管慶美，劉燕群,△，吳 倩，林可欣，魯雄兵，張 龍，陳路鋒

(1.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北 武漢 430056；2.江漢大學(xué)持久性有毒污染物環(huán)境與健康危害湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430056)

鉻一直被認(rèn)為是人和動(dòng)物的必需微量元素，也被廣泛用于金屬冶煉、皮革制造、化妝品生產(chǎn)、人工關(guān)節(jié)等各個(gè)行業(yè)。然而鉻也是環(huán)境重金屬污染物，可通過(guò)多種途徑蓄積于體內(nèi)，造成機(jī)體損傷。在不同價(jià)態(tài)鉻之間以六價(jià)鉻毒性作用尤為嚴(yán)重[1-2]。六價(jià)鉻也被WHO定為人類確定致癌物，過(guò)量攝入鉻會(huì)造成肝臟、腎臟、骨骼、皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)損傷[3-7]，甚至有致癌、致突變等不良影響，并且重鉻酸鉀對(duì)胚胎、子一代機(jī)體損傷也已被證實(shí)[8-9]。然而重鉻酸鉀對(duì)子一代生殖器官損傷的研究甚少見(jiàn)，具體機(jī)制尚不明確。因六價(jià)鉻可穿過(guò)細(xì)胞膜，且具有強(qiáng)氧化性，可損傷卵黃囊，也可穿過(guò)胎盤屏障，且母乳喂養(yǎng)也可傳播鉻離子，合并對(duì)仔鼠造成臟器損傷[10-11]。提示六價(jià)鉻宮內(nèi)暴露會(huì)對(duì)雌性仔鼠卵巢產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)，造成潛在的生殖發(fā)育毒性。故本研究建立了重鉻酸鉀染毒模型，觀察了對(duì)子一代雌鼠的氧化損傷效應(yīng)。SD大鼠因其具有個(gè)體差異小、試驗(yàn)數(shù)據(jù)較準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),廣泛用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[12]。本研究選用SD大鼠，通過(guò)將妊娠期、哺乳期雌性大鼠暴露于不同濃度重鉻酸鉀，觀察了子一代雌性仔鼠性成熟時(shí)期卵巢的氧化應(yīng)激水平，對(duì)母鼠孕期和哺乳期暴露重鉻酸鉀對(duì)子一代仔鼠卵巢氧化損傷的影響進(jìn)行了初步探討，旨在為重金屬致子一代雌性仔鼠生殖毒性的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2019年6月選取無(wú)特定病原體級(jí)SD大鼠雌性23只，雄性10只，均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(合格證號(hào)：1100111911015206)。大鼠毛發(fā)濃密有光澤，身體狀況良好。將大鼠雌雄分開(kāi)并置于室內(nèi)(24±1)℃適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2儀器與試劑 重鉻酸鉀產(chǎn)于山東西亞化學(xué)股份有限公司，純度99.8%；JA2003B電子天平購(gòu)自上海越平科學(xué)儀器有限公司，XD-202倒置生物顯微鏡購(gòu)自南京江南永新，離心機(jī)購(gòu)自上海越平科學(xué)儀器有限公司，臺(tái)式離心機(jī)(TGL-16C)、純水儀(AJC-0501-P)、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1配制重鉻酸鉀染毒液 準(zhǔn)確稱取適量重鉻酸鉀配制成1/2、1/4、1/8 LD50重鉻酸鉀溶液分裝至氯化聚氯乙烯管中，置于冰箱(4 ℃)保存，以供低、中、高濃度染毒組灌胃使用。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1預(yù)實(shí)驗(yàn) 因六價(jià)鉻LD50濃度為171.00 mg/kg[13]。故設(shè)置1/2 LD50(85.5 mg/kg)、1/4 LD50(42.75 mg/kg)、1/8 LD50(21.375 mg/kg)濃度染毒組及生理鹽水對(duì)照組。每組2只雌鼠，1只雄鼠。在適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后于09：00合籠，雌雄比例為2∶1。第2天09：00進(jìn)行陰道涂片檢測(cè)雌鼠是否成功受孕。以顯微鏡下觀察到精子為妊娠第0天并記錄體重，第1天起開(kāi)始灌胃。各組孕鼠按0.01 mL/g劑量灌胃,從孕1～19 d每天上午08：30稱重后根據(jù)體重調(diào)整劑量，每天灌胃劑量一次性完成，自由飲水、進(jìn)食，直至生出仔鼠后斷奶。斷奶后對(duì)仔鼠進(jìn)行觀察，斷頭取血，并取其卵巢，濾紙脫水，稱重，分析確定正式實(shí)驗(yàn)重鉻酸鉀濃度。

1.2.2.2正式實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，1/2、1/4、1/8 LD50重鉻酸鉀溶液對(duì)卵巢具有一定影響，且老鼠存活率較高。故正式實(shí)驗(yàn)依舊采用此濃度重鉻酸鉀溶液。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)方法將雌鼠分為低(1/8 LD50)、中(1/4 LD50)、高(1/2 LD50) 濃度染毒組(各4只)和對(duì)照組(3只)。 將大鼠按雌雄比例2∶1合籠，按預(yù)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定雌鼠妊娠日期并記錄，并于妊娠第1天起按0.01 mL/g劑量開(kāi)始灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃至仔鼠出生后斷奶(19 d)。對(duì)照組仔鼠(不分雌雄)27只,低濃度染毒組37只,中濃度染毒組33只,高濃度染毒組48只。每組挑取體重、毛色、生理狀態(tài)相似的8只雌性仔鼠繼續(xù)喂養(yǎng)(自由飲水、進(jìn)食)至45 d(性成熟)后稱重、麻醉剖取卵巢組織，濾紙脫水，稱重計(jì)算臟器系數(shù)。每組取6只雌性仔鼠測(cè)定卵巢組織勻漿SOD 、GSH-Px 活力。

1.2.3觀察指標(biāo)

1.2.3.1仔鼠體重、卵巢重量及臟器系數(shù) 各組仔鼠出生45 d使用7%水合氯醛麻醉，稱重并處死仔鼠，迅速分離雙側(cè)卵巢組織，用濾紙吸干，進(jìn)行稱量并計(jì)算卵巢系數(shù)(卵巢重量/體重×100%)。

1.2.3.2卵巢SOD、GSH-Px活力 稱取各組仔鼠適量卵巢組織用9倍勻漿介質(zhì)研磨，然后將研磨液3 000～4 000 r/min離心10 min，用移液槍取上清液制備成10%組織勻漿，各試劑反應(yīng)時(shí)間與劑量和操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作，采用分光光度法測(cè)定SOD、GSH-Px活力。

2 結(jié) 果

2.1各組仔鼠一般情況比較 對(duì)照組仔鼠精神狀態(tài)良好，毛色正常，活潑好動(dòng)，反應(yīng)迅速，食欲正常，體重不斷增加，無(wú)明顯異常情況。隨染毒時(shí)間延長(zhǎng)，中、高濃度染毒組仔鼠食欲減退，較為安靜，體重增長(zhǎng)緩慢，較對(duì)照組低；仔鼠毛色由純白、有光澤變得偏黃、無(wú)光澤，且以高濃度染毒組最為明顯。

2.2各組仔鼠體重、卵巢重量及臟器系數(shù)比較 與對(duì)照組比較，低濃度染毒組仔鼠體重較高，而中、高濃度染毒組仔鼠體重明顯較低，且高濃度染毒組較為明顯，不同濃度染毒組仔鼠卵巢系數(shù)均明顯降低，且隨染毒濃度升高仔鼠卵巢重量及臟器系數(shù)均呈下降趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組仔鼠體重、卵巢重量及臟器系數(shù)比較

2.3各組仔鼠卵巢組織SOD、GSH-Px活力比較 與對(duì)照組比較，中、高濃度染毒組仔鼠卵巢 GSH-Px活力明顯降低，不同濃度染毒組仔鼠卵巢SOD活力均明顯降低,且隨染毒濃度升高仔鼠SOD、GSH-Px活力均呈下降趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組仔鼠卵巢組織SOD、GSH-Px活力比較

3 討 論

卵巢是卵泡的生長(zhǎng)、發(fā)育場(chǎng)所，其受損必將影響生殖能力。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臟器系數(shù)可反映毒物對(duì)動(dòng)物某臟器的綜合毒性損傷作用，臟器系數(shù)下降表示臟器萎縮和退行性病變[14]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，中、高濃度染毒組仔鼠體重較輕，以高濃度染毒組較為明顯。且不同濃度染毒組仔鼠卵巢重量及系數(shù)均明顯下降，且以高濃度染毒組最為明顯，說(shuō)明重鉻酸鉀孕期、哺乳期暴露對(duì)仔鼠生殖發(fā)育造成了毒性損傷。

活性氧歧化物是超氧陰離子、羥自由基、過(guò)氧化氫及其中間代謝產(chǎn)物的總稱,在細(xì)胞內(nèi)含量高低反映了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平。六價(jià)鉻可使機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧歧化物[15],內(nèi)源性抗氧化劑——SOD、GSH-Px是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，SOD能清除超氧陰離子自由基,將其歧化為氧氣和過(guò)氧化氫,被稱為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線；作為抵御氧化損傷的第二道防線的GSH-Px能進(jìn)一步將過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化成水和氧氣,保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能不受過(guò)氧化物的干擾及損害[16]。因此，測(cè)定SOD、GSH-Px活力能間接反映生物體內(nèi)清除活性氧的能力。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，中、高濃度染毒組仔鼠卵巢GSH-Px活力明顯降低，不同濃度染毒組小鼠卵巢SOD活力均明顯降低，提示鉻進(jìn)入細(xì)胞膜后其強(qiáng)氧化性引發(fā)氧化應(yīng)激產(chǎn)生了大量氧自由基，超出了機(jī)體清除能力，SOD、GSH-Px活力下降,致使組織受到活性氧攻擊而產(chǎn)生損傷。

綜上所述，重鉻酸鉀孕期、哺乳期暴露可致仔鼠卵巢發(fā)生不同程度氧化損傷，但對(duì)雌性生殖系統(tǒng)的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討，仍需加強(qiáng)這方面的研究。