數(shù)約為50～100 CFU/mL的菌懸液(用于微生物計(jì)數(shù)方法適應(yīng)性研究)。取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物，加入5 mL含0.05%(V∶V)聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液，洗下孢子，制成含孢子數(shù)約為107～108CFU/mL的孢子懸液(用于抑菌效力檢查)。取上述孢子懸液用含0.05%(V∶V)聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液稀釋成含孢子數(shù)約為50～100 CFU/mL的孢子懸液(用于微生物計(jì)數(shù)方法適應(yīng)性研究)。

1.2.2 微生物計(jì)數(shù)方法適用性研究 考慮到抑菌劑苯甲酸鈉具較強(qiáng)的抗菌活性，因此，在細(xì)菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)時(shí)應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法去除其抑菌活性；由于抑菌劑的濃度與抑菌效果成正相關(guān)，故本研究以最大添加抑菌劑0.5%苯甲酸鈉的供試品進(jìn)行方法適用性研究，以保證所有濃度抑菌劑供試品微生物計(jì)數(shù)方法均能符合要求。

1.2.2.1 供試液的制備 取苯甲酸鈉含量為0.5%的雙葛止瀉口服液供試品10 mL至無(wú)菌玻璃瓶中，分別加入90 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，充分混合，制成1∶10(V∶V)的供試液。

1.2.2.2 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)方法(薄膜過(guò)濾法)

分別按以下方法對(duì)5種試驗(yàn)菌株進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。

試驗(yàn)組：用pH值7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，潤(rùn)濕濾膜后(水膜)，取供試液1 mL加入100 mL pH值7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻，加入薄膜過(guò)濾器的濾筒中過(guò)濾，用pH值7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL，最后一次沖洗時(shí)，沖洗液中加入50～100 CFU/mL的試驗(yàn)菌1 mL，搖勻后，濾過(guò)濾膜。

供試品對(duì)照組：用pH值7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，潤(rùn)濕濾膜后(水膜)，取供試液1 mL加入100 mL pH值7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻，加入薄膜過(guò)濾器的濾筒中過(guò)濾，用pH值7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL。

菌液對(duì)照組：用pH值7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，潤(rùn)濕濾膜后(水膜)，用100 mL pH值7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液過(guò)濾，再用pH值7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL，最后一次沖洗時(shí)，沖洗液中加入50～100 CFU /mL的試驗(yàn)菌1 mL，搖勻后，濾過(guò)濾膜。

陰性對(duì)照組：用pH值7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，潤(rùn)濕濾膜后(水膜)，用pH值7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL。

過(guò)濾完成后將濾膜取出，將濾膜的菌面朝上貼于瓊脂平板上。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌制備的濾膜貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)。白色念珠菌和黑曲霉平行制備2份濾膜，一份貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)；另一份貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)。

1.2.3 抑菌效力測(cè)定方法

1.2.3.1 供試品制備 取包裝完整的苯甲酸鈉含量分別為0.1%、0.2%、0.3%和0.5%的雙葛止瀉口服液供試品各10 mL至無(wú)菌玻璃瓶中，分別加入90 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，充分混合，制成1∶10(V∶V)的供試液。

1.2.3.2 供試品接種 取“1.2.1”項(xiàng)下制成的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及大腸埃希菌的菌懸液(含菌數(shù)約為107～108CFU/mL)及孢子懸液(含孢子數(shù)約為107～108CFU/mL)，分別取0.1 mL試驗(yàn)菌于上述4份供試液中，每一容器接種一種試驗(yàn)菌，充分混合，使供試液中的試驗(yàn)菌均勻分布，置25 ℃培養(yǎng)箱中，避光貯存。

1.2.3.3 存活菌數(shù)測(cè)定 根據(jù)《中國(guó)獸藥典》2015年版一部附錄“1121抑菌效力檢查法”中表2-表3的規(guī)定，在供試品接種0 h、14 d、28 d時(shí)，分別從上述每個(gè)供試品容器中取供試品1 mL，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成1∶10、1∶102、1∶103等稀釋級(jí)，測(cè)定每份供試品中所含的菌數(shù)。其中測(cè)定方法依據(jù)1.2.2.2方法適用性試驗(yàn)驗(yàn)證合格的方法(薄膜過(guò)濾法)進(jìn)行供試品中微生物計(jì)數(shù)。

1.2.3.4 抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn) 內(nèi)服制劑的抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。表中“減少的lg值”是指各間隔時(shí)間測(cè)定的菌落lg值與1 mL供試品中接種的菌數(shù)lg值的差值。

表1 內(nèi)服制劑的抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 方法適用性試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)《中國(guó)獸藥典》2015年版二部要求，方法適用性檢查各試驗(yàn)菌的回收率不得低于70%。試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 抑菌效力測(cè)定結(jié)果 抑菌效力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。參考內(nèi)服制劑的抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)，雙葛止瀉口服液中苯甲酸鈉含量為0.1%時(shí)，對(duì)白色念珠菌的抑制作用在間隔14 d和28 d均減少了0.7 lg，未達(dá)到藥典規(guī)定的至少降低1 lg的標(biāo)準(zhǔn)；雙葛止瀉口服液中苯甲酸鈉含量為0.2%時(shí)，對(duì)白色念珠菌的抑制作用在間隔14 d和28 d均減少了0.9 lg，未達(dá)到藥典規(guī)定的至少降低1 lg的標(biāo)準(zhǔn)；雙葛止瀉口服液中苯甲酸鈉含量為0.3%和0.5%時(shí)，對(duì)細(xì)菌和真菌的抑菌效力均達(dá)到了《中國(guó)獸藥典》2015年版的抑菌效力判定標(biāo)準(zhǔn)。

表3 接種后0 h細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果(CFU/mL)

表4 接種后14 d細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果(CFU/mL)

表5 接種后28 d細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果(CFU/mL)

3 討論與結(jié)論

3.1 抑菌劑用量篩選方法選擇的依據(jù) 雙葛止瀉口服液為非無(wú)菌制劑，在制劑中添加適宜的抑菌劑，用以防止制劑在正常貯藏或使用過(guò)程中由于微生物的生長(zhǎng)繁殖影響藥物質(zhì)量。抑菌效力檢査法是篩選抑菌劑用量的有效方法，可用于測(cè)定無(wú)菌及非無(wú)菌制劑的抑菌活性，用于指導(dǎo)研發(fā)階段制劑中抑菌劑用量的確定[5-10]，因此本研究采用抑菌效力檢查法篩選抑菌劑的用量。

3.2 抑菌劑用量篩選的重要性 抑菌劑用量的篩選非常重要，抑菌劑添加量過(guò)少，會(huì)使微生物生產(chǎn)繁殖從而引起污染，抑菌劑添加量過(guò)多，會(huì)引起不適或過(guò)敏等變態(tài)反應(yīng)。理想的抑菌劑應(yīng)作用迅速，其應(yīng)在使用濃度范圍內(nèi)安全無(wú)毒，與制劑中其他成分和包裝材料相容性良好[11-12]。由于苯甲酸鈉價(jià)格便宜，被廣泛用于食品、制藥行業(yè)[4]，雙葛止瀉口服液擬用于仔豬腹瀉，考慮到經(jīng)濟(jì)動(dòng)物使用成本因素，因此選擇苯甲酸鈉作為雙葛止瀉口服液的抑菌劑。苯甲酸鈉防腐作用依靠苯甲酸未解離分子，因此，pH值對(duì)其抑菌效果影響較大，雙葛止瀉口服液為弱酸性液體，因此選用苯甲酸鈉作為防腐劑是合理的。按照《中國(guó)獸藥典》2015年版一部附錄“1121抑菌效力檢查法”內(nèi)服制劑抑菌劑效力判斷標(biāo)準(zhǔn)，雙葛止瀉口服液中苯甲酸鈉含量為0.3%和0.5%時(shí)，均能滿(mǎn)足抑菌劑效力試驗(yàn)要求，但根據(jù)最小有效量添加的原則，確定雙葛止瀉口服液中苯甲酸鈉含量為0.3%，本結(jié)果與同類(lèi)中藥口服液體制劑考察結(jié)果基本一致[9]。

表6 含不同用量苯甲酸鈉的雙葛止瀉口服液樣品抑菌效力檢查結(jié)果

3.3 結(jié)論 綜上，根據(jù)《中國(guó)獸藥典》2015年版一部附錄“1121抑菌效力檢查法”的要求，0.3%的苯甲酸鈉可作為雙葛止瀉口服液的抑菌劑用量。