李旭辰,高穎,柳成林,韓文靜,于秀華*,黃曉巍*

（1.長春中醫(yī)藥大學藥學院，長春130117；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第964醫(yī)院南湖院區(qū)，長春130021）

補腎寧心顆粒是我院經(jīng)驗方，由丹參、當歸、赤芍、益母草、牛膝、蒼術(shù)、茯苓、續(xù)斷、熟地黃、柏子仁、香附、石菖蒲、澤蘭、焦山楂14味中藥材組成的復(fù)方制劑，具有補腎活血，祛瘀通絡(luò)功效。可以降低中樞神經(jīng)中的NE、DA的含量，使中樞神經(jīng)由興奮轉(zhuǎn)向抑制[1]。達到了使心血管系統(tǒng)受其影響的可能性降低的作用，因此推測該藥可以抑制中樞神經(jīng)產(chǎn)生興奮，并且可以有效控制或抑制NE和DA的合成和釋放。該顆粒中赤芍的主要成分為芍藥苷、蒼術(shù)主要成分蒼術(shù)素、丹參主要成分丹酚酸B等，能夠作為本品的有效指標成分。經(jīng)研究芍藥苷抗抑郁、調(diào)節(jié)免疫、保肝、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保護神經(jīng)、抗糖尿病并發(fā)癥等藥理作用的研究較為深入[2]。蒼術(shù)素抗炎作用主要表現(xiàn)為抑制炎性細胞因子，促進胃排空作用主要表現(xiàn)為激活GHSR，抗腫瘤作用則表現(xiàn)為抑制癌細胞增值[3]。丹酚酸B具有治療效果對于心肌梗死、動脈粥樣硬化及心肌缺血等心血管疾病[4]。筆者主要對補腎寧心顆粒進行了定量研究，采用對指標性成分蒼術(shù)素、芍藥苷和丹酚酸B運用高效液相色譜(HPLC)法進行測量分析來測其含量，達到質(zhì)量控制的目的，同時對該藥的安全性提供保障，為臨床的質(zhì)量控制和使用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

TP-300超聲波清洗器（天鵬電子新技術(shù)（北京）有限公司）；BSA224S電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津，SPD檢測器）；純水（長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗中心）；AMW220D型電子分析天平（日本島津）；XS-225A電子天平（OHAHS公司）；所用試劑均為分析純。

1.2 試藥

補腎寧心顆粒（批號：20190301，來源：長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑中心）；對照品：蒼術(shù)素（111924-201605）、丹酚酸B對照品（120976-200503）芍藥苷（110736-201741）均購于中國藥品生物檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品混合溶液的制備

首先，分別稱取芍藥苷10.0mg、蒼術(shù)素6mg和丹酚酸B 17mg三種對照品小心轉(zhuǎn)移分別各自放入25ml、100ml、100ml的棕色容量瓶之中，然后在其中用移液槍少量多次加入有機溶劑甲醇定容，制成了每5ml含芍藥苷、蒼術(shù)素和丹酚酸B分別為2.0mg、0.3mg 0.85mg的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取本品(補腎寧心顆粒)，研成極細的粉末，使用分析天平稱量研磨好的5g該粉末，后將其加到錐形瓶中，再加入用移液管稱量的25ml的甲醇溶劑，后再次稱量并記錄此時錐形瓶和溶液的總質(zhì)量，超聲處理30min后，再進行稱定重量，滴加甲醇，使此時質(zhì)量與先前質(zhì)量記錄一致，然后進行搖勻，濾過，取續(xù)濾液。

2.3 色譜條件

為了達到、提高各成分之間的分離度、縮短分析時間、改善各成分峰的峰形的目的，選擇流動相0.2%H3PO4溶液（A）-乙睛（B），使用梯度洗脫的洗脫方式，即為：0-30min，22% B，78% A；30-65 min，65% B，35% A；65-70 min，22% B，78% A，流速為1.0ml/min，檢測波長為286nm、230nm、340nm，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑Apollo-C18色譜柱（250mm×4.6 mm）。

2.4 專屬性考察

分別精密吸取“2.1”項下制成含有芍藥苷、蒼術(shù)素和丹酚酸B三種對照品的溶液，分別取適當?shù)牧恐瞥桑⑷肷V儀當中，對其進行進樣檢測。同時進樣分析“2.2”項下的供試品溶液。結(jié)果顯示如圖1-6，說明陰性對其并沒有出現(xiàn)干擾，證明了此方法可行。

由上圖可知，各指標性的峰分離度良好，并未出現(xiàn)峰拖尾、分叉等不良峰型。且樣品的出峰時間與對照品的出峰時間能夠?qū)?yīng)上，能夠很好的符合規(guī)定。

2.5 線性關(guān)系考察

取“2.1”項下的混合對照品溶液依次為4.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0μl，使其稀釋成不同的濃度，進樣分析，采用“2.3”項下的方法測定，以峰面積積分值（Y）-對照品進樣量（X），采用線性回歸分析的方法，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察表

2.6 精密度檢驗

精密度檢驗即為不同儀器、不同時間、不同人員分別按上述的色譜條件進行測定，取“2.1”項下的混合對照品溶液10 μl，進樣檢測。結(jié)果芍藥苷、蒼術(shù)素和丹酚酸B的峰面積的RSD值0.07%、0.36%、0.25%。數(shù)據(jù)核算無誤，得到結(jié)果精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

使用上述建立的色譜條件進行測定，穩(wěn)定性試驗?zāi)康脑谟趯┰嚻返姆€(wěn)定性進行合理評價，在一定時間內(nèi)，于0、2、4、8、12、24h進樣10 μl。精密吸取“2.2”下供試品溶液，依法測定，芍藥苷、丹酚酸B、蒼術(shù)素峰面積的RSD值分別為0.39% 0.63%、1.07%。得到結(jié)果穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率試驗

取樣品，精密量取本品2.5g（芍藥苷含量為1.8603mg/g，丹酚酸B含量為0.72 mg/g，蒼術(shù)素含量為0.26 mg/g），加入甲醇和對照品適量，置25ml量瓶中。按上述所建立的液相色譜條件，計算回收率，進樣分析。為保證數(shù)值穩(wěn)定可靠，計算出了丹酚酸B RSD值1.50%、芍藥苷的RSD值為1.74%、蒼術(shù)素RSD值1.07%，均符合要求。平均加樣回收率結(jié)果分別為丹酚酸B 97.68%、芍藥苷97.45%、蒼術(shù)素96.88%。本實驗的結(jié)果證明了該高效液相測量方法的準確性較好。

2.9 重現(xiàn)性試驗

首先，取相同批次的顆粒，將其配制為“2.1”項下的供試品溶液，然后對其各自分離的測定。重現(xiàn)性實驗的目的提高測量數(shù)據(jù)的準確性，適量進樣，測量6次。丹酚酸B、芍藥苷、蒼術(shù)素RSD值為2.46%、1.85%、2.80%，符合規(guī)定要求，實驗成果證明該液相色譜的方法具備著優(yōu)良重復(fù)性。

2.10 耐用性考察

2.10.1 不同色譜柱

選用WondaSil NH18柱（4.6×250mm，5μm）和GRACE NH18柱（4.6×250mm，5μm），選取作為同一供試品溶液，以0.2%H3PO4溶液為流動相A，以為乙腈流動相B，選用不同廠家C18色譜柱，在“2.2”下的色譜條件下，檢測波長為230nm、286nm、340nm，柱溫30℃，選用梯度洗脫的洗脫方式，進行測定。

2.10.2 檢測波長

取同一供試品溶液，0.2% H3PO4溶液為流動相A，乙腈為流動相B。為了檢驗波長，其余均選用與前文一致的方法，按規(guī)定進行梯度洗脫，流速1.0ml/min，柱溫30℃，YWG-C18柱（4.6×250 mm，5μm）為達到實驗效果，選用與前文完全不同的波長進行測定，分別于228nm、288nm、338nm測定。

2.10.3 柱溫的影響

選用與前文相同的上述色譜柱，即C18色譜柱,選擇了不同的溫度作為不同柱溫。選用了柱溫分別為30℃和40℃，取同一供試品溶液，其余均與前文保持一致。在340 nm、286 nm、230 nm下進行檢測。

2.10.4 不同流速的影響

取同一供試品溶液，以0.2% H3PO4溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，為探究流速對試驗結(jié)果的影響，分別以流速0.8、1.0、1.2 ml/min的不同流速進行測定。用C18為填充劑，選用了YWG-C18柱（4.6×250mm，5μm），進行梯度洗脫，柱溫維持30℃；吸收波長為230nm、286nm、340nm。

得出以上的操作均不會影響含量測定的結(jié)果，當測試的條件發(fā)生了適度的變化時。

2.11 測定含量

精密吸取10μl對照品混合溶液、供試品溶液進樣檢測，得到的實驗結(jié)果即為，補腎寧心顆粒中每袋顆粒中，補腎寧心顆粒中以芍藥苷(C23H28O11)、丹酚酸B(C36H30O16)和蒼術(shù)素(C13H10O)含有的赤芍、丹參和蒼術(shù)的生藥量，分別不得少于15.0mg、5.0 mg和1.8 mg。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇

主要參考了中國藥典一部對于各藥材進行含量測定項下的制備方法的部分，以及查閱了有關(guān)文獻，研究芍藥苷、蒼術(shù)素、丹酚酸B在不同制備方法下所得的含量?？紤]到由于該藥品的有效成分具有極性，且更成分之間極性也各不相同，所以分別加入甲醇、75%甲醇、乙醇等不同的有機溶劑來對其進行溶解，能夠達到其分離溶解的目的，并以超聲、加熱回流等提取的手段，從而得出的實驗結(jié)論：一是關(guān)于提取方法對含量的影響，沒有顯著性差異的兩種提取方法，即回流提取方法和超聲提取方法，這兩種均為中藥提取方法中較為常見的兩種提取方法，由這兩種方法所得到的含量十分接近，并不存在顯著差異，然而為了減少實驗成本和花費的時間，超聲提取的操作容易方便，更加大大的減少了提取的時間，并且實驗成本相對較低，因此為本次實驗選擇的樣品提取方法為超聲提取30min；二是不同有機溶劑所產(chǎn)生的提取效果對各含量的影響，使用甲醇做為溶劑，測得的有效成分含量較高，對含量的影響較大，因此采用甲醇作為溶劑。綜上所述，選擇了操作更為簡單方便的超聲提取30min的方法，并選擇了甲醇作為有機溶劑，使得到的指標性成分含量跟高的方法。確定采用“2.1”“2.2”項下的方法作為制劑中含量提取的方法。即為上文中選擇的方法。

3.2 檢測波長的確定

根據(jù)對照品芍藥苷、丹酚酸B、蒼術(shù)素的紫外吸收圖，最大吸收峰為232nm、287 nm、336 nm，結(jié)合藥典確定最大吸收為230 nm、286 nm、340 nm。

3.3 選擇芍藥苷、丹酚酸B、蒼術(shù)素作為指標性成分的依據(jù)

芍藥苷作為赤芍的主要有效成分，它與赤芍的多種藥用治療作用皆有關(guān)聯(lián)[5]。研究表明，具有抗血栓、淤血，同時還擁有清熱、抗炎，以及抗毒素的作用[6-8]，符合赤芍的中藥主治，同時也是中藥赤芍發(fā)揮作用的主要所在。選用芍藥苷作為對顆粒質(zhì)量的控制，研發(fā)、合理利用。丹酚酸B為水溶性活性成分，是丹參中的指標性成分。其能夠良好的溶于制劑當中，具有防止心血管疾病的重要作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)[9-11]，此成分對于治療缺血性心臟病具有良好的理論根據(jù)，并發(fā)現(xiàn)了它的作用機制。丹酚酸B可以作為項指標性成分衡量此顆粒標準，綜合上述。蒼術(shù)具有止痛燥濕的功效[12,13]，對于消化系統(tǒng)具有良好的治療作用，對于修復(fù)胃黏膜，治療胃潰瘍具有極好的功效，蒼術(shù)素作為蒼術(shù)的特征性成分，能夠很好的反應(yīng)出本顆粒中蒼術(shù)所發(fā)揮的藥用價值。