肖旭 李光才 國(guó)小青 況小軍

（貴州航天醫(yī)院麻醉科，遵義 563000）

中風(fēng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病最嚴(yán)重的原因之一，缺血性中風(fēng)占中風(fēng)的大多數(shù)，并伴隨高病死率、致殘率和復(fù)發(fā)率［1］?；謴?fù)腦血流量對(duì)于缺血性中風(fēng)后的恢復(fù)至關(guān)重要。然而恢復(fù)血流會(huì)導(dǎo)致一系列病理生理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而可能進(jìn)一步損傷大腦，這一過(guò)程稱為缺血再灌注損傷［2］。腦缺血再灌注損傷還與嚴(yán)重的殘疾相關(guān)，加重了個(gè)人、家庭和社會(huì)的醫(yī)療保健負(fù)擔(dān)［3］。迄今為止，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)理想的腦缺血再灌注損傷治療藥物。因此，尋找有效的腦缺血再灌注損傷的防治藥物是中風(fēng)研究的緊迫問(wèn)題。

相關(guān)研究表明，適宜的麻醉方式有助于降低患者氧化應(yīng)激程度，減少細(xì)胞因子水平變化，改善腦組織缺血的再灌注損傷，從而促進(jìn)患者恢復(fù)［4］。羅哌卡因（ropivacaine，ROP）是一種單一對(duì)映結(jié)構(gòu)體長(zhǎng)效酰胺類局麻藥，通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞鈉離子通道，阻斷神經(jīng)的興奮與傳導(dǎo)［5］。ROP毒性較低，具有較高的安全性。目前尚無(wú)關(guān)于ROP對(duì)腦缺血再灌注損傷具體作用機(jī)制的研究報(bào)道。本文旨在探究ROP對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷引起的免疫紊亂和組織氧化應(yīng)激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只雄性SD級(jí)大鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，8周齡，體質(zhì)量（185±10）g，許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030。自然光照，常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 試驗(yàn)藥物與主要試劑羅哌卡因（S68348）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，化學(xué)式：C17H26N2O，分子量：274.4，純度≥98%；蘇木素-伊紅染液（D006-1-1）、總超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（A001-3-2）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH）測(cè)定試劑盒（A005-1-2）、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（A003-1-2）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；IL-6 ELISA測(cè)試盒（JK-a-0023）、IL-10 ELISA試劑盒（JK-a-5026）購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司；Anti Arginase-1（ab60176）、iNOS（ab15323）、Caspase-3（ab13847）、cleaved Caspase-3（ab2302）、Bax（ab53154）、Bcl-2（ab196495）、c-Myc（ab39688）、β-actin（ab8227）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立及分組按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為5組：Control組、模型組（CI/R）、CI/R+ROP 0.5 mg/kg組、CI/R+ROP 1 mg/kg組 和CI/R+ROP 2 mg/kg組。CI/R+ROP 0.5 mg/kg組、CI/R+ROP 1 mg/kg組和CI/R+ROP 2 mg/kg組分別灌胃給予羅哌卡因0.5、1、2 mg/kg［6］，Control組和CI/R組灌胃給予等量生理鹽水，連續(xù)灌胃7 d，于第7天灌胃1 h后參照LONGA等［7］方法建立腦缺血再灌注大鼠模型：將所有大鼠用10%水合氯醛麻醉，仰臥固定至操作臺(tái)，大鼠頸部正中切口，分離左側(cè)股靜脈、左右兩側(cè)頸總動(dòng)脈、椎動(dòng)脈和右側(cè)頸外動(dòng)脈，除Control組外其余各組結(jié)扎并于頸總動(dòng)脈分叉處開(kāi)小口，將尼龍線沿頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈直至有輕微阻力為止，缺血2 h后縫合切口。

1.2.2 HE染色取各組大鼠腦組織，先用10%甲醛固定48 h，然后石蠟包埋制作切片，厚切片5 μm后，蘇木精、伊紅染色。在400倍顯微鏡下觀察腦組織損傷情況。

1.2.3 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)將各組大鼠于實(shí)驗(yàn)前1 d置于反應(yīng)箱中適應(yīng)3 min，實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠放在平臺(tái)上并接通銅柵電源，記錄各組大鼠3 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)（遭電擊次數(shù)）；第2天直接將大鼠置于接通銅柵電源的平臺(tái)上，記錄3 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)。

1.2.4 Y迷宮實(shí)驗(yàn)Y迷宮具有3個(gè)臂，分為起始臂、新異臂和其他臂，將新異臂用隔板擋住，大鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂中自由活動(dòng)10 min，訓(xùn)練結(jié)束后，大鼠被放回飼養(yǎng)籠。訓(xùn)練結(jié)束后4 h抽開(kāi)新異臂隔板，大鼠由起始臂放入，在3個(gè)臂中自由活動(dòng)5 min。錄像記錄5 min內(nèi)每只大鼠在各個(gè)臂停留的時(shí)間和穿梭次數(shù)。統(tǒng)計(jì)并分析大鼠新異臂進(jìn)入次數(shù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血清中巨噬細(xì)胞M1/M2極化取各組大鼠外周血0.5 ml于流式上樣管，按抗體說(shuō)明書(shū)和抗體組合方案，每管分別加5μl抗體，避光孵育20 min；400 g離心5 min，棄上清PBS清洗1次，54.8 g離心5 min，收集沉淀加500μl PBS重懸，300目篩過(guò)濾，30 min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，Cell Quest軟件進(jìn)行細(xì)胞分類分析。

1.2.6 ELISA在4℃下用50 mmol/L的碳酸鹽包被緩沖液溶解抗原，100 μl/孔添加至96孔酶標(biāo)板，將抗原包被過(guò)夜，棄去包被液，PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加150 μl 1%BSA封閉1 h，PBST洗滌3次，加入100μl不同倍比稀釋度的血清，并加入對(duì)照樣品，37℃孵育2 h，PBST洗滌5次，加入100 μl稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌5次后顯色劑顯色20 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.2.7 氧化應(yīng)激按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定總SOD含量，采用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定MDA、GSH含量。SOD在450 nm處測(cè)OD值，MDA在532 nm處測(cè)OD值，GSH在412 nm處測(cè)OD值。

1.2.8 Western blot將各組大鼠腦組織于冰上或4℃解凍，再加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量；提取等量的蛋白質(zhì)樣品（20 mg），100℃變性5 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1~2 h后加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日清洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發(fā)光液后，于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，并用Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。β-actin作為上樣量參照，至少重復(fù)3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)，組間差異采用單因素方差分析檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ROP改善腦缺血再灌注損傷大鼠病理?yè)p傷和學(xué)習(xí)能力HE染色檢測(cè)各組大鼠腦組織病理?yè)p傷結(jié)果如圖1A所示，Control組皮層神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)整，細(xì)胞核圓。CI/R組神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞變形、細(xì)胞質(zhì)體積小，細(xì)胞核深染，表現(xiàn)為明顯腦缺血再灌注病理?yè)p傷。CI/R+ROP 1、2 mg/kg組病理?yè)p傷程度較CI/R組明顯改善，神經(jīng)元排列較整齊，細(xì)胞核固縮深染。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠犯錯(cuò)次數(shù)結(jié)果如圖1B，與Control組相比，CI/R組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中犯錯(cuò)次數(shù)增加（P<0.05）。與CI/R組相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中犯錯(cuò)次數(shù)減少（P<0.05）；通過(guò)Y迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠新異臂進(jìn)入次數(shù)結(jié)果如圖1C，與Control組相比，CI/R組大鼠新異臂進(jìn)入次數(shù)減少（P<0.05）。與CI/R組相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg組大鼠新異臂進(jìn)入次數(shù)增加（P<0.05）。

圖1 ROP對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠病理?yè)p傷程度和學(xué)習(xí)能力的影響（×200）Fig.1 Effects of ROP on degree of pathological injury and learning ability of rats with cerebral ischemiareperfusion injury（×200）

2.2 ROP降低腦缺血再灌注損傷大鼠外周血中M1含量，升高M(jìn)2含量通過(guò)流式分選檢測(cè)各組大鼠外周 血 中 巨 噬細(xì)胞M1（F4/80+iNOS+）、M2（F4/80+Arg-1+）含量結(jié)果如圖2所示，與Control組相比，CI/R組M1含量升高，M2含量降低（P<0.05）。與CI/R組相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg組M1含量降低，M2含量升高（P<0.05）。

圖2 ROP對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠外周血中M1、M2含量的影響Fig.2 Effect of ROP on contents of M1 and M2 in peripheral blood of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

2.3 ROP降低腦缺血再灌注損傷大鼠IL-6含量，升高IL-10含量ELISA檢測(cè)各組大鼠IL-6、IL-10含量結(jié)果如圖3所示，與Control組相比，CI/R組IL-6含量升高，IL-10含量降低（P<0.05）。與CI/R組相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg組IL-6含量降低，IL-10含量升高（P<0.05）。

圖3 ROP對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠IL-6、IL-10含量的影響Fig.3 Effect of ROP on IL-6 and IL-10 levels in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

2.4 ROP上調(diào)腦缺血再灌注損傷大鼠Arg-1蛋白表達(dá)水平，下調(diào)iNOS蛋白表達(dá)水平Western blot檢測(cè)各組大鼠腦組織中Arg-1、iNOS蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖4所示，與Control組相比，CI/R組Arg-1蛋白水平降低，iNOS蛋白水平升高（P<0.05）。與CI/R組相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg組Arg-1蛋白水平升高，iNOS蛋白水平降低（P<0.05）。

圖4 ROP對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠Arg-1、iNOS蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effects of ROP on expression levels of Arg-1 and iNOS in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

2.5 ROP升高腦缺血再灌注損傷大鼠SOD、GSH含量，降低MDA含量試劑盒檢測(cè)各組大鼠SOD、GSH、MDA含量結(jié)果如圖5所示，與Control組相比，CI/R組SOD、GSH含量降低，MDA含量升高（P<0.05）。與CI/R組 相 比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg組SOD、GSH含量升高，MDA含量降低（P<0.05）。

圖5 ROP對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠SOD、GSH、MDA含量的影響Fig.5 Effects of ROP on SOD，GSH and MDA contents in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

2.6 ROP降低腦缺血再灌注損傷大鼠Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3，上調(diào)c-Myc蛋白表達(dá)水 平Western blot檢 測(cè) 各 組 大 鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-Myc蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖6所示，與Control組相比，CI/R組Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3升高，c-Myc蛋白水平降低（P<0.05）。與CI/R組 相 比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg組Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3降低，c-Myc蛋白水平升高（P<0.05）。

圖6 ROP對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-Myc蛋白表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of ROP on expression levels of Bax，Bcl-2，Caspase-3 and c-Myc in rats with cerebral ischemiareperfusion injury

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建腦缺血再灌注大鼠模型，觀察ROP對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)考察動(dòng)物的被動(dòng)記憶能力，Y迷宮實(shí)驗(yàn)則研究嚙齒類動(dòng)物的空間識(shí)別記憶能力，該迷宮利用嚙齒類動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境天然探究的自然習(xí)性，不需要?jiǎng)游飳W(xué)習(xí)任何規(guī)則趨利避害，能有效反映動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的識(shí)別記憶能力［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，CI/R組大鼠對(duì)新環(huán)境的識(shí)別能力降低，且犯錯(cuò)次數(shù)增多，而ROP可增加大鼠對(duì)新環(huán)境的探索和記憶能力，并減少跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)犯錯(cuò)次數(shù)。說(shuō)明ROP可改善腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)是由小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞激活釋放細(xì)胞因子和趨化因子介導(dǎo)外周炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)形成的炎癥微環(huán)境［9］。小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可激活極化為M1、M2型小膠質(zhì)細(xì)胞［10］。調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞向M1型極化可加重腦損傷，向M2型極化可發(fā)揮腦保護(hù)作用［11］。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）是M1型標(biāo)志物，精氨酸酶1（Arg-1）是M2型標(biāo)志物。本文研究發(fā)現(xiàn)，ROP具有降低腦缺血再灌注損傷大鼠外周血中M1含量及iNOS蛋白水平，升高M(jìn)2含量及Arg-1蛋白表達(dá)水平的作用。提示ROP調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠具有保護(hù)作用。

炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮非常重要的作用，是造成腦組織再灌注損傷的主要因素，缺血腦組織中促炎細(xì)胞因子的大量表達(dá)促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)程，加重腦組織的缺血再灌注損傷［12］。IL-6是白細(xì)胞介素家族中多功能的細(xì)胞因子，可通過(guò)減少炎癥因子的分泌或加強(qiáng)抗炎分子的表達(dá)，在腦缺血后，IL-6的表達(dá)活性增加，在腦缺血再灌注進(jìn)展過(guò)程中起促進(jìn)作用［13］。IL-10可上調(diào)炎癥因子拮抗劑的表達(dá)、抑制NF-κB活性，通過(guò)不同途徑抑制TNF-α和IL-1β活性，減少NO的合成和分泌，發(fā)揮抗炎效應(yīng)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，ROP具有降低腦缺血再灌注損傷大鼠IL-6含量，升高IL-10含量的作用。提示ROP抑制炎癥因子的釋放改善腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷。

由于腦組織中含有大量的不飽和脂肪酸和高濃度的脂質(zhì)，抗氧化能力較弱，致使大腦容易受到氧自由基的損傷。機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的穩(wěn)態(tài)被破壞而形成的氧化應(yīng)激狀態(tài)是腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵機(jī)制［15］。SOD、GSH屬于內(nèi)源性抗氧化酶，通過(guò)維持組織低濃度氧化劑和氧化還原平衡狀態(tài)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，MDA可反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度與細(xì)胞損傷程度。陳人豪等［16］研究發(fā)現(xiàn)刺五加提取物通過(guò)升高SOD、GSH活性，降低MDA含量提高腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的抗氧化能力。本文研究發(fā)現(xiàn)，ROP具有升高腦缺血再灌注損傷大鼠SOD、GSH含量，降低MDA含量的作用。提示ROP通過(guò)抗氧化應(yīng)激對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠具有保護(hù)作用。

凋亡是腦缺血再灌注損傷過(guò)程中的重要機(jī)制，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡可減輕腦缺血再灌注損傷［17］。促凋亡蛋白Bax為小分子細(xì)胞色素C提供通道，由線粒體進(jìn)入胞質(zhì)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2蛋白能與Bax蛋白形成同源二聚體抑制Bax活性，關(guān)閉Bax通道而阻止小分子通過(guò)拮抗Bax促凋亡作用。Bcl-2/Bax可反映細(xì)胞凋亡情況［18］。Caspase家族是細(xì)胞凋亡的介導(dǎo)者及執(zhí)行者，Caspase-3處于凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是家族中的最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是多種凋亡刺激信號(hào)傳遞的匯聚點(diǎn)［19］。c-Myc是一種細(xì)胞原癌基因，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期可誘導(dǎo)細(xì)胞增生，也可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［20］。高亮等［21］研究發(fā)現(xiàn)，c-Myc在局灶性腦缺血再灌注大鼠模型中表達(dá)增加，參與腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制，引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，ROP具有降低腦缺血再灌注損傷大鼠Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3，上調(diào)c-Myc蛋白表達(dá)水平的作用。提示ROP可抑制腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

綜上所述，ROP改善腦缺血再灌注大鼠病理?yè)p傷程度和學(xué)習(xí)記憶功能，其可能是通過(guò)抑制M1細(xì)胞極化改善免疫紊亂、抑制炎癥因子釋放抗氧化應(yīng)激和下調(diào)凋亡蛋白表達(dá)等實(shí)現(xiàn)的，且具有劑量依賴性。