嚴 鳳,吳劍平,王 博,張 婧,曹 瑩

(上海市動物疫病預防控制中心,上海 201103)

桿菌肽(bacitracin) 是由枯草桿菌和地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的一系列抗菌肽的混合物，是一種非核糖體肽,由氨基酸和特殊的或修飾過的氨基酸通過“硫模板多聚酶機制(thiotemplatemuhienzymemechanism)”的多功能酶復合系統(tǒng)合成的一類肽類次級代謝產(chǎn)物[1]。桿菌肽具有特殊的抑菌機制，會干擾細菌細胞壁的合成，同時在肽聚糖的合成中抑制磷脂受體的再生[2]，使得其具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性等特性。桿菌肽還是一個重要的飼料添加劑，5～100 mg/kg濃度可促進家禽和牲畜對食物的利用以增重，是目前國內(nèi)外廣泛用于飼料中的一種具有促生長作用的理想抗生素[3]，但隨著養(yǎng)殖業(yè)減抗，禁抗的全面推進，從2020年7月起，桿菌肽已經(jīng)禁止用于飼料添加劑。桿菌肽主要由12個氨基酸組成[4]至少有7種同系物，包括桿菌肽A、B(B1、B2、B3)、C(C1、C2、C3)、E、F等，其中桿菌肽A為主要活性組分[5-6]。桿菌肽A在堿性條件下可自發(fā)氧化，形成沒有抗菌活性的桿菌肽F組分[7]。《中國藥典》(2015版)[8]中桿菌肽含量的測定方法為微生物檢定法，藥典法測定的是桿菌肽中的總活性成分，未對各成分含量進行分別測定。由于桿菌肽組分多，對其分離具有較大的難度，國外藥典[9-11]多采用高效液相色譜分析桿菌肽的組分及有關(guān)物質(zhì)。由于是發(fā)酵產(chǎn)品，桿菌肽成分組成相似且非常復雜，其組分分析是質(zhì)量評價和質(zhì)量控制的核心內(nèi)容，而復雜的多組分體系使得分析方法的開發(fā)十分困難。超高效液相色譜-二極管陣列-串聯(lián)四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜，分離效率高，分辨率高，靈敏度高，可同時精確地采集母離子質(zhì)荷比和碎片離子質(zhì)量數(shù)，能夠顯著提高復雜體系中化學成分的快速分析鑒定能力。高分辨質(zhì)譜技術(shù)因其特有的優(yōu)勢在藥物分析研究中發(fā)揮日益重要的作用，在藥物質(zhì)量研究領(lǐng)域得到越來越多的應用[12-13]。本文建立超高效液相色譜-二極管陣列-串聯(lián)四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜分析桿菌肽中的組分，發(fā)揮高分辨質(zhì)譜的優(yōu)勢準確地測得桿菌肽各組分精確質(zhì)荷比，計算出各組分的元素組成，并能區(qū)分復雜背景中質(zhì)量數(shù)接近的雜質(zhì)及共流出組分，結(jié)合二極管陣列檢測器可以不經(jīng)復雜的分離和純化步驟即可獲得樣品的色譜和質(zhì)譜信息，是一種可以針對目標或非目標多組分藥物研究的有力工具，為其質(zhì)量控制和工藝優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 Dionex Ultimate 3000 diode array detector(DAD)-Q Exactive，Xcalibur 2.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Thermo Scientific 公司)，Mass Frontier軟件(美國Thermo Scientific 公司)

桿菌肽標準對照品，Dr.Ehrenstorfer Gmbh，批號：991436，含量81.9%；桿菌肽供試品，批號1-SAM-144-1。乙腈、甲酸(色譜純)，水為超純水(Milli-Q 儀制備)。

1.2 溶液配制 精密稱取桿菌肽標準對照品及供試品10 mg，分別于50 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。

1.3 方 法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18100 mm×2.1 mm，粒徑2.6 μm流動相: 0.1%甲酸溶液(A)-0.1%甲酸甲醇乙腈(75+25)溶液(B)；流速0.3 mL/min，采用梯度洗脫程序(表1)；柱溫30 ℃，進樣量10 μL；紫外吸收波長254 nm。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為HESI源，霧化氣40 arb；輔助氣10 arb；噴霧電壓3500V(+)/3000V(-)；離子傳輸毛細管溫度320 ℃；輔助氣溫度350 ℃；掃描模式：正離子模式Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS分辨率70000，dd-MS2分辨率17500，掃描范圍m/z150～1450。MS/MS 模式時，歸一化階梯碰撞能量：20%、40%和60%。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性結(jié)果

2.1.1 桿菌肽A 桿菌肽A分子式C66H103N17O16S，保留時間20.71 min。桿菌肽是一種多肽類抗生素，多肽類藥物在質(zhì)譜中會帶有多個電荷，桿菌肽A在質(zhì)譜中除了有[M+H]+1422.75622峰外，同時還有[M+2H]2+711.88175和[M+3H]3+474.92359的加和離子峰，而且[M+2H]2+[M+3H]3+在質(zhì)譜中的響應值均優(yōu)于[M+H]+，見圖1。桿菌肽A的主要碎片離子有110.07112、199.08996、227.08487、356.12747、869.46281、982.54688。

圖1 桿菌肽A質(zhì)譜圖(1)和紫外吸收光譜圖(2)

2.1.2 桿菌肽B 桿菌肽B分子式C65H101N17O16S比桿菌肽A少一個CH2，母離子精確質(zhì)量[M+H]+為1408.667。桿菌肽B有3個同分異構(gòu)體,分別為B1(保留時間12.47 min)、B2(保留時間14.29 min)和B3(保留時間19.44 min)。桿菌肽B在質(zhì)譜中 [M+2H]2+704.87392和[M+3H]3+470.25171的加和離子峰響應更強，見圖2。主要碎片離子有110.07112、199.08996、227.08487、356.12747、869.46821、852.43626。

圖2 桿菌肽B質(zhì)譜圖(1)和紫外吸收光譜圖(2)

2.1.3 桿菌肽C 桿菌肽C分子式C64H99N17O16S，比桿菌肽A少兩個CH2，母離子精確質(zhì)量[M+H]+為1394.72492、[M+2H]2+697.86610和[M+3H]3+465.57982，其中[M+3H]3+在質(zhì)譜中的響應最強，見圖3。桿菌肽C也存在C1、C2和C3三個同分異構(gòu)體，保留時間分別為6.91 min、10.11 min和11.68 min，見圖3。主要碎片離子有110.07112、199.08996、227.08487、356.12747、400.16155、838.42061。

圖3 桿菌肽C質(zhì)譜圖(1)和紫外吸收光譜圖(2)

2.1.4 桿菌肽E 桿菌肽E分子式C63H97N17O16S，比桿菌肽A少三個CH2，母離子精確質(zhì)量[M+H]+為1380.70927，[M+2H]2+690.85827和[M+3H]3+460.90794，其中[M+3H]3+在質(zhì)譜中的響應最強，由于含量較低，實際在樣品中主要是二價和三價質(zhì)譜峰，見圖4。主要碎片離子有199.08996、110.07112、227.08487。

圖4 桿菌肽E質(zhì)譜圖(1)和紫外吸收光譜圖(2)

2.1.5 桿菌肽F 桿菌肽F分子式C66H98 N16O17S，桿菌肽A在堿性條件下可發(fā)生降解，N-端噻唑結(jié)構(gòu)氧化成噻唑酮結(jié)構(gòu)，形成沒有抗菌活性，但是具有腎毒性的桿菌肽F[14]。桿菌肽F母離子精確質(zhì)量[M+H]+為1419.90893，[M+2H]2+710.35810和[M+3H]3+473.90783，其中[M+2H]2+在質(zhì)譜中的響應最強，見圖5。主要碎片離子有110.07112、214.05190、281.13183。

圖5 桿菌肽F質(zhì)譜圖(1)和紫外吸收光譜圖(2)

2.1.6 定性結(jié)果匯總 采用本方法共測到9個桿菌肽組分，其中含有多個同分異構(gòu)體，桿菌肽不同結(jié)構(gòu)間的差異主要是N-端噻唑結(jié)構(gòu)部分R位點的不同，以及X和Y位置上接的是L-異亮氨酸還是L-纈氨酸的差異[14]，結(jié)構(gòu)通式見圖6。各組分結(jié)構(gòu)組成不同在色譜保留行為上也有一定的差異，見圖7，同時結(jié)合高分辨質(zhì)譜測得不同的母離子精確質(zhì)量,可對各組分進行準確定性(表2)。

圖6 桿菌肽A結(jié)構(gòu)通式

圖7 桿菌肽各組分分子離子色譜峰(1)和紫外色譜峰(2)

2.2 定量結(jié)果 按照獸藥質(zhì)量標準匯編(2013年)[15]中桿菌肽預混劑的組分用液相色譜法測定規(guī)定桿菌肽A不小于35%，桿菌肽(A+B1+B2+B3)不小于70.0%，桿菌肽(C1+C2+C3)不大于20.0%，桿菌肽F不大于13%。本方法通過紫外串聯(lián)質(zhì)譜檢測器進行同時測定，通過紫外歸一化法計算各組分均符合獸藥質(zhì)量標準的相關(guān)規(guī)定。本方法以[M+3H]3+測定各組分分子離子的峰面積，嘗試采用各組分的分子離子峰面積與所有組分峰面積總和的占比進行質(zhì)譜歸一化計算，結(jié)果表明與紫外歸一化法測定結(jié)果較一致，測定結(jié)果見表3。

表3 桿菌肽各組分質(zhì)譜歸一化與紫外歸一化測定結(jié)果

3 討 論

3.1 流動相的選擇 本方法比較了50 mM乙酸銨溶液-乙腈、含0.1%甲酸的水溶液-含0.1%甲酸的乙腈溶液和含0.1%甲酸的水溶液-含0.1%甲酸的甲醇-乙腈(75∶25)溶液三種流動相體系，發(fā)現(xiàn)在含有甲酸的流動相條件下，桿菌肽及其相關(guān)物質(zhì)的分離度更好，桿菌肽B在乙腈-乙酸銨體系中分離率不高，見圖8，因此,方法最終選用含0.1%甲酸的水溶液-含0.1%甲酸的甲醇-乙腈(75∶25)溶液的流動相體系。

圖8 桿菌肽B在兩種相體系中的分離效果((1)：乙腈-乙酸銨流動相體系；(2)：乙腈-甲酸流動相體系；(3)：甲醇乙腈-甲酸流動相體系)

3.2 多價態(tài)的選擇 桿菌肽是一種多肽類抗生素，多肽類藥物在質(zhì)譜中會帶有多個電荷，多價態(tài)加和離子峰的存在是多肽類物質(zhì)在質(zhì)譜中呈現(xiàn)的一大特征。桿菌肽各組分在質(zhì)譜中除了有[M+H]+峰，同時還有[M+2H]2+和[M+3H]3+的加和離子峰，而且[M+H]+峰的質(zhì)譜響應往往是最低的。桿菌肽A、B、C、E組分在質(zhì)譜中以[M+3H]3+分子離子峰的響應最強，而桿菌肽F則以[M+2H]2+分子離子峰的響應最強。因為帶多個電荷，因此多價態(tài)加和離子峰的同位素峰也有一定的特征性。通常情況下，目標化合物在質(zhì)譜中帶1個電荷，[M+H]+就是質(zhì)量數(shù)/電荷數(shù)即m/z，桿菌肽會出現(xiàn)帶2個電荷數(shù)，因此會出現(xiàn)(m+2)/2即[M+2H]2+的質(zhì)荷比。同樣，帶3個電荷的質(zhì)荷比數(shù)[M+3H]3+就是(m+3)/3。同位素峰的質(zhì)荷比也是同樣的計算方法，因此,帶2個電荷的同位素峰之間的質(zhì)荷比相差約0.5 Da，帶3個電荷的同位素峰之間的質(zhì)荷比相差約0.33 Da。

3.3 桿菌肽B桿菌肽C的結(jié)構(gòu)驗證 桿菌肽組分B和C均存在同分異構(gòu)體，對于B1、B2、B3和C1、C2、C3的定位參考了張含智等[2]的報道，本方法結(jié)合碎片分析對各同分異構(gòu)體可進一步定性確證。桿菌肽的結(jié)構(gòu)通式見圖6，不同的桿菌肽組分在X及Y位點的氨基酸有所不同。經(jīng)質(zhì)譜碎裂在Y位點的氨基酸肽鍵斷裂產(chǎn)生氨基酸環(huán)的碎片，根據(jù)氨基酸環(huán)X位點的不同,氨基酸區(qū)分出含L-Ile的碎片869.46821和852.43626為B1、B3和C2，X位點上接L-Val的碎片855.44716和838.42061為C1、C2和B2。

桿菌肽結(jié)構(gòu)中從左至右第一、第二個氨基酸分別為L-Leu和L-Glu，這兩個氨基酸之間的肽鍵斷裂之后產(chǎn)生的碎片1111.58947和1097.57382，L-Glu與Y位點氨基酸之間的肽鍵斷裂進一步產(chǎn)生碎片982.54688和968.53123均是帶有Y位點的特征碎片，可用于區(qū)分B1和B2、B3。同理桿菌肽C在這兩個肽鍵處斷裂之后產(chǎn)生1097.57382、1083.55817和968.53123、954.51558的碎片，可以區(qū)分出C3和C1、C2。通過這些實際產(chǎn)生的特征碎片結(jié)合碎裂機理確證了B和C的同分異構(gòu)體。各同分異構(gòu)體的特征性碎片見表4，結(jié)構(gòu)式見圖9、圖10、圖11。

圖9 桿菌肽B1、B2、B3的特征碎片信息

圖10 桿菌肽C1、C2、C3的特征碎片信息

圖11 桿菌肽B、C碎片分子結(jié)構(gòu)式(K：869.46821；L：855.44716；M：982.54688；N：1111.58947；P1、P2：968.53123；Q1、Q2：1097.57382；G：954.51558；H：1083.55817)

表4 桿菌肽B和C的同分異構(gòu)體產(chǎn)生的特征性碎片

3.4 桿菌肽各組分在質(zhì)譜中的響應 本方法采用二極管陣列檢測器串聯(lián)質(zhì)譜檢測器的形式對桿菌肽各組分在質(zhì)譜中的響應與紫外響應作了對比，通過紫外歸一化計算和質(zhì)譜峰面積歸一化計算發(fā)現(xiàn)，兩種計算結(jié)果偏差在0.01%～3.53%之間，表明桿菌肽在二極管陣列檢測器中的響應與在質(zhì)譜檢測器中的響應成正比，且在質(zhì)譜中的檢測靈敏度更好，雜質(zhì)E和F在紫外中幾乎無響應，但在質(zhì)譜中的響應仍然明顯。《歐洲藥典》9.0版[9]、《英國藥典》2017 年版[10]及《美國藥典》40 版[11]中規(guī)定的主要成分為桿菌肽A，有效活性成分為桿菌肽A、B1、B2、B3，桿菌肽各組分在質(zhì)譜中響應強度與活性程度成正比。

本研究表明，同時串聯(lián)使用超高效液相色譜、二極管陣列檢測器與高分辨質(zhì)譜檢測器對復雜組分原料藥物分析具有十分重要的意義，可同時提供光譜與質(zhì)譜的定性定量數(shù)據(jù)，可在一定程度上減少傳統(tǒng)原料組分分析工作中所必須的分離純化工作，并能在已知化合物組分結(jié)構(gòu)的前提下完成對各組分的歸一化分析，而且從本研究結(jié)果看，質(zhì)譜與紫外所測定定量結(jié)果基本保持一致，驗證了該方法的合理性。

本方法建立了紫外串接四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜分析桿菌肽中的組分，檢測靈敏度高，特異性強，檢測到桿菌肽中包括主成分在內(nèi)的9個組分。根據(jù)母離子精確質(zhì)量和二級碎片推測可能的結(jié)構(gòu)，并能確定組分中的同分異構(gòu)體。利用超高效液相-二極管陣列-串聯(lián)四級桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測和鑒定多組分藥物的結(jié)構(gòu)將會有更廣泛的應用。