李 洋，張林華，曾祖平

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥學部，北京 100010；2.北京市臨床藥學研究所成果轉(zhuǎn)化促進中心，北京 100035；3.北京市中醫(yī)研究所中藥室，北京 100010)

清爽膏是首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑(批準文號：京藥制字Z20073002)，由紫草、大黃和當歸3味中藥組成，功效為清熱解毒、涼血止痛，在臨床上用于血熱毒盛證，外用治療局部潮紅、灼痛、燙凍傷清潔瘡面和銀屑病等。網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學理論，利用網(wǎng)絡分析方法，通過整體觀的角度探討藥物、靶點和疾病間相互作用的藥理學分支學科。網(wǎng)絡藥理學通過對藥物分子、作用靶點及其疾病相關(guān)靶點等資料進行收集、分析，并利用計算機軟件構(gòu)建出“藥物-靶點-疾病”間的相互關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡。網(wǎng)絡藥理學具有整體性、系統(tǒng)性等特點，與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治的理論相一致，近年來已被廣泛用于中藥潛在活性成分的確認及其作用靶點的預測，以及中藥復方制劑的作用機制研究[1-5]?；诰W(wǎng)絡藥理學方法，本研究對清爽膏治療銀屑病的可能機制進行了探討，以期為揭示清爽膏的藥效物質(zhì)基礎和潛在的作用靶點奠定基礎，為進一步研究其作用機制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 清爽膏活性成分檢索及作用靶點的篩選

以紫草、大黃和當歸為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)上檢索清爽膏中3味中藥所含的化學成分。以類藥性(DL)≥0.18為篩選條件，優(yōu)選出各味中藥潛在的化學成分；再通過化學成分檢索到相應的靶點，借助于Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢出靶標蛋白對應的基因名稱。

1.2 疾病靶點的篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中以“psoriasis”為關(guān)鍵詞進行檢索，篩選出與銀屑病相關(guān)的疾病靶點基因信息。

1.3 疾病與藥物共同靶點的篩選

將清爽膏中優(yōu)選出的化學成分靶點及銀屑病相關(guān)疾病靶點，輸入到在線軟件作圖工具平臺(http://www.bioinformatics.com.cn)中繪制韋恩圖，兩者的交集即可認為是“疾病-化學成分”的共同靶點。

1.4 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡的構(gòu)建

基于銀屑病靶點與清爽膏中活性成分靶點之間的相互作用關(guān)系，通過Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡的建立

將篩選出的交集靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫中，分析靶基因間的蛋白質(zhì)相互作用，“Homo sapiens”為限定的物種，將置信度設定為“>0.4”，以代表兩個蛋白間具有相互作用關(guān)系，進而構(gòu)建藥物化學成分靶點和銀屑病靶點的PPI網(wǎng)絡。并將結(jié)果導入到Cytoscape 3.7.0軟件中，再以網(wǎng)絡中各靶基因節(jié)點的連接度值(Degree)作為指標，開展拓撲異構(gòu)學的分析，以期篩選出網(wǎng)絡中的核心蛋白質(zhì)靶標。

1.6 靶點基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

依托DAVID數(shù)據(jù)庫對共同靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路分析，并借助于Omicshare軟件(https://www.omicshare.com/tools/)對所得結(jié)果展開可視化的處理。

2 結(jié)果

2.1 清爽膏活性成分及作用靶點

檢索TCMSP，篩選得到清爽膏的活性成分108種，去除部分沒有靶點的化合物，得到62個化合物，以ID進行排序后，前5個化合物分別為兒茶素[(-)-catechin]、齊墩果酸(oleanolic acid)、長柄扁豆(sitoglusidebeta-sitostero)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)和谷甾醇(sitosterol)。在此基礎上進一步查找清爽膏中有效/活性成分的靶點，篩選后共得到150個靶點蛋白。在UniProt數(shù)據(jù)庫中輸入上述靶點蛋白，并查詢其所對應的靶點簡稱，最終獲得127個靶點基因。

2.2 疾病靶點

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選得到與銀屑病相關(guān)的疾病靶點基因共3 881條。

2.3 藥物與疾病靶點的交集

通過在線軟件作圖工具平臺(http://www.bioinformatics.com.cn)，繪制清爽膏中127個靶點基因以及銀屑病相關(guān)3 881個靶點基因的韋恩圖，兩者的交集認定為“疾病-化學成分”的共同作用靶點，共82個，見圖1。

圖1 銀屑病與清爽膏成分靶點的韋恩圖

2.4 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡

通過Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建清爽膏“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡，見圖2。圖中共包含130個節(jié)點，310條相互作用關(guān)系。清爽膏中作用于銀屑病的化學成分有45個，Degree排序居前5位的化合物為熊果酸(ursolic acid)、大黃素(emodin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)和蘆薈大黃素(aloe-emodin)，其中，熊果酸為紫草含有的成分，β-谷甾醇為當歸、大黃共有的成分，大黃素、蘆薈大黃素為大黃含有的成分，豆甾醇是當歸含有的成分；化合物與疾病共同作用靶點82個，Degree排序居前5位的靶點為PTGS2、PTGS1、ESR1、NCOA1和CA2，見表1。

菱形代表中藥，矩形代表化合物，橢圓形代表靶點

表1 清爽膏“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡拓撲圖分析表

2.5 PPI網(wǎng)絡的建立

利用String數(shù)據(jù)庫，將篩選出的清爽膏作用靶點與銀屑病相關(guān)靶點的交集靶點基因?qū)肫渲?，對靶基因間的PPI進行分析，構(gòu)成“藥物化學成分靶點-銀屑病靶點”的PPI網(wǎng)絡圖，見圖3。網(wǎng)絡中共有82個節(jié)點，1 036條邊；圖中的節(jié)點表示蛋白質(zhì)的靶點，每條邊表示PPI關(guān)系。將其導入Cytoscape 3.7.0軟件進行拓撲異構(gòu)學分析，并繪制Degree排序居前20位的靶點柱狀圖，見圖4。Degree排序居前5位的靶點分別為白細胞介素6(IL-6)、腫瘤抑制蛋白p53(TP53)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、腫瘤壞死因子(TNF)、信號傳導蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物(STAT3)。

圖3 清爽膏與銀屑病共同靶點PPI網(wǎng)絡圖

圖4 Degree排序居前20位的靶點柱狀圖

2.6 GO功能富集分析

依托DAVID平臺進行GO功能富集分析，總共得到501條數(shù)據(jù)，將錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05作為標準，最終得到203條數(shù)據(jù)。其中，152個條目與生物過程相關(guān)，32個條目與分子功能相關(guān)，19個條目與細胞組成相關(guān)。表2列舉了前20條(以FDR從小到大排序)顯著的富集通路，主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、凋亡過程和血管生成等。

表2 清爽膏PPI網(wǎng)絡中的GO條目

2.7 KEGG通路富集分析

依托DAVID平臺進行通路富集分析，以P<0.01、FDR<0.05作為條件進行篩選，共得81條結(jié)果，將結(jié)果通過Omicshare軟件進行可視化。根據(jù)P值，選取前20個條目展示，見圖5。信號通路主要包括乙型肝炎、癌癥的途徑、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、結(jié)直腸癌、MAPK信號通路、p53信號通路和血管內(nèi)皮生長因子信號通路等。

圖5 KEGG通路富集的氣泡圖

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，以表皮增厚、免疫反應和血管增生為特點。研究結(jié)果表明，銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程與免疫功能失調(diào)、信號轉(zhuǎn)導通路紊亂、血管損傷和相關(guān)基因表達均有一定的相關(guān)性[6-7]?，F(xiàn)代醫(yī)學治療銀屑病主要的藥物包括保濕劑、潤膚劑、糖皮質(zhì)激素、維生素D3衍生物和鈣調(diào)磷酸酶抑制劑等，但不良反應較多，無法長期使用[8]。中醫(yī)藥治療銀屑病歷史悠久，療效確切，能夠改善病情，延長緩解期，具有不良反應小的特點。清爽膏來源于趙炳南的臨床經(jīng)驗方“清涼膏”[9]。清爽膏由大黃、當歸和紫草3味中藥組成，其中大黃清熱瀉火、涼血解毒；當歸補血活血；紫草清熱涼血、活血解毒、透疹消斑。3味藥組合，具有清熱涼血、活血解毒的作用，對銀屑病的治療有一定的療效。

本研究中，“藥物-成分-共同靶點”網(wǎng)絡圖共獲得45個清爽膏作用于銀屑病的核心成分，以及對應的82個核心調(diào)控靶點。核心成分中最關(guān)鍵的成分包括熊果酸、大黃素、蘆薈大黃素、β-谷甾醇和豆甾醇。β-谷甾醇參與炎癥反應，同時可以減少TNF、IL-6和IL-1β的釋放，并據(jù)此改善銀屑樣的特征性皮損[10-11]。蘆薈大黃素具有抗炎的功效，能降低IL-6和TNF-α水平；能增加皮膚及皮膚血管相關(guān)生長因子的表達水平，促進創(chuàng)面愈合；能顯著抑制人膠質(zhì)細胞增殖且誘導角質(zhì)細胞凋亡；還能增強巨噬細胞的吞噬作用，誘導IL-1β增強機體免疫[12]。

“藥物-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡顯示，Degree排序居前5位的靶點分別為PTGS2、PTGS1、ESR1、NCOA1和CA2，其中被藥物調(diào)控最多的作用靶點為PTGS2，PTGS1、ESR1次之。前列腺素是一類具有生理活性的不飽和脂肪酸，參與介導細胞增殖、分化和凋亡等一系列細胞活動，參與炎癥、惡性腫瘤和心血管疾病等多種病理過程。其中，PTGS2參與前列腺素的合成，是前列腺素合成過程中的一種關(guān)鍵酶[13]。ESR1是雌激素受體，可調(diào)節(jié)脂肪組織的VEGFA，增強血管生成，減少炎癥和改善脂肪組織功能[1]。

本研究構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡圖顯示，清爽膏治療銀屑病的關(guān)鍵靶點包括IL-6、TP53、VEGFA、TNF、STAT3、PTGS2、CASP3、JUN和MAPK8。IL-6是一種多功能的促炎因子，在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，通過多條信號通路激活其受體，可對細胞的增殖、分化和凋亡等多種生理過程產(chǎn)生影響[14]。TNF由活化的巨噬細胞、自然殺傷細胞及淋巴細胞產(chǎn)生，具有廣泛生物活性的細胞因子。TNF參與了眾多疾病的發(fā)生和發(fā)展，如腫瘤、感染、發(fā)熱、內(nèi)毒素性休克和自身免疫性疾病等。TNF能促使炎癥因子的合成與釋放，可能與銀屑病的炎癥反應有關(guān)[15]。銀屑病的炎癥過程主要通過樹突狀細胞DCs和T細胞介導，其與角質(zhì)形成細胞KCs相互作用，使病灶部位皮膚出現(xiàn)表皮角化過度伴角化不全、淋巴細胞大量浸潤和廣泛血管生成的組織病理學特征。主要參與的關(guān)鍵靶點為TNF、IL-17A、IL-12和IL-23[16]。

為了對共同作用靶點的機制作用進行深入探索，本研究開展了GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析結(jié)果顯示，共同靶點的基因功能主要集中在細胞的增殖調(diào)控、基因的表達調(diào)控、細胞對缺氧的反應以及細胞凋亡調(diào)控等生物過程。通過KEGG信號通路分析可知，共同靶點作用通路包括HIF-1信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路和p53信號通路等。HIF-1缺氧誘導因子是一種轉(zhuǎn)錄因子，缺氧條件下存在于人體內(nèi)，是應答缺氧應急的關(guān)鍵因子，HIF-1α是HIF-1的一個亞單位，在銀屑病皮損中高表達，可誘導血管內(nèi)皮生長因子表達，促進血管生長和表皮角質(zhì)層過度增殖[17]。PI3K/AKT信號通路參與了細胞的增殖、分化和凋亡等過程，并參與表皮細胞的分化和存活過程[10]。p53信號通路是DNA損傷后介導細胞周期阻滯的關(guān)鍵路徑，其異?？蓪е录毎蛲龌蜻^度增殖。銀屑病是一種具有特征性細胞過度增殖的慢性炎癥性皮膚病，發(fā)病時可以檢測到p53表達增多[18]。該通路涉及的靶點有CASP9、CDKN1A、CCNB1、CASP3、CASP8、BAX和TP53。有研究結(jié)果表明，銀屑病角質(zhì)形成細胞與CASP3活性有一定的相關(guān)性，可以增加CASP3蛋白表達。CASP3是一種細胞凋亡標志物，可以反應銀屑病的進展情況。MAPK是一種絲氨酸蛋白激酶，是能夠接受各種有絲分裂原刺激而活化的一種蛋白激酶。有研究結(jié)果表明，銀屑病患者皮損中MAPK的活性明顯增高，可能是由于高水平的生長因子使MAPK過度激活，從而參與了銀屑病表皮細胞過度增殖的調(diào)節(jié)[19]。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡藥理學分析方法，探討清爽膏通過多成分、多途徑、多靶點治療銀屑病的作用機制，明確了清爽膏中核心化學成分的組成，分析了清爽膏治療銀屑病的機制與IL-6、MAPK、TNF、CASP3、PTGS2、PTGS1和ESR1靶點的相關(guān)性強，與HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、p53信號通路、MAPK信號通路和血管內(nèi)皮生長因子信號通路有關(guān)，為進一步研究清爽膏治療銀屑病的作用機制提供了思路，但仍需實驗驗證。