韓雙艷 李靜文 王媛媛

(華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006)

巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)(簡(jiǎn)稱畢赤酵母)是一種典型的甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母，可以利用甲醇作為唯一的碳源和能源。畢赤酵母具有強(qiáng)醇氧化酶基因AOX1啟動(dòng)子[1]，其遺傳背景清晰、分泌效率高、可整合型表達(dá)、高密度發(fā)酵，因而被廣泛地應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)的制備、表征以及結(jié)構(gòu)解析等方面，是應(yīng)用最為廣泛的真核外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一[2- 7]。甲醇作為一種極具吸引力的一碳化合物，價(jià)格低廉，來(lái)源豐富，全球年產(chǎn)量約為5 300萬(wàn)噸[8]。與糖蜜等發(fā)酵原料不同，甲醇是一種純底物，在發(fā)酵過程中可以被完全利用，是一種極有潛力的工業(yè)生物原料。目前，利用合成生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建甲醇營(yíng)養(yǎng)型微生物細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)從甲醇到化學(xué)品的生物轉(zhuǎn)化已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)[9]。因此，研究畢赤酵母甲醇代謝關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，提高甲醇利用效率，增強(qiáng)菌體的重組蛋白生產(chǎn)能力，構(gòu)建高效利用甲醇的畢赤酵母人工細(xì)胞具有重要意義。

畢赤酵母甲醇代謝途徑(MUT)主要發(fā)生在過氧化酶體中[10- 11]。甲醇進(jìn)入過氧化酶體后在甲醇氧化酶(AOX)的催化下與氧結(jié)合生成兩種具有細(xì)胞毒性的化合物—過氧化氫與甲醛。過氧化氫可由過氧化氫酶(CAT)催化分解為H2O和O2。甲醛進(jìn)入同化途徑或者異化途徑被繼續(xù)分解利用。同化途徑中，甲醛在二羥丙酮合酶(DAS)的催化作用下與5-磷酸-木酮糖(Xu5P)反應(yīng)生成二羥丙酮(DHA)和三磷酸甘油醛(GAP)。GAP和DHA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，被一系列酶催化最終生成6-磷酸果糖(F6P)，然后用于Xu5P的再生[12]和細(xì)胞成分的生物合成。異化途徑中甲醛被釋放至細(xì)胞質(zhì)，在一系列酶的作用下生成CO2和NADH[13]。異化途徑主要的作用為解除甲醛毒性和提供能量(NADH)[13]。

畢赤酵母的甲醇利用率和同化效率都較低。高甲醇濃度對(duì)菌體具有毒性，中間代謝產(chǎn)物甲醛的積累會(huì)嚴(yán)重抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，減小甲醇利用通量，嚴(yán)重制約蛋白及化學(xué)品的合成[14]。進(jìn)入代謝途徑的甲醇50%～80%通過異化途徑生成CO2排出，導(dǎo)致大量碳原子損失[15- 16]。當(dāng)甲醇作碳源時(shí)，畢赤細(xì)胞中過氧化物酶體幾乎占整個(gè)細(xì)胞體積的80%，AOX增至細(xì)胞總蛋白的35%～40%[17]。AOX與二羥丙酮合酶(DAS)隨機(jī)分散于內(nèi)部[17]，AOX與DAS的相對(duì)分散會(huì)導(dǎo)致甲醛的分散積累更加嚴(yán)重。Guo等[18]發(fā)現(xiàn)，對(duì)異化途徑進(jìn)行下調(diào)或缺失會(huì)導(dǎo)致NADH和ATP供量減少，影響細(xì)胞代謝的平衡，無(wú)法提高細(xì)胞利用甲醇合成目的產(chǎn)物的通量。Krainer等[19]通過過表達(dá)甲醇代謝關(guān)鍵酶DAS使細(xì)胞利用底物甲醇轉(zhuǎn)化目的蛋白的效率提高2～3倍，其轉(zhuǎn)化速率較慢。因而提高同化途徑效率，增加目的蛋白產(chǎn)量的重要方法之一是直接增強(qiáng)甲醇同化途徑代謝，提高途徑通量。

基于多酶組裝技術(shù)構(gòu)建高效催化的超分子復(fù)合體系是酶催化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。通過多酶組裝可實(shí)現(xiàn)底物通道作用，即反應(yīng)中間產(chǎn)物不經(jīng)主體溶劑擴(kuò)散，直接從一個(gè)酶的活性位點(diǎn)傳遞至下一個(gè)酶的活性位點(diǎn)，有效防止中間體在擴(kuò)散或競(jìng)爭(zhēng)途徑中損失，提高酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)轉(zhuǎn)化效率[20- 24]。源于Streptcoccuspyogenes纖粘蛋白FbaB的CnaB2結(jié)構(gòu)域的SpyTag/SpyCatcher體系包含兩個(gè)部分：SpyTag(13個(gè)氨基酸殘基)和SpyCatcher(113個(gè)氨基酸殘基)，SpyTag的Asp117和SpyCatcher的Lys31 能自發(fā)形成異肽共價(jià)鍵實(shí)現(xiàn)分子黏合[25- 26]，主要用于生物耦聯(lián)、生物膜制備以及多酶自組裝等[27]。Yin等[28]構(gòu)建了SpyTag/SpyCatcher介導(dǎo)的合成靛藍(lán)的雙酶(單加氧酶和葡萄糖脫氫酶)自組裝復(fù)合體，在大腸桿菌中表達(dá)后，靛藍(lán)產(chǎn)量達(dá)258 mg/L，是未組裝多酶系統(tǒng)的1.9倍，這為SpyTag/SpyCatcher在合成生物學(xué)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。但迄今為止SpyTag/SpyCatcher體系在畢赤酵母中的異源表達(dá)及自組裝鮮見報(bào)道。

本研究針對(duì)畢赤酵母甲醇代謝關(guān)鍵酶AOX和DAS分子構(gòu)象設(shè)計(jì)雙酶復(fù)合體系的組裝結(jié)構(gòu)，利用SpyTag/SpyCatcher體系對(duì)AOX和DAS進(jìn)行組裝，構(gòu)建底物通道，以減少甲醛擴(kuò)散和積累，增大同化途徑通量，緩解畢赤酵母甲醇利用低效問題。研究先采用雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)技術(shù)[29]的黃色熒光蛋白YFP驗(yàn)證了SpyTag和SpyCatcher是否能在畢赤酵母內(nèi)自識(shí)別和組裝，隨后構(gòu)建了SpyTag-DAS1與SpyCatcher-AOX1超分子雙酶復(fù)合物，利用雙分子熒光互補(bǔ)標(biāo)記觀察超分子雙酶復(fù)合物是否形成。然后，通過在胞內(nèi)表達(dá)超分子雙酶復(fù)合物的重組畢赤酵母中分泌表達(dá)綠色熒光蛋白EGFP為報(bào)告蛋白，分析了細(xì)胞利用甲醇合成目的蛋白的產(chǎn)量，結(jié)果顯示自組裝雙酶體系能夠有效地提高畢赤酵母甲醇利用效率。本研究為構(gòu)建高效利用甲醇的畢赤酵母人工細(xì)胞提供了一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因

DAS1基因(GenBank：FJ752551.1)、SpyTag/ SpyCatcher(PDB：4MLI)基因以及黃色熒光蛋白YFP(GenBank：BAF90852.1)基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.2 質(zhì)粒、菌種和引物

本研究使用的質(zhì)粒和菌株見表1，使用的引物見表2。

表1 本研究使用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.1.3 工具酶與試劑

限制性內(nèi)切核酸酶均購(gòu)自TaKaRa公司，酵母基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒和NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix同源重組試劑盒購(gòu)自Magen公司，博來(lái)霉素購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

低鹽細(xì)菌LB(LBL)液體培養(yǎng)基：0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，0.5%氯化鈉。添加2%的瓊脂為L(zhǎng)BL固體培養(yǎng)基。添加25 μg/mL博來(lái)霉素和2%的瓊脂為博來(lái)霉素抗性LBL(LBLZ)固體培養(yǎng)基。

酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YPD)液體培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖。添加2%的瓊脂為YPD固體培養(yǎng)基。添加100 μg/mL 博來(lái)霉素和2%的瓊脂為博來(lái)霉素抗性YPD(YPDZ)固體培養(yǎng)基。

最小葡萄糖(MD)培養(yǎng)基：1.34%無(wú)氨基酸酵母氮源YNB，2%葡萄糖，2%瓊脂。

含緩沖液的最小甘油復(fù)合培養(yǎng)基(BMGY)液體培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%無(wú)氨基酵母氮源(不含氨基酸)，1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甘油。

含緩沖液的最小甲醇復(fù)合培養(yǎng)基(BMMY)液體培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%無(wú)氨基酵母氮源(不含氨基酸)，1%～2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇。

酵母提取物甲醇蛋白胨(YPM)固體培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，3%(4%、5%)甲醇，2%瓊脂粉。

1.1.5 儀器設(shè)備

基因擴(kuò)增(PCR)儀Mastercycler gradient購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，酶標(biāo)儀Multiskan Ascent和微型紫外分光光度計(jì)NanoDrop 1000購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，電穿孔儀MicroPluser購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司，搖床ZWYR-D2402購(gòu)自上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司，激光共聚焦掃描顯微鏡LSM710購(gòu)自ZEISS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SpyTag/SpyCatcher胞內(nèi)組裝驗(yàn)證畢赤酵母細(xì)胞的構(gòu)建

將質(zhì)粒pPICZαA-YN-SpyTag經(jīng)MssI 酶線性化后，電轉(zhuǎn)GS115感受態(tài)，利用YPDZ平板篩選。挑選菌落進(jìn)行反復(fù)凍融法破壁，用引物P1和P2鑒定整合情況，獲得GS115-YN-SpyTag。將pPICZαA-YN、pPIC9K-YC-SpyCatcher經(jīng)MssI 酶線性化后，電轉(zhuǎn)GS115-YN-SpyTag感受態(tài)，利用最小葡萄糖培養(yǎng)基MD平板篩選。挑選菌落用反復(fù)凍融法破壁，用引物P1和P3鑒定整合情況，獲得GS115-YN-SpyTag-YC-SpyCatcher，命名為NTCC。

1.2.2 SpyTag/SpyCatcher胞內(nèi)組裝驗(yàn)證-BiFC分析

將菌株NTCC接種至YPD液體培養(yǎng)基中，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速250 r/min，培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接至含1%甲醇的BMMY液體培養(yǎng)基中，控制起始D(600)=1，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)24 h后，取250 μL菌液作為樣品，以7 000 r/min離心處理5 min，棄掉上清，用磷酸緩沖鹽溶液PBS(pH7.4)洗滌菌體3次，用500 μL PBS(pH7.4)重懸菌體，30 ℃暗置1 h。使用激光共聚焦顯微鏡，激發(fā)波長(zhǎng)為515 nm[30]，檢測(cè)樣品熒光。

1.2.3 基于SpyTag/SpyCatcher的雙酶胞內(nèi)組裝驗(yàn)證載體的構(gòu)建

以pPICZαA為模板，用引物P4和P5擴(kuò)增出pPICZαA片段；以pPICZαA-YN-SpyTag為模板，用引物P6和P7擴(kuò)增出YN-SpyTag基因；以pPIC9K-DAS1為模板，用引物P8和P9擴(kuò)增出DAS1基因。通過設(shè)計(jì)引物的序列，使獲得的片段之間存在20 bp重疊，用以通過同源重組進(jìn)行片段融合成重組質(zhì)粒。將同源重組的產(chǎn)物pPICZαA-YN-SpyTag-DAS1轉(zhuǎn)化到感受態(tài)TOP10，用LBL平板篩選和菌落PCR鑒定，并送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，將正確的菌株保存。以pPIC9K-YC-SpyCatcher為模板，用引物P10和P11擴(kuò)增出YC-SpyCatcher基因；以GS115基因組為模板，用引物P12和P13擴(kuò)增出AOX1基因。將pPIC9K質(zhì)粒用BamHI和NotI雙酶切，獲得pPIC9K片段。通過設(shè)計(jì)引物的序列，使得獲得的片段之間以及片段與pPIC9K雙酶切的兩端存在20 bp重疊，用以通過同源重組進(jìn)行片段融合成重組質(zhì)粒pPIC9K-YC-SpyCatcher-AOX1。將片段同源重組后轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10，用含有KanR的LB平板篩選菌落PCR鑒定，并送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，將正確的菌株保存。

1.2.4 基于SpyTag/SpyCatcher的雙酶胞內(nèi)組裝驗(yàn)證細(xì)胞的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pPICZαA-YN-SpyTag-DAS1用MssI 酶線性化后，電轉(zhuǎn)GS115感受態(tài)，利用YPDZ平板篩選。挑選菌落進(jìn)行反復(fù)凍融法破壁，進(jìn)行菌落PCR鑒定整合情況，獲得GS115-YN-SpyTag-DAS1菌株。將重組質(zhì)粒pPIC9K-YC-SpyCatcher-AOX1用MssI 酶線性化后，電轉(zhuǎn)GS115-YN-SpyTag-DAS1感受態(tài)，利用MD平板篩選。挑選菌落進(jìn)行反復(fù)凍融法破壁，進(jìn)行菌落PCR鑒定整合情況，獲得GS115-YN-SpyTag-DAS1-YC-SpyCatcher-AOX1菌株，命名為YNDCA。

1.2.5 基于SpyTag/SpyCatcher的雙酶胞內(nèi)組裝驗(yàn)證

將菌株YNDCA按第1.2.2節(jié)的方法進(jìn)行組裝驗(yàn)證。

1.3 SpyTag/SpyCatcher自組裝菌株的構(gòu)建

1.3.1 SpyTag-DAS1/Spycathe-AOX1表達(dá)載體的構(gòu)建

以pPICZαA-YN-SpyTag-DAS1為模板，用引物P14和P15擴(kuò)增出SpyTag-DAS1片段。將質(zhì)粒pPIC9K和SpyTag-DAS1片段分別用PmlI和NotI雙酶切，對(duì)表達(dá)載體pPIC9K和SpyTag-DAS1片段進(jìn)行酶切產(chǎn)物回收。用T4連接酶連接片段和質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-SpyTag-DAS1，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)TOP10，用LBL平板篩選和菌落PCR鑒定，并送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，將正確的菌株保存。以pPIC9K-YC-SpyCatcher-AOX1為模板，用引物P16和P17擴(kuò)增出SpyCatcher-AOX1基因。將質(zhì)粒pPICZA-loxp/Cre和SpyCatcher-AOX1片段分別用PmlI和NotI雙酶切，對(duì)表達(dá)載體pPICZA-loxp/Cre和SpyCatcher-AOX1片段進(jìn)行酶切產(chǎn)物回收。用T4連接酶連接片段和質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pPICZA-loxp/Cre-SpyCatcher-AOX1，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)TOP10，用LBL平板篩選和菌落PCR鑒定，并送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，將正確的菌株保存。

1.3.2 共表達(dá)SpyTag-DAS1和Spycathe-AOX1畢赤酵母細(xì)胞的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pPIC9K-SpyTag-DAS1用BglII 酶線性化后，電轉(zhuǎn)GS115感受態(tài)，利用MD平板篩選。挑選菌落進(jìn)行反復(fù)凍融法破壁，進(jìn)行菌落PCR鑒定整合情況，獲得GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1菌株。將重組質(zhì)粒pPICZA-loxp/Cre-SpyCatcher-AOX1用限制性內(nèi)切酶MssI進(jìn)行單酶切線性化后，電轉(zhuǎn)GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1感受態(tài)，利用YPDZ平板篩選。挑選菌落進(jìn)行反復(fù)凍融法破壁，進(jìn)行菌落PCR鑒定整合情況，將正確的菌株接種至含1%甲醇的酵母提取物甲醇蛋白胨YPM液體培養(yǎng)基中，對(duì)菌株中的Cre重組酶進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)48 h后，取50 μL菌液分別涂布于YPDZ平板和YPD平板中，30 ℃培養(yǎng)72 h觀察結(jié)果。若菌株只在YPD的平板上生長(zhǎng)，同時(shí)在YPDZ平板上不生長(zhǎng)，說明目的菌株的博來(lái)霉素抗性基因被Cre重組酶成功切除。將敲除博來(lái)霉素抗性的菌株GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1-SpyCatcher-AOX1保存。

1.3.3 EGFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)化重組畢赤酵母宿主

將重組質(zhì)粒pPICZαA-EGFP用限制性內(nèi)切酶KpnII進(jìn)行單酶切線性化，將線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1-SpyCatcher-AOX1感受態(tài)，利用YPDZ平板篩選，在平板上挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化，進(jìn)行破壁，提取菌株的基因組用引物EGFP- 1和EFGP- 2進(jìn)行菌落PCR鑒定，篩選得到菌株GS115/ △AOX1-SpyTag-DAS1-SpyCatcher-AOX1- EGFP，命名為TDCA-EGFP。

1.4 重組酵母的搖瓶培養(yǎng)、EGFP產(chǎn)量測(cè)定及甲醇耐受分析

菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約18 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期?？刂破鹗技?xì)胞D(600)=1，分別接種至以2%甲醇為碳源的BMMY培養(yǎng)基，在250 mL的三角瓶中，裝液量為25 mL，培養(yǎng)溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速250 r/min的條件下培養(yǎng)。每隔24 h測(cè)定細(xì)胞D(600)值，并補(bǔ)充相應(yīng)體積的甲醇。繪制測(cè)定的生長(zhǎng)曲線，分析菌株的生長(zhǎng)情況；每隔24 h發(fā)酵液取樣，樣品于8 000 r/min離心5 min，取上清，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)EGFP熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)505 nm)。取發(fā)酵上清液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE分析，并測(cè)定上清蛋白濃度。將重組菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min培養(yǎng)約48 h。測(cè)定D(600)，用YPM液體培養(yǎng)基將菌體分別稀釋至D(600)值為1.00、0.50、0.10和0.01的4組樣品，將樣品菌液在甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為3%、4%、5%的YPM固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行點(diǎn)樣，30 ℃培養(yǎng)40 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 YN-SpyTag/YC-SpyCatcher在畢赤酵母細(xì)胞中的構(gòu)建

將質(zhì)粒pPICZαA-YN-SpyTag經(jīng)MssI 酶線性化后，電轉(zhuǎn)GS115感受態(tài)，利用YPDZ平板篩選，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR鑒定整合情況，獲得重組菌株GS115-YN-SpyTag(見圖1(a))。將質(zhì)粒pPIC9K-YC-SpyCatcher經(jīng)MssI酶線性化后，電轉(zhuǎn)GS115-YN-SpyTag感受態(tài)，利用MD平板篩選，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定轉(zhuǎn)化子整合情況，獲得菌株GS115-YN-SpyTag-YC-SpyCatcher(NTCC)(見圖1(b))。

(a)重組菌株GS115-YN-SpyTag

(b)重組菌株NTCC泳道M—DNA marker DL5000；泳道1—GS115-YN-SpyTag；泳道2—pPICZαA-YN-SpyTag；泳道3—GS115-YN-SpyTag-YC-SpyCatcher；泳道4—pPIC9K-YC-SpyCatcher圖1 重組酵母的菌落PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Colony PCR results of recombinant strains

2.2 SpyTag和SpyCatcher胞內(nèi)自組裝驗(yàn)證-BiFC

BiFC是通過將熒光蛋白分割成為不發(fā)光的兩個(gè)片段，分別與目的蛋白融合表達(dá)，當(dāng)目的蛋白發(fā)生相互作用時(shí)，熒光互補(bǔ)蛋白片段相互靠近從而恢復(fù)熒光活性，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用的可視化[29- 31]。本研究將黃色熒光蛋白YFP從Ala154位拆分為YFP的C端(YC)和N端(YN)[32- 33]，分別與SpyCatcher(SC)和SpyTag(ST)融合表達(dá)用于組裝驗(yàn)證。為保證蛋白的正確折疊和功能發(fā)揮，使用柔性連接肽(GGGGS)2連接蛋白以實(shí)現(xiàn)融合表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單表達(dá)YC-SpyCatcher、YN-SpyTag的菌株與共表達(dá)YN和YC的菌株都未表現(xiàn)出熒光，表明單獨(dú)的YFP的C端VN和YFP的C端VC以及共表達(dá)的VN都不產(chǎn)生熒光信號(hào)(圖2(a)和2(b))。在重組菌株NTCC中檢測(cè)到黃色熒光(圖2(c))，表明SpyCatcher和SpyTag在細(xì)胞質(zhì)中相互作用，使得YC和YN相互靠近而產(chǎn)生熒光信號(hào)，證明SpyTag/SpyCatcher體系在畢赤酵母胞內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)自組裝。

2.3 SpyTag-DAS1與SpyCatcher-AOX1胞內(nèi)組裝驗(yàn)證細(xì)胞的構(gòu)建

AOX是相對(duì)分子質(zhì)量為600 ku的同源八聚體[34]，畢赤酵母中編碼甲醇氧化酶的基因有兩個(gè)，AOX1與AOX2。AOX1是畢赤酵母的主要醇氧化酶，AOX2的酶活很弱且表達(dá)量低，AOX1含量占AOX蛋白總含量的90%[35]。畢赤酵母的AOX單體靶向過氧化酶體中完成寡聚化[15]。DAS為同源二聚體，相對(duì)分子質(zhì)量約為155 ku，在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行寡聚化，再靶向過氧化酶體[11]。本研究以AOX1天然同源八聚體結(jié)構(gòu)作為組裝骨架，采用SpyTag/SpyCatcher體系對(duì)AOX1和DAS1進(jìn)行組裝，構(gòu)建超分子酶復(fù)合物(見圖3(a))。

(a)GS115-YC-SpyCatcher-SpyTag

(b)GS115-YN-SpyTag-SpyCatcher

(c)GS115-YN-SpyTag-YC-SpyCatcher圖2 共表達(dá)SpyTag/SpyCatcher重組Pichia pastoris的BiFC分析Fig.2 BiFC analysis of recombinant Pichia pastoris expressing SpyTag/SpyCatcher

(a)AOX和DAS自組裝體系示意圖

(b)重組菌株GS115-YN-SpyTag的菌落PCR鑒定 (c)重組菌株YNDCA的菌落PCR鑒定泳道1—pPICZαA-YN-SpyTag-DAS1；泳道2—GS115-YN-SpyTag-DAS1；泳道3—pPIC9K-YC-SpyCatcher-AOX1；泳道4：YNDCA圖3 Pichia pastoris中SpyTag-DAS1與SpyCatcher-AOX1胞內(nèi)組裝驗(yàn)證細(xì)胞的構(gòu)建Fig.3 Construction of the self-assembly of SpyCatcher-AOX and SpyTag-DAS1 in Pichia pastoris

將重組質(zhì)粒pPICZαA-YN-SpyTag-DAS1線性化后電轉(zhuǎn)入GS115感受態(tài)，利用YPDZ平板篩選，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR鑒定整合情況獲得GS115-YN-SpyTag-DAS1菌株(見圖3(b))。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pPIC9K-YC-SpyCatcher-AOX1線性化后電轉(zhuǎn)GS115-YN-SpyTag-DAS1感受態(tài)，利用MD平板篩選和PCR鑒定整合情況獲得GS115-YN-SpyTag-DAS1-YC-SpyCatcher-AOX1(YNDCA)菌株(見圖3(c))。

2.4 SpyTag-DAS1與SpyCatcher-AOX1在胞內(nèi)組裝的驗(yàn)證

本研究將YC和YN分別與SpyCatcher-AOX1與SpyTag-DAS1進(jìn)行融合表達(dá)，采用BiFC驗(yàn)證畢赤酵母中SpyCatcher-AOX1與SpyTag-DAS1的自組裝。在重組菌株GS115-YN-SpyTag-DAS1-YC-SpyCatcher-AOX1(YNDCA)中檢測(cè)到黃色熒光信號(hào)(見圖4)，表明SpyTag-DAS1/SpyCatcher-AOX1體系在YTDCA酵母胞內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)自組裝形成AOX1和DAS1雙酶復(fù)合體，進(jìn)而使互補(bǔ)熒光分子能夠恢復(fù)黃色熒光活性，且熒光在菌體內(nèi)主要顯示為團(tuán)狀聚集形態(tài)，胞質(zhì)內(nèi)分散少量熒光。AOX和DAS具有特殊的定位信號(hào)肽(PTS)序列[16]，靶向過氧化酶體，推測(cè)熒光定位顯示為雙酶復(fù)合物，主要位于過氧化酶體，胞質(zhì)存在的少量熒光可能為未靶向過氧化酶體的AOX1單體和DAS1復(fù)合物，但AOX必須進(jìn)入過氧化酶體才能組裝成為活性蛋白，推測(cè)利用SpyTag/SpyCatcher體系的雙酶組裝可能對(duì)AOX單體的靶向作用產(chǎn)生一定影響。

2.5 表達(dá)EGFP的SpyTag-DAS1與SpyCatcher-AOX1胞內(nèi)自組裝細(xì)胞的構(gòu)建

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pPIC9K-SpyTag-DAS1線性化后電轉(zhuǎn)入GS115感受態(tài)，在MD板上篩選，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌落的基因組進(jìn)行PCR鑒定，獲得GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1菌株(見圖5(a))。將重組質(zhì)粒pPICZA-loxp/Cre-SpyCatcher-AOX1用限制性內(nèi)切酶MssⅠ進(jìn)行單酶切線性化后，電轉(zhuǎn)GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1感受態(tài)，利用YPDZ平板篩選提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR鑒定(見圖5(b))，將正確的菌株接種至YPM液體培養(yǎng)基中進(jìn)行Zeocin抗性切除，獲得敲除Zeocin抗性的GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1-SpyCatcher-AOX1(TDCA)菌株。將重組質(zhì)粒pPICZαA-EGFP在限制性內(nèi)切酶作用下進(jìn)行單酶切線性化，再電轉(zhuǎn)入GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1-SpyCatcher-AOX1感受態(tài)，利用YPDZ平板篩選，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR鑒定整合情況，最終得到菌株GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1-SpyCatcher-AOX1-EGFP(TDCA-EGFP)(見圖5(c))。

2.6 雙酶組裝重組菌株在搖瓶中的生長(zhǎng)情況和EGFP產(chǎn)量分析

為在AOX與DAS之間構(gòu)建底物通道，減少甲醛的擴(kuò)散和積累，本研究將畢赤酵母基因組中的AOX1基因敲除，替換為SpyCatcher-AOX1的基因，再在該菌株中引入SpyTag-DAS1獲得表達(dá)雙酶組裝的重組菌株TDCA，引入綠色熒光蛋白EGFP作為報(bào)告蛋白，以分析細(xì)胞利用甲醇進(jìn)行生長(zhǎng)和蛋白合成的情況。在2%甲醇培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵72 h后，對(duì)分泌表達(dá)EGFP蛋白的重組菌株發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，TDCA-EGFP菌株(支架組裝菌株)的發(fā)酵上清液的EFGP(28.8 ku)條帶清晰，且無(wú)其他雜條帶，EGFP產(chǎn)量為1.52 mg/mL。而GS115-EGFP和未組裝菌株GS115-pPIC9K-DAS1-pPICZα-EGFP(無(wú)支架組裝菌株)的發(fā)酵上清液中存在雜條帶，表明存在其他雜蛋白(見圖6)。

(a)熒光場(chǎng)

(b)明場(chǎng)

(c)熒光場(chǎng)與明場(chǎng)疊加圖4 重組菌株胞內(nèi)YN-SpyTag-DAS1與YC-SpyCatcher-AOX1自組裝的BiFC分析Fig.4 BiFC analysis of the self-assembly of YN-SpyTag-DAS1 and YC-SpyCatcher-AOX1 in the recombinant strain

(a)GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1

(b)GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1-SpyCatcher-AOX1

(c)GS115/AOX1-SpyTag-DAS1-SpyCatcher-AOX1-EGFP泳道1—GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1；泳道3—GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1-loxp/Cre-SpyCatcher-AOX1；泳道4—pPICZA-loxp/Cre-SpyCatcher-AOX1；泳道5-6—GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1-SpyCatcher-AOX1-EGFP圖5 重組菌株的菌落PCR鑒定結(jié)果Fig.5 Colony PCR identification results of recombinant strains

在2%甲醇培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h后，相比菌株GS115-EGFP，表達(dá)雙酶組裝的重組菌株TDCA-EGFP生物量提高了2.3倍。重組菌株TDCA-EGFP的EFGP產(chǎn)量是原始菌株的18.2倍，相比未組裝菌株提高了31.5%。單位D(600)細(xì)胞表達(dá)的EGFP熒光強(qiáng)度相比原始菌株提高了4.51倍，是未組裝菌株的2.76倍(見圖7)。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，表達(dá)外源蛋白EGFP的畢赤酵母的生長(zhǎng)幾乎停滯，EGFP表達(dá)量較低，可能是因?yàn)榧?xì)胞受甲醇毒性影響，生長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞甲醇利用率降低。而表達(dá)SpyCatcher-AOX1與SpyTag-DAS1雙酶組裝體系的重組畢赤酵母菌株的菌體生長(zhǎng)雖然減緩，但其利用甲醇生產(chǎn)重組蛋白的能力明顯增強(qiáng)，顯示雙酶復(fù)合體能夠有效地促進(jìn)細(xì)胞利用甲醇進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化最終合成重組蛋白。

泳道1—GS115-EGFP；泳道2—GS115-pPIC9K-DAS1-pPICZα-EGFP；泳道3—TDCA-EGFP圖6 TDCA-EGFP菌株分泌表達(dá)EGFP的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of recombinant strains TDCA-EGFP

將表達(dá)雙酶組裝的重組菌株TDCA-EGFP在甲醇濃度為3%、4%、5%的YPM固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行點(diǎn)樣以分析菌株甲醇耐受性。相比原始菌株GS115-pPICZα-EGFP，在3%～5%的甲醇培養(yǎng)基中，表達(dá)雙酶組裝和未組裝的重組菌株耐受性明顯提高，可以在含5%甲醇的YPM固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(見圖8(c))。畢赤酵母在高濃度甲醇培養(yǎng)基(>5 %)上表現(xiàn)出生長(zhǎng)受損[36]，因?yàn)榧?xì)胞代謝甲醇產(chǎn)生的甲醛會(huì)迅速積累，甲醛的細(xì)胞毒性會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。過表達(dá)DAS1有利于增強(qiáng)畢赤酵母甲醇耐受性。根據(jù)菌株甲醇耐受性分析結(jié)果，表達(dá)雙酶組裝的重組畢赤酵母中的過表達(dá)SpyTag-DAS1是對(duì)DAS1進(jìn)行過表達(dá)，提高了細(xì)胞代謝甲醛的能力，減小了甲醛積累的毒性，從而提高了甲醇耐受性，使得細(xì)胞能夠在含5%甲醇的YPM固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，推測(cè)AOX與DAS的組裝對(duì)細(xì)胞甲醇耐受沒有明顯的影響。

相比原始菌株和未組裝菌株，TDCA-EGFP菌株的生長(zhǎng)和蛋白合成狀態(tài)良好，利用甲醇生物轉(zhuǎn)化合成外源蛋白的能力增強(qiáng)，證明同化利用甲醇合成目的蛋白的通量提高。結(jié)合耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，相比未組裝菌株，TDCA-EGFP菌株在以甲醇為碳源的搖瓶培養(yǎng)過程中的生物量偏低；原因并非是菌株甲醇耐受性差，推測(cè)可能原因有兩種：一為融合表達(dá)支架蛋白SpyTag和SpyCatcher的DAS1和AOX1的表達(dá)量和酶活有所下降，導(dǎo)致細(xì)胞甲醇代謝受限；二為雙酶組裝引起的同化途徑的增強(qiáng)，可能會(huì)導(dǎo)致異化途徑的減弱，NADH和ATP供量減少，影響細(xì)胞能量平衡[14]，進(jìn)而影響細(xì)胞的菌體生長(zhǎng)。

(a)生長(zhǎng)曲線

(b)EGFP產(chǎn)量

(c)單位D(600)細(xì)胞表達(dá)的EGFP的熒光強(qiáng)度無(wú)支架組裝菌株：GS115-pPIC9K-DAS1-pPICZα-EGFP；支架組裝菌株：GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1-SpyCatcher-AOX1-pPICZα-EGFP圖7 TDCA-EGFP菌株在2%甲醇濃度培養(yǎng)基中EGFP產(chǎn)量及生長(zhǎng)曲線Fig.7 EGFP production and growth curves of TDCA-EGFP in 2% methanol concentration medium

(a)3%甲醇的YPM

(b)4%甲醇的YPM

(c)5%甲醇的YPM無(wú)支架組裝菌株：GS115-pPIC9K-DAS1-pPICZα-EGFP；支架組裝菌株：GS115/△AOX1-SpyTag-DAS1-SpyCatcher-AOX1-pPICZα-EGFP圖8 重組菌株甲醇耐受分析Fig.8 Methanol tolerance analysis of recombinant strains

3 結(jié)論

本研究分析畢赤酵母利用甲醇合成目的蛋白的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)問題，設(shè)計(jì)利用蛋白質(zhì)支架SpyCatcher和SpyTag的相互作用組裝甲醇代謝途徑的關(guān)鍵酶AOX和DAS構(gòu)建雙酶復(fù)合物，在酶與酶之間構(gòu)建底物通道，減小毒性中間代謝物甲醛的積累和擴(kuò)散，增大畢赤酵母利用甲醇的同化途徑通量，以提高細(xì)胞生成目的產(chǎn)物的能力。本研究中，驗(yàn)證了SpyTag/SpyCatcher體系和BiFC在畢赤酵母胞內(nèi)的可行性，通過在AOX和DAS之間的底物通道，減少甲醛擴(kuò)散和積累，提高畢赤酵母甲醇代謝途徑同化效率，增強(qiáng)了酵母細(xì)胞利用甲醇生產(chǎn)目的蛋白的能力，提高了目的蛋白產(chǎn)量，證明在畢赤酵母中通過調(diào)控關(guān)鍵酶之間的空間狀態(tài)實(shí)現(xiàn)提高底物代謝方向和通量的可能性，為解決畢赤酵母甲醛毒性積累，提高甲醇利用效率，構(gòu)建高效利用甲醇的畢赤酵母人工細(xì)胞提供了一種新方向。