陳宏雨，劉琳琳，竇德強*

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院·遼寧大連·116600）

肺氣虛證[1]指肺氣虛弱，呼吸無力，衛(wèi)外不固，以咳嗽無力、氣短而喘、自汗等為主要表現(xiàn)的虛弱證候。中醫(yī)學(xué)認為，“肺主氣，司呼吸”，“久病成虛”。而呼吸系統(tǒng)疾病如慢性支氣管炎、肺氣腫等，在其發(fā)病過程中，均可損傷肺氣導(dǎo)致肺氣虛證。慢性支氣管炎(chronic bronchitis，CB)是指由感染或非感染因素引起的氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎性反應(yīng)。喘息、氣急是呼吸系統(tǒng)疾病最常見的臨床癥狀，也是中醫(yī)肺氣虛證的主要證候。故而近年越來越多的學(xué)者以慢性支氣管炎及肺氣腫為切入點對于肺氣虛證診斷標準的量化與客觀化做出了更深入的研究，相關(guān)理論與觀點也愈漸成熟。如竇紅漫[2]等為掌握肺氣虛證的本質(zhì)特征，通過對實驗性肺氣虛證大鼠氣道病理組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，其基礎(chǔ)病變?yōu)槁灾夤苎准胺螝饽[。

人參作為五加科多年生植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和根莖，人參性味甘、微苦，微溫。歸脾、肺、心、腎經(jīng)。大補元氣，復(fù)脈固脫，補脾益肺，生津養(yǎng)血，安神益智[3]。紅參是由鮮人參經(jīng)過浸潤、清洗、分選、蒸制、晾曬、烘干炮制而成。黑參的炮制方法主要是將鮮人參在蒸制設(shè)備中，蒸煮后晾干反復(fù)進行9次，俗稱“九蒸九曝”。經(jīng)過炮制后紅參與黑參中的化學(xué)成分及其生理活性均有所變化。有研究顯示由于中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的復(fù)雜性，人參、紅參以及黑參可能會通過多成分、多靶點治療CB達到抗肺氣虛的效果，以此來發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用，故而需要系統(tǒng)性地進行研究與探討。

1 方法

研究策略：本文為探究人參、紅參及黑參抗肺氣虛的作用機制及物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)合文獻報道以肺氣虛證常見基礎(chǔ)病變慢性支氣管炎為目的疾病，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進行較為深入的探索學(xué)習：①通過TCMSP并結(jié)合文獻篩選人參、紅參及黑參的活性成分與潛在靶點；②通過人類基因數(shù)據(jù)庫Gene Cards搜集與CB相關(guān)的疾病靶點；③取得藥物-疾病靶點交集后帶入STRING數(shù)據(jù)庫中得到PPI相互作用網(wǎng)絡(luò)圖；④利用Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”互作網(wǎng)絡(luò)；⑤利用計算機R語言技術(shù)以及對應(yīng)數(shù)據(jù)庫對藥物-疾病共同作用靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.1 篩選藥物活性成分與潛在靶點

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18作為閾值對結(jié)果進行篩選，分別查找人參、紅參的主要活性成分及與主要活性成分相關(guān)的潛在靶點。通過查閱文獻[4-6]收集黑參中的活性成分，轉(zhuǎn)化為標準SMILES格式，導(dǎo)入平臺分析，設(shè)置屬性為“homo sapiens”，將靶點概率值不小于0的分子作為該成分有效靶點。

1.2 確定慢性支氣管炎疾病靶點

通過人類基因數(shù)據(jù)庫Gene Cards(http://www.genecards.org/)搜集與CB相關(guān)的疾病靶點。

1.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將三味藥和CB共同作用靶點帶入STRING數(shù)據(jù)庫中，以置信度分數(shù)score＞0.9為條件進行篩選，余參數(shù)不變，得到PPI相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 構(gòu)建藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)

通過數(shù)據(jù)可篩選獲得各藥物活性成分潛在作用靶點及疾病靶點，則可得到兩者的共同靶點，利用Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”互作網(wǎng)絡(luò)。

1.5 富集分析基因本體(GO)功能基因組百科全書（KEGG）通路

利用R 3.6.3(https://www.r-project.org)軟件中Bioconductor(org.Hs.eg.db)合集對人參、紅參和黑參及CB共同作用靶點進行GO和KEGG通路富集分析。P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物化學(xué)成分與相關(guān)靶點

2.1.1 人參的化學(xué)成分與相關(guān)靶點

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中進行檢索篩選之后得到人參相關(guān)有效化合物46個，成分及靶點信息詳見表1。

表1 人參化學(xué)成分及靶點信息

2.1.2 紅參的化學(xué)成分與相關(guān)靶點

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中進行檢索篩選之后得到紅參相關(guān)有效化合物28個，成分及靶點信息詳見表2。

表2 紅參化學(xué)成分及靶點信息

2.1.3 黑參的化學(xué)成分與相關(guān)靶點

通過查閱文獻進行篩選之后得到黑參相關(guān)有效化合物26個，成分及靶點信息詳見表3。

表3 黑參化學(xué)成分及靶點信息

序號 化合物名稱 靶點數(shù)目13 Ginsenoside Rg2 13 14 Ginsenoside Rg5 42 15 Ginsenoside Rg6 12 16 Ginsenoside Rh1 27 17 Ginsenoside Rh3 100 18 Ginsenoside Rh4 100 19 20(S)-Ginsenoside Rh2 36 20 20(R)-Ginsenoside Rh2 36 21 Ginsenoside Rs3 16 22 Ginsenoside F4 37 26 3-methoxy-4-hydroxybenzoic acid 35 25 3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid 26 24 2,5-dihydroxybenzoic acid 20 23 Salicylic acid 25

2.2 篩選慢性支氣管炎疾病靶點

通過人類基因數(shù)據(jù)庫Gene Cards檢索CB的疾病作用靶點，將Relevance score設(shè)置為＞10，獲得慢性支氣管炎的人類相關(guān)作用靶點537個。

2.3 篩選治療CB的潛在靶點

將獲得的疾病靶點分別與人參、紅參、黑參三種藥物繪制韋恩圖取得交集，即得到藥物治療疾病的潛在靶點，分別對應(yīng)人參46個，紅參39個，黑參53個，靶點信息詳見表4。

表4 各藥物治療慢性支氣管炎潛在靶點

2.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將所得藥物-疾病的共同靶點人參46個，紅參39個，黑參53個導(dǎo)入STRING中，構(gòu)建三類參治療CB潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，詳見圖1-3。

2.5 藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)及靶點互作分析結(jié)果

將人參活性成分和作用靶點信息導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，構(gòu)建人參、紅參、黑參治療CB的“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖4-6。通過可視化網(wǎng)絡(luò)分別得出人參、紅參、黑參治療慢性支氣管炎Degree排列在前10的成分，詳見表5。

表5 人參、紅參、黑參治療CB主要有效成分

2.6 GO功能富集分析

2.6.1 人參GO功能富集分析

利用計算機R語言技術(shù)以及對應(yīng)數(shù)據(jù)庫對藥物-疾病的46個共同靶點進行GO功能富集分析。根據(jù)P<0.05，于人參部分確定了77個GO條目，分析結(jié)果顯示包括磷酸酶結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、肽鏈內(nèi)切酶活性、MAP激酶活性等生物過程。根據(jù)P值大小篩選前20個條目作出氣泡圖，詳見圖7。

2.6.2 紅參GO功能富集分析

利用計算機R語言技術(shù)以及對應(yīng)數(shù)據(jù)庫對藥物-疾病的39個共同靶點進行GO功能富集分析。根據(jù)P<0.05，于紅參部分確定了69個GO條目，分析結(jié)果顯示包括磷酸酶結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合等生物過程。根據(jù)P值大小篩選前20個條目作出氣泡圖，詳見圖8。

2.6.3 黑參GO功能富集分析

利用計算機R語言技術(shù)以及對應(yīng)數(shù)據(jù)庫對藥物-疾病的53個共同靶點進行GO功能富集分析。根據(jù)P<0.05，于黑參部分確定了74個GO條目，分析結(jié)果顯示包括跨膜受體蛋白激酶活性、SH2域結(jié)合、生長因子結(jié)合、蛋白質(zhì)磷酸化氨基酸結(jié)合、血小板衍生生長因子受體結(jié)合等生物過程。根據(jù)P值大小篩選前20個條目作出氣泡圖，詳見圖9。

2.7 KEGG通路富集分析

2.7.1 人參KEGG通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫及計算機R語言技術(shù)對人參-CB的46個共同靶點進行KEGG通路分析，根據(jù)P<0.05并結(jié)合相關(guān)文獻進行篩選，得到與CB相關(guān)通路135條（按P值大小列舉前10條），詳見表6。

表6 人參-CB-基因通路富集分析

2.7.2 紅參KEGG通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫及計算機R語言技術(shù)對紅參-CB的39個共同靶點進行KEGG通路分析，根據(jù)P<0.05并結(jié)合相關(guān)文獻進行篩選，得到與CB相關(guān)通路135條（按P值大小列舉前10條），詳見表7。

表7 紅參-CB-基因通路富集分析

2.7.3 黑參KEGG通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫及計算機R語言技術(shù)對黑參-CB的53個共同靶點進行KEGG通路分析，根據(jù)P<0.05并結(jié)合相關(guān)文獻進行篩選，得到與CB相關(guān)通路130條（按P值大小列舉前10條），詳見表8。

表8 黑參-CB-基因通路富集分析

3 討論

通過藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)互作圖Degree值進行排序，人參中起主要治療作用的前10種活性成分有人參皂苷Rh4、人參皂苷Rg5、山柰酚、人參皂苷Rh1、人參皂苷Ra2、三七皂苷R2、三七皂苷R6、人參皂苷Ra0、人參皂苷Ra1、人參皂苷Ra3；紅參中則是人參皂苷Rh4、人參皂苷Rh1、三七皂苷R2、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、人參皂苷Re、人參皂苷Rs1、β-谷甾醇；黑參中包括人參皂苷Rh3、人參皂苷Rh4、人參皂苷Rk3、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rg5、人參皂苷F4、20（S）-人參皂苷Rh2、20（R）-人參皂苷Rh2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rg3。

有報道稱山柰酚具有明顯的抗炎活性，如周運江[7]等發(fā)現(xiàn)山柰酚對于肥大細胞炎癥反應(yīng)具有顯著的抑制效應(yīng)，它能夠抑制IKKβ的活化，抑制IκBα的磷酸化，阻止NF-κB(p65)進入細胞核內(nèi)，進而影響相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放。而β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等生物活性。Liao等[8]發(fā)現(xiàn)β‐谷甾醇可通過抑制表皮細胞、巨噬細胞中炎癥小體NLRP3的激活，來抑制CAS1的產(chǎn)生及MAPK信號通路的活化，導(dǎo)致細胞中的TNF‐α、IL‐1β、IL‐6、IL‐8生成顯著減少從而起到抗炎作用。大量研究表明人參皂苷具有抗炎、抗氧化、抗癌等藥理活性，如研究報道[9]人參皂苷Rg5在人體內(nèi)可代謝為人參皂苷Rh3，后者相較于前者更具生物活性。Lee等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Rh3增強了LPS誘導(dǎo)的5′-腺苷單磷酸激活蛋白激酶(AMPK)的磷酸化，抑制了Akt和janus激酶1/信號傳感器和轉(zhuǎn)錄激活因子1(JAK1/STAT1)，通過上調(diào)sirtuin 1(SIRT1)而抑制核因子-κB(NF-κB)來增強Nrf2 dna結(jié)合活性，提示人參皂苷Rh3在脂多糖(LPS)刺激下的小膠質(zhì)細胞中具有抗炎作用。Jung[11]等研究表明，Rh1可抑制IFN-γ誘導(dǎo)的JAK/STAT和ERK信號通路及其下游轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制iNOS基因的表達，則Rh1可能對于治療各種神經(jīng)炎癥性疾病具有一定作用。Hsieh[12]等發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2具有抗炎及抗氧化作用，對肺疾病的前期階段有潛在治療作用。GRh2降低了由LPS誘導(dǎo)的促炎介質(zhì)一氧化氮(NO)、TNF‐α、白細胞介素(IL)-1β和抗炎細胞因子(IL-4、IL-6和IL-10)在肺組織中的生成。提出其機制是GRh2阻斷了iNOS、COX-2、IκB-α磷酸化、ERK、JNK、p38、Raf-1和MEK蛋白的表達。人參皂苷Rb1通過調(diào)節(jié)小鼠肺部的Nrf2和線粒體信號通路（如CASP3等）來減輕急性肺損傷的炎癥反應(yīng)及氧化損傷[13]。Wang等研究表明，人參皂苷Rg3對氧化樂果誘導(dǎo)的大鼠肺損傷具有保護作用，其機制與其抗氧化作用和抗炎作用有關(guān)，Rg3使丙二醛、TNF-α含量和髓過氧化物酶活性顯著降低[14]。人參皂苷Rg2和Rh1可顯著降低促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-β的mRNA水平[15]。Rgx365（Rg2、Rg4、Rg6、Rh1和Rh4）通過抑制p-STAT-1和NF-κB調(diào)節(jié)iNOS，具有重要的抗炎作用，可能適合于炎癥性疾病的治療[16]。由此，人參、紅參、黑參治療慢性支氣管炎主要發(fā)揮了抗炎、抗氧化等方面的作用從而體現(xiàn)出抗肺氣虛的功效。

且以上成分中如人參皂苷Rh4、Rg5、Rg3、Rk3、Rk1等為人參稀有皂苷，其是黑參中的主要成分，含量及活性均遠勝于紅參與人參，由此推測黑參對于慢性支氣管炎的治療作用較紅參與人參強，更有利于緩解肺氣虛。

由PPI網(wǎng)絡(luò)篩選所得到的主要作用靶點（Degree＞15）包括信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK14、MAPK8、MAPK1）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、B細胞淋巴瘤2(BCL2L1)、胱天蛋白酶(CASP3、CASP8)、雷帕霉素靶蛋白(MTOR)、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP9、MMP2）等。近年研究發(fā)現(xiàn)，STAT3可被各種細胞因子激活，是參與調(diào)控腫瘤細胞生長、凋亡以及一系列炎癥反應(yīng)的重要信號交匯點，具有復(fù)雜的生物調(diào)節(jié)作用[17]；VEGFA是血管生長的主要調(diào)節(jié)因子，體內(nèi)血管生成可以簡單地看作是五種主要反應(yīng):增殖和存活、細胞遷移、血管通透性、侵襲周圍組織和內(nèi)皮細胞炎癥[18]。有體內(nèi)實驗表明，與模型組比較，平喘顆粒能夠顯著抑制哮喘氣道炎癥、膠原沉積和VEGFA蛋白的表達[19]；AKT(也稱為PKB)是PI3K下游的一個信號中間體，分為1-3三種亞型，在VEGF調(diào)控的內(nèi)皮細胞生物學(xué)中具有相當重要的作用。AKT的活性還與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的合成和釋放有關(guān)，使內(nèi)皮細胞呈現(xiàn)出炎癥特性。AKT的下游靶點包括:B細胞淋巴瘤2(BCL2L1)的相關(guān)死亡啟動因子；NF-κB抑制劑激酶(IKK)復(fù)合物，它調(diào)節(jié)核因子NFκB，從而促進炎癥信號的釋放;雷帕霉素復(fù)合物的機制靶點(MTORC1)，增加蛋白質(zhì)合成[18]。MAPK信號通路的主要組成部分p38MAPK，ERK1/2和JNK均會參與炎癥反應(yīng)的表達[20]。基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）目前已作為COPD穩(wěn)定期的可靠生化檢測指標，期間它的分泌量增加，會破壞肺泡基質(zhì)、氣道的重塑[21]。綜上，STAT3，VEGFA，MAPK等信號因子與CB相關(guān)炎癥發(fā)病機制有著緊密聯(lián)系。

GO功能富集分析得到人參治療CB可能與磷酸酶結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、肽鏈內(nèi)切酶活性、MAP激酶活性等生物過程有關(guān)；紅參治療CB可能與磷酸酶結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合等生物過程有關(guān)；黑參治療CB可能與跨膜受體蛋白激酶活性、SH2域結(jié)合、生長因子結(jié)合、蛋白質(zhì)磷酸化氨基酸結(jié)合、血小板衍生生長因子受體結(jié)合等生物過程有關(guān)。

由KEGG富集分析所得到的三種藥物治療CB重合度較高的生物學(xué)通路主要包括：PI3K-Akt信號通路、松弛素信號通路、Th17細胞分化、IL-17信號通路、MAPK信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化信號通路、腫瘤壞死因子TNF信號通路、EB病毒感染、人類巨細胞病毒感染等。查閱文獻得知，炎癥反應(yīng)是CB的核心機制，又細分為氧化應(yīng)激、粘液高分泌、氣道表面脫水及氣道重塑幾方面。PI3K/Akt信號通路能夠參與外部刺激反應(yīng)的重要細胞級聯(lián)，并在多種生物過程如炎癥反應(yīng)、細胞凋亡及增殖等中發(fā)揮重要作用。而通過阻斷PI3K/Akt信號通路，能夠減少炎性細胞(如嗜酸粒細胞，中性粒細胞)在肺組織的浸潤，從而抑制氣道炎癥及杯狀細胞增生引起的黏液高分泌[22]。在抗炎方面，松弛素可以抑制中性粒細胞對內(nèi)皮細胞的粘附性以及對巨噬細胞的浸潤，可以抑制NLRP3和NFκB信號通路，減少炎癥反應(yīng)，并降低炎癥因子的釋放，如IL-1β，IL-6和TNF-α[23]。IL-17被認為主要由輔助性T細胞17(Th17)產(chǎn)生，IL-17作為促炎細胞因子，可誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞和骨髓細胞釋放某些趨化因子、細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和抗菌肽。實驗研究表明，IL-17與其受體結(jié)合，激活NF-κB、MAPK等下游通路，誘導(dǎo)IL-6、TNF-α等促炎細胞因子表達，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生[24]。研究表明，糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路中，AGE與RAGE的結(jié)合可顯著提高TGF-β和MMP-9 mRNA，IL-1的表達水平，促進NF-κB的釋放轉(zhuǎn)運[25]。流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化信號通路中，激活的膜上受體TNFR1、IL-1R間接作用于TAK1，TAK1誘導(dǎo)IKK磷酸化，磷酸化后的IKK在胞質(zhì)中引起I-κB水解，釋放出NFκB，被激活的NF-κB進入細胞核，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)基因表達：如iNOS、ICAM1、TNF-α等[26]。以上均提示人參、紅參、黑參主要通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路、松弛素信號通路、Th17細胞分化、IL-17信號通路等治療慢性支氣管炎，一定程度上闡述了三參抗肺氣虛的作用機制。

綜上所述，本文初步闡釋了人參、紅參及黑參干預(yù)慢性支氣管炎的作用機制及物質(zhì)基礎(chǔ)，體現(xiàn)了多成分、多靶點、多通路的顯著特點，其中黑參的治療作用較強，為進一步研究肺氣虛的臨床證候提供了理論依據(jù)。