郭鑫，包東瑞，趙佳樂，何旭，陳美華，夏廣清,3*，臧皓*

(1.通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，通化134002；2.通化師范學(xué)院長白山生物種質(zhì)資源研究院，通化134002；3.長白山生物種質(zhì)資源評價(jià)及應(yīng)用研究院，通化134002；4.通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，通化134002)

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)為銹革孔菌目、銹革孔菌科真菌類[1]，一般生長在樹皮下面，干燥后質(zhì)地堅(jiān)硬，無臭無味，俗稱為樺樹茸，是十分重要的一類藥用真菌[2]。天然的樺褐孔菌主要分布于俄羅斯、芬蘭、波蘭、日本北海道等北半球北緯40°～50°的地區(qū)和我國的黑龍江省與吉林省一帶[3]。樺褐孔菌中具有多種生物活性成分[4]，主要包括多糖類、三萜類、黃酮類、多酚類、黑色素和木質(zhì)素類等。其中樺褐孔菌中多糖類物質(zhì)具有一定的抗腫瘤、抗氧化、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等生物活性而受到廣泛關(guān)注[5-9]。

本實(shí)驗(yàn)采用酶法對樺褐孔菌多糖進(jìn)行提取，以香菇柄多糖的提取方法為參照[10]，優(yōu)化酶法提取樺褐孔菌多糖工藝，并對所得多糖進(jìn)行了相關(guān)抗氧化和降糖活性評價(jià)，旨在為樺褐孔菌的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌，吉林弘毅特產(chǎn)有限公司；果膠酶（30000U/mg）、纖維素酶（10000U/mg）、木瓜蛋白酶（＞200U/mg），麥克林；磺胺（99%）、奈乙二胺二鹽酸鹽、無水磷酸二氫鉀（99.5%）、無水磷酸氫二鉀（99%）、無水磷酸氫二鈉（99%）、無水磷酸二氫鈉（99%），薩恩化學(xué)；苯酚（99%）、Trolox、3，5-二羥基苯甲酸、可溶性淀粉，西亞化學(xué)；酒石酸鉀鈉、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、硝普鈉、阿卡波糖，美國sigma公司；NaOH、HCl、乙醇等常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

VDHG-9245A型恒溫箱，上海一恒科技有限公司；TDL-5-A型號低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器；高速中藥粉碎機(jī)，浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司；磁力攪拌器，北京欣維爾玻璃儀器有限公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋，上海-恒科技有限公司；ZNCL-G190×90磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海-恒科學(xué)儀器有限公司；HY-2旋渦混勻儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ReadMax1900Plus型光吸收酶標(biāo)儀，上海閃普生物科技公司；BSA224S-CW型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水提法

樺褐孔菌以料液比1∶40加入蒸餾水溶液，置于95℃磁力攪拌水浴鍋內(nèi)進(jìn)行提取2h后，離心沉淀，取上清液，水浴蒸發(fā)濃縮至10mL，加入4倍體積95 %乙醇，4℃靜置過夜，4000r/min離心20min，收集沉淀，60℃真空干燥至恒重，即得粗多糖。

1.2.2 堿提法

樺褐孔菌以料液比1∶40加入5% NaOH溶液，放置于95℃磁力攪拌水浴鍋內(nèi)2h，進(jìn)行提取后，離心沉淀，取上清液，水浴蒸發(fā)濃縮至10mL，加入4倍體積95 %乙醇，邊加邊攪拌，4℃靜置過夜，4000r/min離心20min，收集沉淀，60℃真空干燥至恒重，即得粗多糖。

1.2.3 酶解法制備樺褐孔菌多糖工藝

樺褐孔菌以料液比1∶40加入pH為5.0的鹽酸溶液，在50℃下酶解2h，離心沉淀，取上清液，水浴蒸發(fā)濃縮至10mL，加入4倍體積95 %乙醇，4℃靜置過夜，4000r/min離心20min，收集沉淀，60℃真空干燥至恒重，即得粗多糖。詳見表1。

表1 不同酶最適水解參數(shù)Tab.1 Optimal hydrolysis parameters of different proteases

1.2.4 多糖含量的測定

1.2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

采用苯酚硫酸法[11]進(jìn)行多糖含量測定。稱取葡萄糖10mg，配制成1.0mg/mL的葡萄糖溶液，取不同體積的該溶液，用蒸餾水水配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16、0.20mg/mL的葡萄糖溶液，向EP管中依次加入葡萄糖各濃度樣品溶液250μL、苯酚溶液125μL、硫酸625μL，混合靜置30min后取出200μL加入到96孔板中，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，于490nm測定吸光度值。

1.2.4.2 樣品的多糖含量測定

向EP管中依次加入樣品溶液250μL、苯酚溶液125μL、硫酸625μL，混合靜置30min后取出200μL加入到96孔板中，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，于490nm測定吸光度值。

1.2.5 果膠酶酶解樺褐孔菌多糖的工藝優(yōu)化

1.2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)

考查pH、添加酶的量、酶解時(shí)間以及酶解溫度對多糖含量的影響。固定反應(yīng)條件添加酶的量9500U/g，酶解時(shí)間3h，酶解溫度55℃，考察不同溶液pH（2、3、4、5、6）對多糖含量的影響；固定反應(yīng)條件酶解溶液的pH 4，酶解時(shí)間3h，提取溫度55℃，考察酶添加量（5500、6500、7500、8500、9500U/g）對多糖含量的影響；固定反應(yīng)條件溶液的pH4，添加酶的量9500U/g，酶解溫度55℃，考察不同酶解時(shí)間（1.5、2、2.5、3、3.5h）對多糖含量的影響；固定反應(yīng)條件溶液的pH4，添加酶的量9500U/g，酶解時(shí)間3h，考察不同酶解溫度（40、45、50、55、60℃）對多糖含量的影響。

1.2.5.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)優(yōu)化果膠酶酶解樺褐孔菌多糖工藝參數(shù)，根據(jù)果膠酶最優(yōu)提取條件及單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討pH（A）、酶添加量（B）、酶解時(shí)間（C）及酶解溫度（D）對多糖含量的影響，得到果膠酶酶解樺褐孔菌多糖的最佳條件。詳見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平Tab.2 Factors and levels in orthogonal experiments

1.2.6 分析測定方法

1.2.6.1 抗氧化活性研究

1.2.6.1.1 NO清除實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[12]的方法，略有改動。取1mg/mL的樺褐孔菌多糖溶液3mL，同時(shí)另取與樺褐孔菌多糖相同濃度的陽性對照姜黃素溶液3mL分別與3mL硝普鈉（5mmol/L）充分混勻，25℃下反應(yīng)300min，在0、25、50、75、100、150、200、250、300min各取100μL，分別加100μL Greiss試劑后混合，于546nm波長下測定樺褐孔菌多糖對NO清除能力；甲醇溶液3mL與3mL硝普鈉（5mmol/L）充分混勻，25℃下反應(yīng)300min，在0、25、50、75、100、150、200、250、300min各取100 μL，分別加100 μL Greiss試劑后混合，作為空白組。于546nm波長下檢測樣本組、陽性組和空白組的吸光度值。

1.2.6.1.2 清除·OH自由基的能力

參照[13]的方法，略有改動。樺褐孔菌多糖樣品及陽性參比溶液配制同1.2.6.1.1。配制3mM/L的FeSO4水溶液、3mM/L的過氧化氫溶液、6mM/L的水楊酸溶液備用。在50μL 3mM的FeSO4加入50μL樣品溶液以及50μL 3mM的過氧化氫溶液后混勻，靜置反應(yīng)10min，再加50μL 6mM的水楊酸溶液，混勻，靜置反應(yīng)30min。測定其在492nm處的吸光度值記為As，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)；在50μL 3mM的FeSO4加入50μL樣品溶液以及50μL 3mM的過氧化氫溶液后混勻，靜置反應(yīng)10min，再加50μL的蒸餾水，混勻，靜置反應(yīng)30min。測定其在492nm處的吸光度值記為Ac；在50μL 3mM的FeSO4加入50μL蒸餾水以及50μL 3mM的過氧化氫溶液后混勻，靜置反應(yīng)10min，再加50μL 6mM的水楊酸溶液，混勻，靜置反應(yīng)30min。測定其在492nm處的吸光度值記為Ab；以Trolox作為陽性對照。按下列公式計(jì)算清除率。

清除率(%)=[1-(As-Ac)/Ab]×100

1.2.6.2 降糖活性研究

1.2.6.2.1 α-葡萄糖苷酶的抑制

參照[14]的方法，略有改動。樺褐孔菌多糖樣品及阿卡波糖陽性參比溶液配制均采用DMSO。配制0.1mM的PBS、5mM PNPG溶液和0.1U/mL α-葡萄糖苷酶。在96孔板中加入20μL樣品、80μL 0.1M PBS和100 μL 0.1U/mL α-葡萄糖苷酶于25℃孵化10 min后，加入50 μL l 5 mM PNPG于25℃孵化5 min。分別在0 min、5 min時(shí)在405 nm波長下測定吸光值記為As，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)；在96孔板中加入20 μL DMSO、80 μL 0.1M PBS和100 μL 0.1U/mL α-葡萄糖苷酶于25℃孵化10 min后，加入50 μL l5 mM PNPG于25℃孵化5 min。分別在0 min、5 min時(shí)在405 nm波長下測定吸光值記為Ab；以阿卡波糖作為陽性對照。按下列公式計(jì)算抑制率。

抑制率(%)=[(A5min-A0min)b-(A5min-A0min)s]/(A5min-A0min)b×100

1.2.6.2.2 α-淀粉酶的抑制

參照[15]的方法，略有改動。樺褐孔菌多糖樣品及阿卡波糖陽性參比溶液配制均采用DMSO。配制20 mM的PBS、DNS溶液、4 U/mL α-淀粉酶和0.5%（w/v）淀粉。在EP管中加入20 μL樣品、80 μL蒸餾水和100 μL 4U/mL α-淀粉酶25℃孵化5 min，加入200 μL 0.5%淀粉于25℃孵化3 min后，取200 μL上述混合液和100 μL DNS溶液加入新的EP管85℃水浴反應(yīng)15 min，待冷卻至室溫后加入900 μL蒸餾水稀釋，在540 nm波長下測定吸光值記為As，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)；在EP管中加入20 μL樣品、80 μL蒸餾水和100 μL PBS 25℃孵化5 min，加入200 μL 0.5%淀粉于25℃孵化3 min后，取200 μL上述混合液和100 μL DNS溶液加入新的EP管85℃水浴反應(yīng)15min，待冷卻至室溫后加入900 μL蒸餾水稀釋，在540 nm波長下測定吸光值記為Ac；在EP管中加入20 μL DMSO、80 μL蒸餾水和100 μL 4U/mL α-淀粉酶25℃孵化5 min，加入200 μL 0.5%淀粉于25℃孵化3 min后，取200 μL上述混合液和100 μLDNS溶液加入新的EP管85℃水浴反應(yīng)15 min，待冷卻至室溫后加入900 μL蒸餾水稀釋，在540 nm波長下測定吸光值記為Ab；以阿卡波糖作為陽性對照。按下列公式計(jì)算抑制率。

抑制率(%)=[1-(As-Ac)/Ab]×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)來進(jìn)行差異性顯著分析，其中P<0.05差異顯著；Office excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖，每次試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量測定

2.1.1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見圖1。

以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值（A）為縱坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0079x-0.0588 R2=0.9991。將待測的樣品的吸光度值帶入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算提取物中的多糖含量。

2.1.2 各方法下的提取物多糖含量

如表3所示，不同方法所得的提取物多糖含量存在一定的差異。酶法提取物所得多糖含量均顯著高于水提法和堿提法，以果膠酶最優(yōu)，其次為木瓜蛋白酶和纖維素酶；與酶法提取相比，堿提法次之，水提法所得提取物多糖含量最少。故選擇酶法提取中的果膠酶酶解提取法進(jìn)行后續(xù)的工藝優(yōu)化。

表3 提取物多糖含量Tab.3 Extract polysaccharide content

2.2 果膠酶酶解樺褐孔菌多糖單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 pH對果膠酶酶解樺褐孔菌多糖含量的影響

由圖2可以看出，樺褐孔菌多糖的含量隨著pH的增加逐漸增大，當(dāng)pH 5時(shí)，達(dá)到最大值。但在此之后隨著pH值的進(jìn)一步增大，反而是抑制了果膠酶酶解的效率，降低了樺褐孔菌多糖的得率。因此，在本試驗(yàn)條件下，適宜的pH值為5。

2.2.2 酶添加量對果膠酶酶解樺褐孔菌多糖含量的影響

由圖3可以看出，隨著酶添加量的不斷增加，樺褐孔菌多糖的含量呈現(xiàn)顯著的升高趨勢（P<0.05）。在酶添加量達(dá)到9500 U/g時(shí)，樺褐孔菌多糖含量達(dá)到最大值。因此，選擇酶添加量9500 U/g時(shí)為最佳酶添加量。

2.2.3 酶解時(shí)間對果膠酶酶解樺褐孔菌多糖含量的影響

由圖4可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長，樺褐孔菌多糖含量在1.5～2.5 h之間呈現(xiàn)下降的趨勢；但此后隨著酶解時(shí)間的增加，增加酶解時(shí)間使得樺褐孔菌多糖提取量不斷增加，在3 h時(shí)達(dá)到最高，之后延長時(shí)間提取率的變化不顯著（P＞0.05）。所以，考慮到節(jié)約資源和成本選擇適宜酶解時(shí)間為3 h。

2.2.4 酶解溫度對果膠酶酶解樺褐孔菌多糖含量的影響

由圖5可以看出，在溫度40～50℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，樺褐孔菌多糖含量變化不顯著（P＞0.05）。當(dāng)溫度為50℃時(shí)，樺褐孔菌多糖含量達(dá)到最大值，超過50℃后，樺褐孔菌多糖含量顯著下降（P<0.05），所以選擇適宜酶解溫度為50℃。

2.3 果膠酶酶解樺褐孔菌正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以多糖含量為評價(jià)指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)篩選出果膠酶提取樺褐孔菌多糖的最佳工藝參數(shù)，結(jié)果見表4。

表4 酶解樺褐孔菌正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table.4 Orthogonal test design and results of enzymatic hydrolysis of Inonotus obliquus

由極差分析可得出影響果膠酶酶解樺褐孔菌工藝的主次因素為pH＞提取溫度＞酶解時(shí)間＞加酶量，最佳提取條件是A1B3C2D3，即提取pH 4、加酶量9500 U/mg、酶解時(shí)間3 h、提取溫度55℃。按最佳理論條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測得多糖含量（0.1598±0.013）mg Glu/g提取物。

2.4 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 樺褐孔菌多糖清除NO的能力

樺褐孔菌多糖可有效的清除試驗(yàn)體系中的NO，姜黃素溶液對NO的清除效果非常顯著，如圖6所示，與姜黃素相比，1 mg/mL的樺褐孔菌多糖在0～300 min內(nèi)清除率與樺褐孔菌多糖濃度呈劑量依賴關(guān)系，隨樺褐孔菌多糖濃度增加，清除率也逐漸升高，150～250 min時(shí)，清除率明顯增加，樺褐孔菌多糖在250 min時(shí)，清除率最高。

2.4.2 清除羥基自由基的能力

樺褐孔菌多糖對試驗(yàn)體系中的羥自由基有顯著的清除作用（P<0.05），如圖7所示，Trolox溶液對羥基的清除效果非常顯著，與Trolox相比，當(dāng)樺褐孔菌多糖質(zhì)量濃度小于4 mg/mL時(shí)，清除率顯著升高；當(dāng)濃度大于4 mg/mL時(shí)，隨著樺褐孔菌多糖濃度增加，羥自由基的清除率變化不顯著；在5 mg/mL時(shí)達(dá)最大清除率83.44%。

2.5 降糖活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性

樺褐孔菌多糖對試驗(yàn)體系中的α-葡萄糖苷酶有顯著的抑制作用（P<0.05），如圖8所示，阿卡波糖溶液對α-葡萄糖苷酶的抑制效果非常顯著，與阿卡波糖相比，當(dāng)樺褐孔菌多糖質(zhì)量濃度小于0.25 mg/mL時(shí)，清除率顯著升高；當(dāng)濃度大于0.25 mg/mL時(shí)，隨著樺褐孔菌多糖濃度增加，α-葡萄糖苷酶的抑制率緩慢升高，差異不顯著；在1 mg/mL時(shí)達(dá)最大抑制率92.15%。

2.5.2 α-淀粉酶抑制活性

樺褐孔菌多糖對試驗(yàn)體系中的α-淀粉酶有顯著的抑制作用（P<0.05），如圖9所示，阿卡波糖溶液對α-淀粉酶的抑制效果非常顯著，與阿卡波糖相比，當(dāng)樺褐孔菌多糖質(zhì)量濃度小于5 mg/mL時(shí)，清除率顯著升高（P<0.05）；在樺褐孔菌多糖濃度為5 mg/mL時(shí)達(dá)最大抑制率39.78%。

3 結(jié)論

果膠酶酶解最佳工藝為：提取pH 4、加酶量9500 U/g、酶解時(shí)間3 h、提取溫度55℃。經(jīng)過驗(yàn)證，在此條件下的樺褐孔菌多糖含量為（0.1598±0.013）mg Glu/g提取物。多糖對NO、羥基自由基有較好的清除能力，以及對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有較好的抑制作用，顯示出了較好的抗氧化活性及降糖活性。因此，實(shí)驗(yàn)所得的果膠酶的酶解條件對樺褐孔菌食品藥品的相關(guān)方向研究具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)中僅以樺褐孔菌多糖產(chǎn)物作為研究對象，進(jìn)行了體外抗氧化以及降糖活性研究，并未研究其內(nèi)在的藥理功效，可進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)物質(zhì)的提取純化以及深入的藥理學(xué)試驗(yàn)研究，進(jìn)一步探索樺褐孔菌的藥理活性及保健功效，為今后樺褐孔菌的開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。