曲笑鋒，石菊，李鐵錫，于艷輝，劉松枝，唐曉桐，徐建，鄢必新*

(1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，長春130103；2.吉林天力泰藥業(yè)有限公司，長白朝鮮族自治縣134400)

復(fù)方萬年青膠囊處方包含虎眼萬年青、半枝蓮、虎杖、郁金、白花蛇舌草、人參、丹參、黃芪、全蝎、蜈蚣。功能主治為解毒化瘀，扶正固本。用于肺癌、肝癌、胃癌化療合并用藥，且具有減毒增效的作用。本研究基于胃癌荷瘤小鼠模型，通過體外檢測免疫調(diào)節(jié)相關(guān)指標及NF-kb p65/p38水平，探究其作用機制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

BALB/c小鼠，雌雄各半，18～22g，購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，合格證號：SCXK（吉）2020-0002。

1.2 藥物

復(fù)方萬年青膠囊：由吉林天力泰藥業(yè)有限公司提供，批號：20190701；氟尿嘧啶注射液（5-FU）：江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司，批號：190604；10×電轉(zhuǎn)液：Solarbio，批號：D1060-500；5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，Solarbio，批號：T1070-500；5×loading buffer：Biosharp，批號：660272；1×PBST緩沖液：Solarbio，批號：T1070-500，P1031-500；高靈敏度ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20191121；Page Ruler Prest：thermofisher，批號：00318120；βactin：BOSTER，批號：BA2305；P38 MAPK：CST，批號：8690；NF-kb/p65，CST，批號：8242；山羊抗兔二抗：BOSTER，批號：BA1054；山羊抗鼠二抗：BOSTER，批號：BA1050；PBS：HyClone，批號：AE29449011；RPMI1640培養(yǎng)基：HyClone，批號：AE29163435；Gey′s紅細胞裂解液：源葉生物，批號：L14M11G113128；LDH試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20201228；IgG試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20201228；IgM試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20201228；TNF-α試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20201229。

1.3 儀器

SMP500-18272-LSIO酶標儀；JA1103N型電子天平；HHS水浴鍋；低溫高速離心機；Trans-blot SD cell半干轉(zhuǎn)膜儀；Gel imaging system；MCO-18AIC二氧化碳培養(yǎng)箱。

2 方法

2.1 分組

BALB/c小鼠84只，隨機分為7組，每組12只，雌雄各半，分別為空白對照組、模型對照組、5-FU對照組、復(fù)方萬年青膠囊1倍臨床劑量對照組、復(fù)方萬年青膠囊3倍臨床劑量對照組、復(fù)方萬年青膠囊1倍臨床劑量+5-FU聯(lián)合組（0.5g·kg-1+70mg·kg-1）、復(fù)方萬年青膠囊3倍臨床劑量+5-FU聯(lián)合組（1.5g·kg-1+70mg·kg-1），連續(xù)給藥14d。

2.2 制備胃癌細胞懸液

小鼠腹腔接種胃癌瘤液后，待腹部出現(xiàn)明顯的腹水處死，仰臥固定，消毒皮膚，用眼科剪小心剝離表皮，露出外膜，抽取腹腔腫瘤積液，以0.9%氯化鈉注射液稀釋，調(diào)整細胞濃度至2.0×106個/mL，放在冰浴中備用。

2.3 接種小鼠胃癌實體瘤模型的建立

除空白組以外，于無菌條件下抽取接種于小鼠7d的生長良好的腹水，按6×106mL，每只0.2mL接種于小鼠腹腔內(nèi)進行建模[1-5]。24h后，空白組、模型組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10mL·kg-1，每天1次，5-FU對照組1次/14d，復(fù)方萬年青膠囊聯(lián)合5-FU低劑量組、復(fù)方萬年青膠囊聯(lián)合5-FU高劑量組，腹腔注射5-FU，同時分別灌胃給藥，每天1次。以上各組連續(xù)給藥14d。

2.4 Western Blot樣品制備[6-7]

取荷瘤胃癌小鼠瘤體組織約50mg，加入800μL細胞裂解液，利用組織研磨器充分研磨組織，放入4℃垂直旋轉(zhuǎn)1h，12000rpm，離心20min，取上清，測量蛋白含量，-80℃保存待用。根據(jù)蛋白濃度，取50μg蛋白，與5×蛋白上樣緩沖液混勻，在98℃加熱器上加熱5min，瞬離10s。10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，80V，20min，待樣品進入分離膠后，調(diào)整100～120V，80min。取出凝膠轉(zhuǎn)膜，20V，50min。轉(zhuǎn)膜后用含有5%脫脂奶粉的PBST封閉至少1h后，棄掉封閉液，孵育一抗（3% BSA的PBST按1∶1000比例稀釋），4℃，過夜?；厥找豢?，PBST洗三次，10min/次。孵育二抗（5%脫脂奶粉按1∶1000稀釋）室溫，搖床，孵育45min。棄二抗，PBST洗三次，10min/次。將顯色液A和B按照1∶1的比例混勻，均勻滴加于膜上，化學(xué)發(fā)光儀檢測NF-kb p65、p38蛋白的表達情況。

2.5 對荷瘤小鼠血清酶學(xué)指標的影響[8]

采集小鼠外周血，放置于-80℃保存，用于隨后的檢測。通過酶聯(lián)免疫試劑盒檢測免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、腫瘤壞死因子α（TNF-α），相關(guān)操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.6 對荷瘤小鼠NK細胞活性的影響[9-11]

2.6.1 脾細胞懸液的制備

小鼠脫頸椎處死，剪開肌層無菌取脾，置于預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中，剝離剩余脂肪和胰腺。剪碎脾臟通過70μm細胞過濾器以收集單細胞懸浮液。將細胞懸浮液1500轉(zhuǎn)，5min離心后用Gey′s溶液裂解紅細胞，靜止3min后再次離心。反復(fù)裂解離心直至無紅色沉淀，用PBS重懸即收獲脾細胞懸液。

2.6.2 NK細胞活性測定

對K562細胞以及脾細胞進行活細胞計數(shù)。將100μL K562細胞作為靶細胞（2.5×106個/mL）加入到96孔培養(yǎng)板的每個孔中。將100μL脾淋巴細胞用作效應(yīng)細胞（1×107個/mL）添加至每個測試孔。同時設(shè)最大釋放孔及空白對照孔。即：

測 試 孔：K562 100μL+脾細胞100μL

空白對照孔：K562 100μL+RPMI1640 100μL

最大釋放孔：K562 100μL+LDH釋放劑（稀釋后）100μL

細胞于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4h后使用LDH測定試劑盒測量LDH水平?；诠接嬎鉔K細胞的細胞毒率：

ODtest表示試驗孔的吸光度，ODmin表示空白對照孔的吸光度，ODmax表示最大釋放孔的吸光度。

2.7 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 19.0軟件，結(jié)果用均值±標準差表示，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異；Western Blot法檢測蛋白表達情況后，利用Image J、Graphpad Prism軟件分析蛋白表達量。

3 實驗結(jié)果

3.1 對免疫調(diào)節(jié)作用的影響

3.1.1 對荷瘤小鼠血清酶學(xué)指標的影響

結(jié)果表明，與空白對照組比較，模型對照組荷瘤小鼠血清中IgM、IgG、TNF-α活性有不同程度升高（P<0.05，P<0.001）；與模型對照組比較，復(fù)方萬年青膠囊3倍臨床劑量+5-FU聯(lián)合組荷瘤小鼠血清中IgM、IgG、TNF-α活性不同程度降低（P<0.05，P<0.001），復(fù)方萬年青膠囊1倍臨床劑量+5-FU聯(lián)合組荷瘤小鼠血清中IgM、IgG明顯降低（P<0.01）；與5-FU對照組比較，復(fù)方萬年青膠囊3倍臨床劑量+5-FU聯(lián)合組荷瘤小鼠血清中IgG活性明顯降低（P<0.01），復(fù)方萬年青膠囊1倍臨床劑量+5-FU聯(lián)合組荷瘤小鼠血清中IgG活性極明顯降低（P<0.001），詳見表1。

3.1.2 對荷瘤小鼠NK細胞殺傷率的影響

各實驗組小鼠NK細胞殺傷率分別為81.5%、41.1%、159.6%、96.2%、86.3%、120.6%和194.2%，詳見表2。

3.2 對NF-kb p65/p38水平的影響

結(jié)果表明，與模型對照組比較，5-FU對照組與復(fù)方萬年青膠囊1倍、3倍臨床劑量+5-FU聯(lián)合組均能夠下調(diào)NF-kb p65/p38水平；復(fù)方萬年青膠囊1倍、3倍臨床劑量組可使NF-kb p65/p38水平升高，詳見圖1。

4 討論

胃癌是全球十大惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿，進展迅速，多數(shù)患者確診時已為進展期，臨床研究顯示，在接受手術(shù)的患者中，有50%左右患者在1年內(nèi)復(fù)發(fā)，2年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移則占70%率以上[12]。大量基礎(chǔ)研究表明，腫瘤周圍免疫抑制的炎癥微環(huán)境是腫瘤形成的重要因素，可推動胃癌的惡性進程和治療失敗。而中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)機體免疫方面有傳統(tǒng)優(yōu)勢，多項研究已證實，中藥有減輕腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)、治療腫瘤的作用[13]。復(fù)方萬年青膠囊以清熱解毒藥虎眼萬年青、半枝蓮、虎杖、白花蛇舌草為君，以補氣升陽藥人參、丹參、黃芪為臣，以郁金、全蝎、蜈蚣為佐使進行配伍，具有解毒鎮(zhèn)痛、散結(jié)消腫的功效，清熱解毒的同時，補氣升陽、活血止痛，調(diào)節(jié)機體免疫功能。

NK細胞可以通過自然殺傷和介導(dǎo)抗體依賴性的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）直接殺傷靶細胞[14]，它不依賴抗體和補體而直接實現(xiàn)免疫功能，NK細胞的活性更是衡量機體免疫的重要指標。本研究采用BALB/c小鼠的腋下移植瘤模型，研究復(fù)方萬年青膠囊的免疫調(diào)節(jié)作用[15,16]，實驗結(jié)果表明，復(fù)方萬年青膠囊聯(lián)合氟尿嘧啶注射液能明顯增加小鼠NK細胞殺傷率，且復(fù)方萬年青膠囊與氟尿嘧啶注射液聯(lián)合組荷瘤小鼠血清中IgG、IgM含量明顯降低并趨于正常水平，同時炎性因子TNF-α活性明顯降低，提示復(fù)方萬年青膠囊對氟尿嘧啶注射液的癌癥治療具有增效作用，具有明顯的免疫調(diào)節(jié)功能。

腫瘤細胞在細胞生理學(xué)方面有6個標志性改變：生長自給自足、逃避凋亡、對生長抑制信號的不敏感、無限增殖性、血管生成、組織侵襲性和轉(zhuǎn)移性[17,18]。很多介導(dǎo)這些效應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄受NF-kb調(diào)控；MAPK通路是近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤細胞凋亡有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括JNK、ERK、p38等關(guān)鍵調(diào)控因子。其中，p38受細胞因子、藥物、輻射等刺激而產(chǎn)生相應(yīng)作用，參與腫瘤細胞的發(fā)生和進展。有研究顯示p38表達異常與腫瘤患者生存期顯著相關(guān)，活化的p38可以抑制Bcl-2活化和誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位，并通過誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑促進腫瘤細胞凋亡[19-22]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方萬年青膠囊單獨給藥NF-kb p65/p38水平升高，聯(lián)合用藥后可有效降低NF-kb p65/p38 MAPK比值，而p38活性的增強可抑制Bcl-2活化，達到促進細胞凋亡發(fā)生的目的。綜上所述，復(fù)方萬年青膠囊聯(lián)合5-FU可能通過降低NF-kb p65/p38水平，抑制Bcl-2活化，從而抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡的發(fā)生。