李曉艷，齊志濤，王秉昆，趙麗霞，溫學(xué)平，李 超，方建國，高艷華，楊青春，賀 瑤，張 靜，宋慶慶，陳 堅

(金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特 010100)

塞內(nèi)卡病毒病是近年來新發(fā)的一種豬傳染病，由小核糖核酸病毒科塞內(nèi)卡病毒屬的 A 型塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus A，SVA)引起[1]。SVA在 2002 年首次發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞培養(yǎng)基中，被認(rèn)為可能是由胎牛血清或豬胰蛋白酶引入人類胎兒視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)物中的污染物[2]。2015年我國廣東首次發(fā)現(xiàn)SVA的存在，隨后逐漸蔓延至其他省份。豬感染SVA后的臨床表現(xiàn)與感染口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)類似，通常表現(xiàn)為沉郁、體溫升高、厭食、跛行、蹄部和鼻吻出現(xiàn)水皰[1],臨床上難以區(qū)分。SVA感染的診斷目前主要依賴于病原學(xué)和血清學(xué)方法，防控方面仍無商品化疫苗可用。另外，隨著SVA在我國的傳播，其毒力也逐漸致弱，目前國內(nèi)豬場已頻繁出現(xiàn)亞臨床感染情況[3]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2018年發(fā)布了《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于做好SVA病防治工作的通知》，可見對該疫病的重視程度。在進行細(xì)胞培養(yǎng)、提升病毒效價、優(yōu)化純化工藝的同時，佐劑的選擇也是疫苗制備的關(guān)鍵因素。因此，本試驗通過自主合成佐劑原料、篩選最優(yōu)佐劑配方，制備了SVA滅活疫苗，并與進口佐劑(ISA206)疫苗進行理化性質(zhì)、安全性、中和抗體及攻毒保護對比試驗，以期篩選最優(yōu)佐劑用于SVA滅活疫苗的研制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 塞內(nèi)卡病毒SVV-CH/ZZ/2016株滅活抗原液，批號2021003，病毒含量108.0TCID50/0.1mL；用于做中和試驗的病毒液SVV-CH/ZZ/2016株、攻毒毒株SVV-CH/22/2016株，F(xiàn)7，批號19023，病毒含量106.5TCID50/0.1mL;PK-15細(xì)胞(豬腎細(xì)胞);塞內(nèi)卡病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清;以上均由金宇保靈生物藥品有限公司獸用疫苗國家工程實驗室制備保存。體重18～22 g清潔級小鼠30只，購自呼和浩特市內(nèi)蒙古大學(xué)動物實驗部；90日齡以上架子豬12頭，60日齡以上架子豬30頭，購自呼和浩特市草原立新養(yǎng)豬場；ISA206佐劑購自法國賽比科公司，批號200218023298；佐劑制備原料：失水山梨醇購自山東天力藥業(yè)有限公司，批號202000312；植物油酸購自四川西普化工股份有限公司。美國貝克曼粒經(jīng)儀LS-230購自常州昆耀自動化科技有限公司，二級生物安全柜購自香港力申發(fā)展有限公司；水浴鍋HH-420購自常州智博瑞儀器制造有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Fisher 14291；IKA EUROSTAR 60control懸臂攪拌器、攪拌槳R1345購自艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司。

1.2 佐劑制備

1.2.1 親油性表面活性劑的制備[4]將已蒸餾的失水山梨醇與植物油酸分階段投入反應(yīng)釜內(nèi)，加入催化劑，升溫，開啟攪拌釜至均勻攪拌，隨后減壓升溫于205±5 ℃/700 mmHg以上反應(yīng)5 h。反應(yīng)完畢后待反應(yīng)物冷卻放出，靜置24 h分去黑色膠狀物，將上層澄清液抽入脫色鍋內(nèi)加熱至65 ℃，加入催化劑，繼而在攪拌下于80 ℃脫色1 h，過濾，即得親油性表面活性劑。

1.2.2 親水性表面活性劑的制備 將親油性表面活性劑加入不銹鋼反應(yīng)釜中，加熱熔化，攪拌，加入催化劑，逐漸升溫，減壓脫水，當(dāng)溫度上升至120 ℃通氮氣，以驅(qū)除釜內(nèi)空氣，經(jīng)數(shù)次充氮驅(qū)氧后開始通入環(huán)氧乙烷，當(dāng)反應(yīng)溫度至180 ℃，通入的環(huán)氧乙烷接近需求量時，取樣測定終點，然后降溫至80 ℃左右時加入催化劑，20 min后進行升溫脫水15 min，繼續(xù)攪拌1 h，冷卻，放料，得到親水性表面活性劑。

1.2.3 佐劑合成 按照表1佐劑成分配比所示，分別量取相應(yīng)成分，混合加入燒杯或佐劑配制罐內(nèi)，升溫至45 ℃開啟攪拌槳勻速攪拌，充分溶解和混合油相至澄清透明狀，分別裝入透氣性瓶內(nèi)于121 ℃高壓滅菌30 min。

表1 自制佐劑成分配比

1.3 疫苗配制 取塞內(nèi)卡病毒SVV-CH/ZZ/2016株純化濃縮滅活抗原液2500 g平均分為5份，再分別稱取JY-1、JY-2、JY-3、JY-4、ISA206佐劑各500 g，在30 ℃環(huán)境下將5份抗原分別緩慢加入5份佐劑，期間以400 r/min勻速攪拌10 min，使水相與油相充分混合，維持30 min后迅速轉(zhuǎn)移至2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 疫苗檢測

1.4.1 理化檢測

1.4.1.1 外觀檢查 將5批疫苗倒至透明玻璃瓶中，在自然光照下觀察產(chǎn)品的顏色及狀態(tài)。

1.4.1.2 劑型檢查 取適量冷水至500 mL燒杯中，待液面平靜后，取一清潔1 mL吸管，分別吸取5批疫苗各1 mL，從距冷水液面上方2～3 cm處滴入，3～5 s后再滴入2～3滴疫苗，從上方觀察疫苗在液面的擴散情況，從容器側(cè)面觀察疫苗向下擴散的情況，并記錄液滴的擴散結(jié)果。

1.4.1.3 穩(wěn)定性檢測 將5批疫苗溫度恢復(fù)至室溫，吸取疫苗10 mL加入離心管中，3000 r/min離心15 min，輕輕取出離心管，觀察離心管底是否有水相析出，并記錄水相體積。

1.4.1.4 黏度檢測 5批疫苗分別吸取1 mL，緩緩加入樣品杯內(nèi)，在扭矩40%～60%、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速6～16 r/min的條件下，用黏度計測定疫苗黏度。

1.4.1.5 粒徑檢測 用美國貝克曼粒徑儀檢測器探測散射光強度，計算顆粒粒度分布。

1.4.2 無菌檢驗 用注射器分別抽取2 mL疫苗，接種TG小管2支、1支TSB小管，每支0.2 mL，TSB小管置23～25 ℃培養(yǎng)，1支TG小管置35～37 ℃培養(yǎng)，另1支TG小管置23～25 ℃培養(yǎng)，同時設(shè)TG小管2支、TSB小管1支做空白對照，置相應(yīng)溫度培養(yǎng)。各管均培養(yǎng)7 d，每天觀察并做記錄。

1.4.3 內(nèi)毒素含量測定 分別吸取45 mL疫苗放入50 mL離心管中，置50±5 ℃水浴90 min，在4 ℃條件下，以9500 r/min離心25 min，用帶長針頭的注射器吸出下層水相5.0 mL(先吸取3 mL棄去再吸取2 mL)備用；擇供試品陰性對照和供試品陽性對照，分別用移液器準(zhǔn)確吸取0.1 mL加入反應(yīng)管，依次加入復(fù)溶好的鱟試劑0.1 mL?；靹蚝笱杆賹⒎磻?yīng)管插入內(nèi)毒素檢測儀檢測。

1.4.4 總蛋白含量測定 取1瓶疫苗恢復(fù)至室溫?fù)u勻后，用1 mL注射器吸取一定量疫苗，在3個1.5 mL離心管中分別精確加入100 μL疫苗，用移液器準(zhǔn)確吸取900 μL丙酮，分別加入上述盛有疫苗的離心管中，蓋好蓋子后充分震蕩混勻，室溫放置10 min，在4 ℃條件下，以15000 r/min離心15 min。取出后，先用移液器吸棄上層的液相，只保留白色沉淀物，再用移液器分別吸取200 μL丙酮對沉淀物進行2次洗滌，將離心管開蓋倒置放于紙巾上控干，室溫干燥約15 min后，用移液器準(zhǔn)確加入50 μL純化水復(fù)溶，用Lowry法試劑盒測定總蛋白含量。

1.4.5 安全性試驗

1.4.5.1 小動物安全性試驗 體重18～22 g小鼠30只，隨機分為6組，每組5只，5個免疫組(JY-1、JY-2、JY-3、JY-4、ISA206)各皮下注射疫苗1.0 mL，1個對照組皮下注射生理鹽水1 mL。逐日觀察7 d，觀察小鼠有無死亡或明顯的局部反應(yīng)或全身不良反應(yīng)，7 d后剖檢注射部位，觀察有無潰爛、增生、腫塊。

1.4.5.2 本動物安全性試驗 用90日齡以上健康豬(SVA細(xì)胞中和抗體滴度不高于1∶2或血清ELISA抗體檢測陰性)12頭，隨機分為6組，每組2頭，5個免疫組各兩側(cè)耳根后肌肉分點注射疫苗6 mL(3頭份)，每側(cè)3 mL，連同對照組逐日觀察10 d并監(jiān)測體溫，觀察豬是否出現(xiàn)塞內(nèi)卡病毒病癥狀或因注射疫苗引起的死亡，以及是否出現(xiàn)明顯的局部反應(yīng)或全身不良反應(yīng)。

1.4.6 效力試驗 選取60日齡以上健康易感豬(SVA細(xì)胞中和抗體滴度不高于1∶2或血清ELISA抗體檢測陰性)30頭，隨機分為6組，每組5頭。每個免疫組5頭豬耳根后肌肉注射疫苗2 mL，免疫后第21天以相同劑量、相同接種方法加強免疫1 次，對照組5頭豬不接種疫苗。分別于免前、一免7 d、一免14 d、一免21 d、二免7 d、二免14 d對疫苗試驗組豬只采血進行抗體監(jiān)測，于二免14 d連同對照組，每頭滴鼻檢驗毒5 mL(0.1 mL毒液病毒含量不低于107.0TCID50)，左右鼻孔各2.5 mL。攻毒后每日觀察豬的發(fā)病情況，連續(xù)觀察10 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般檢驗結(jié)果 5組SVA滅活疫苗理化檢驗均符合疫苗生產(chǎn)規(guī)程要求：5組疫苗外觀均呈性狀均勻的乳劑；劑型為水包油包水型；穩(wěn)定性檢測均未出現(xiàn)水相析出；粒徑檢測結(jié)果為單峰，無雜峰；無菌檢驗結(jié)果為陰性；內(nèi)毒素濃度均低于0.25 EU/頭份；蛋白含量在56～63 μg/mL之間；四組JY佐劑制備的SVA滅活疫苗黏度檢測結(jié)果為26.54～27.88 cP，均低于ISA206佐劑制備的疫苗(黏度為43.02 cP)，詳見表2。

表2 5組SVA滅活疫苗一般檢驗結(jié)果

2.2 安全性試驗結(jié)果

2.2.1 小動物安全性試驗 本實驗制備的5種滅活疫苗對小鼠注射部位的皮下組織均無刺激性，注射局部均未見潰爛、增生、腫脹及其他與疫苗相關(guān)的反應(yīng)，5種佐劑制備的疫苗免疫小鼠后，小鼠剖檢結(jié)果均未見明顯異常，見圖1。

A：JY-1組；B：JY-2組；C：JY-3組；D：JY-4組；E：ISA206組；F：對照組

2.2.2 本動物安全性試驗 本實驗制備的5種滅活疫苗3倍免疫劑量肌肉注射仔豬，連續(xù)觀察10 d并監(jiān)測體溫，結(jié)果顯示，注射局部均未見紅、腫、熱等反應(yīng)，免疫后前2 d出現(xiàn)體溫輕微升高，于免后第3天體溫恢復(fù)至正常，未見由疫苗引起的全身或局部不良反應(yīng)，仔豬發(fā)育良好，精神和食欲都正常。自主開發(fā)的4組佐劑制備的疫苗試驗結(jié)果與ISA206佐劑無安全性差異，表明新佐劑對仔豬安全性未產(chǎn)生影響。將每組中2頭豬監(jiān)測的體溫取平均值繪制曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 體溫監(jiān)測結(jié)果

2.3 效力試驗結(jié)果

2.3.1 中和抗體檢測結(jié)果 陰性對照組SVA中和抗體滴度為0，其他5種疫苗免疫仔豬，SVA抗體滴度呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，一免7 d開始全部產(chǎn)生中和抗體，一免21 d中和抗體均大于28，二免14 d中和抗體滴度大于211，四組JY佐劑均能達到ISA206佐劑的水平，且高于進口佐劑約1個滴度。其中，JY-1佐劑抗體產(chǎn)生最快且中和抗體滴度最高。5種疫苗免疫仔豬中和抗體檢測結(jié)果見圖3。

圖3 5 批疫苗本動物效力試驗抗體監(jiān)測結(jié)果

2.3.2 攻毒結(jié)果 5 組疫苗連同陰性對照于二免后14 d攻毒，陰性對照組5頭豬60%發(fā)病，對照組攻毒成立，免疫組各5頭豬，保護率達80%以上，各免疫組均達到SVA攻毒保護要求，其中，JY-1組、JY-3組、JY-4組保護率達到100%，保護率高于進口佐劑組(表3)。

表3 5組疫苗攻毒結(jié)果

架子豬SVA免后中和抗體及攻毒保護試驗結(jié)果表明，四組JY佐劑均能達到ISA206佐劑的水平，并能提升SVA滅活疫苗免疫效力及保護率。

3 討 論

SVA 在豬群中流行已有十余年，目前，仍無疫苗或特定的治療方法可用，豬場只能通過加強飼養(yǎng)管理和生物安全來防范，因此開發(fā)安全高效疫苗至關(guān)重要。

有學(xué)者[5]通過反向遺傳技術(shù)拯救了一株重組 SVA弱毒株，并在豬體內(nèi)評估了重組病毒的免疫原性及免疫保護性。中和抗體及攻毒試驗結(jié)果顯示，該重組病毒保留了較理想的免疫原性，說明該重組 SVA 是一株有效的活疫苗候選株。雖然活疫苗能夠誘導(dǎo)理想的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，但具有潛在的生物安全風(fēng)險，如毒力返強。而滅活苗不具有潛在的生物安全風(fēng)險，因此也是另一種理想的候選疫苗[6]。滅活疫苗對佐劑的要求已從疫苗的一種輔助性物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槟芴岣邉游餀C體對免疫原刺激的應(yīng)答能力，但沒有一種佐劑適用于所有抗原，每種佐劑都有其優(yōu)點和缺點[7]，所以從佐劑的原料合成、配伍、制備來選擇和應(yīng)用佐劑更能有針對性地開發(fā)需求性佐劑，提升疫苗免疫效力和保護率。

本研究按照獸用疫苗佐劑需求，優(yōu)化表面活性劑的合成工藝，制備水包油包水佐劑，在同等配苗條件下，與進口佐劑對比疫苗乳化后各項理化指標(biāo)、安全性及免疫效力、攻毒保護的情況。試驗結(jié)果表明：自制的JY佐劑理化性狀均符合SVA疫苗的要求；四組JY佐劑疫苗黏度均低于ISA206佐劑疫苗，降低了疫苗粘稠度，更易于注射，減少注射后應(yīng)激反應(yīng)程度，提高了疫苗的安全性；安全性檢驗及效力檢驗均符合且高于SVA疫苗要求，對小動物及本體動物均無任何免疫副反應(yīng)。

本研究根據(jù)SVA疫苗安全性及效力提升的需求，定制合成表面活性劑，通過控制表面活性劑反應(yīng)過程中的生成物，減少副產(chǎn)物的生成，降低了疫苗黏度及對機體的副作用。同時，自主合成佐劑根據(jù)抗原的情況調(diào)控佐劑原料配方或添加免疫增強劑，提升了疫苗免疫效力、免疫持續(xù)期及攻毒保護率。綜合以上試驗結(jié)果，表明JY-1、JY-2、JY-3、JY-4佐劑均可用于制備SVA滅活疫苗，對比而言，JY-1佐劑穩(wěn)定性更好及個體差異低，用其制備的疫苗免疫仔豬后產(chǎn)生的抗體最高，在豬群中可能會產(chǎn)生長期的抗體水平，起到較理想的保護作用。