陳 乾，沈 樂，楊 靜，張建銀，耑 冰，趙 霞，李丹丹，董 輝

近年來，隨著超聲心動(dòng)圖的普及，肺動(dòng)脈高壓已成為呼吸內(nèi)科的常見臨床癥狀。而慢性阻塞性肺疾病(COPD)被認(rèn)為是發(fā)生肺動(dòng)脈高壓的重要原因之一。在COPD形成肺動(dòng)脈高壓的病理過程中，缺氧是形成肺動(dòng)脈高壓的中心環(huán)節(jié)[1]。本研究利用前期培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(hPASMCs)，建立缺氧模型，進(jìn)而觀察缺氧對(duì)hPASMCs細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)及細(xì)胞色素C(Cyt-C)的影響，為進(jìn)一步尋找干預(yù)COPD相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥品:人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(2018年購自上海武光生物科技有限公司，于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院科研中心實(shí)驗(yàn)室復(fù)蘇)、胰蛋白酶、胎牛血清、CCK-8試劑盒(上海李記生物)、DCFH-DA分子試劑(上海翊圣生物)、Trizol試劑(南京凱基)、ROS檢測(cè)試劑盒(上海翊圣生物)、全蛋白提取試劑盒(南京凱基)、蛋白含量檢測(cè)試劑盒(南京凱基)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物)、人抗鼠細(xì)胞色素C一抗(北京博奧森)、鼠抗兔二抗(北京博奧森)。

1.2 主要儀器設(shè)備:標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱、4 ℃低溫離心機(jī)、PCR儀(BIO-RAD MyCycler)、凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD公司)、熒光定量PCR儀(美國羅氏公司)、酶標(biāo)儀(Bio-Tek ELx800)、濕電轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD)、激光共聚焦顯微鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組:將前述購買的hPASMCs以慢性缺氧條件培養(yǎng)的hPASMCs為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。分組：根據(jù)hPASMCs的培養(yǎng)條件不同，分為常氧組(即空白對(duì)照組)和缺氧組；其中常氧組hPASMCs的培養(yǎng)條件為：hPASMCs在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱(37 ℃，21%O2，5%CO2)中培養(yǎng)；缺氧組培養(yǎng)條件為：hPASMCs在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱(37℃，1% O2，5% CO2，94% N2)中培養(yǎng)。

1.4 2組細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞增殖的檢測(cè):分別將以上2組hPASMCs，以1×104/mL細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)于25 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后再同步培養(yǎng)24 h，以每組1×104/mL的細(xì)胞數(shù)分別培養(yǎng)于5 mL培養(yǎng)皿中，按照前述條件，2組hPASMCs分別在常氧及缺氧條件下培養(yǎng)72 h，分別在培養(yǎng)開始計(jì)時(shí)后的1、24、48及72 h使用CCK-8試劑盒分別檢測(cè)2組hPASMCs的增殖情況。

1.5 2組hPASMCs內(nèi)ROS水平檢測(cè):在1.4步驟中所確定的時(shí)間點(diǎn)，分別取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的2組hPASMCs，經(jīng)離心(500 g，5 min)后收集單細(xì)胞懸液，PBS沖洗，棄上清，PBS重懸后，在樣品中加入10μM DCFH-DA，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，熒光顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，激發(fā)光波長(zhǎng)495 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)515 nm。

1.6 Westernblot檢測(cè)Cyt-C表達(dá)水平:在1.4中所確定的時(shí)間點(diǎn)分別獲取2組hPASMCs，裂解細(xì)胞，制備細(xì)胞勻漿后，使用全蛋白提取試劑盒提取勻漿中全蛋白，行BCA蛋白定量，取樣，經(jīng)過上樣(上樣量40 μg)、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、滴加抗人鼠細(xì)胞色素C一抗(一抗稀釋度1∶3 000，4 ℃)搖晃12 h，PBST轉(zhuǎn)膜15 min，3次，滴加生物素標(biāo)記二抗，4 ℃搖晃3 h，PBST洗膜后行ECL發(fā)光，膠片曝光，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析，分別測(cè)定2組hPASMCs內(nèi)Cyt-C蛋白條帶光密度值及β-actin條帶光密度值，以Cyt-C條帶光密度值及β-actin條帶光密度值作為Cyt-C表達(dá)的相對(duì)值。

2 結(jié)果

2.1 缺氧對(duì)2組hPASMCs增殖的影響：2組hPASMCs在1、24、48及72 h的培養(yǎng)過程中，其細(xì)胞增殖水平OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；缺氧組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖水平相比，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；提示隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，缺氧組hPASMCs增殖水平亦明顯升高，見表1。

表1 2組hPASMCs不同時(shí)點(diǎn)增殖及細(xì)胞內(nèi)ROS水平

2.2 2組hPASMCs內(nèi)ROS水平比較:2組hPASMCs在1、24、48及72 h的培養(yǎng)過程中，其細(xì)胞內(nèi)ROS熒光OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；缺氧組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)ROS熒光OD值相比，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。提示隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，缺氧組hPASMCs內(nèi)ROS水平逐步升高，而常氧組內(nèi)ROS水平無明顯變化，見圖1(封三)。

2.3 2組hPASMCs內(nèi)Cyt-C的表達(dá) 2組hPASMCs在1、24、48及72 h的培養(yǎng)過程中，其內(nèi)細(xì)胞色素C的表達(dá)相對(duì)值分別為：缺氧組(0.516±0.029、0.673±0.060、0.981±0.135和1.180±0.131)、常氧組(0.509±0.063、0.488±0.023、0.534±0.016和0.512±0.033)，2組hPASMCs內(nèi)Cyt-C的表達(dá)相對(duì)值差異有顯著性(P<0.05)；缺氧組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)Cyt-C的表達(dá)水平相比，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，缺氧組hPASMCs內(nèi)Cyt-C水平逐步升高，見圖2(封三)。

3 討論

目前，COPD相關(guān)肺動(dòng)脈高壓危害巨大。中外學(xué)者研究均表明[2-3]，COPD合并肺動(dòng)脈壓力超過40 mmHg的患者，其3年生存率將低至33%，故積極尋找干預(yù)肺動(dòng)脈高壓形成的作用靶點(diǎn)非常必要。在肺動(dòng)脈高壓形成的病理過程中，缺氧被認(rèn)為是肺動(dòng)脈高壓形成的中心環(huán)節(jié)[1]。而缺氧導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的形成機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞因子分泌失衡、鈣離子通道功能障礙、信號(hào)通路異常激活等多個(gè)環(huán)節(jié)[4]，故目前相關(guān)機(jī)制不是非常明確,仍需進(jìn)一步研究。

眾所周知，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞的增殖和凋亡是同時(shí)存在的。只有細(xì)胞增殖水平大于細(xì)胞凋亡，培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)目才可能增加，反之細(xì)胞將減少。本課題組分別在常氧條件和缺氧條件下對(duì)hPASMCs進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下的hPASMCs可出現(xiàn)明顯增殖，這個(gè)結(jié)果同國內(nèi)張昱等人[5]的研究類似。張昱等人發(fā)現(xiàn)，大鼠肺動(dòng)脈平滑肌在缺氧條件下可出現(xiàn)明顯增殖，這種增殖的基礎(chǔ)系肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖增加，同時(shí)伴有凋亡減少，從而肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)為數(shù)量的絕對(duì)增加；另外，hPASMCs數(shù)量的增加也成為肺動(dòng)脈血管重構(gòu)，并最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓形成的細(xì)胞基礎(chǔ)[6]。

ROS是由細(xì)胞線粒體內(nèi)電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅲ產(chǎn)生的一種高能小分子。Archer SL研究發(fā)現(xiàn)[6]，低氧條件下，線粒體釋放大量ROS至細(xì)胞質(zhì)，從而激活一系列轉(zhuǎn)錄和翻譯的后適應(yīng)反應(yīng)。而本研究的結(jié)果與Archer SL的研究類似，在缺氧條件下培養(yǎng)的hPASMCs，其內(nèi)ROS隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而增加，而在常氧條件下培養(yǎng)的hPASMCs，其內(nèi)ROS水平基本無變化。這不僅提示了缺氧可導(dǎo)致hPASMCs內(nèi)大量ROS的產(chǎn)生，也反映了hPASMCs內(nèi)線粒體膜通透性的損傷；本研究結(jié)果也表明缺氧72 h后，hPASMCs內(nèi)ROS熒光水平顯著升高。

細(xì)胞凋亡是健康生物體通過消除不良和(或)多余細(xì)胞的重要方式，而線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑就是觸發(fā)細(xì)胞凋亡的重要方式之一[7]。研究發(fā)現(xiàn)[7-10]，在線粒體途徑中，當(dāng)ROS大量形成并損傷線粒體膜以后，Cyt-C從線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔漏出，參與形成凋亡復(fù)合多聚體復(fù)合物，并同Bcl-2家族蛋白一起進(jìn)一步觸發(fā)Caspase8/9激活，并啟動(dòng)Caspase3/7，并最終啟動(dòng)凋亡程序。而在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢(shì)，即隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，ROS水平升高，線粒體膜損傷，通透性升高，Cyt-C進(jìn)入細(xì)胞漿增多，從而出現(xiàn)了Cyt-C表達(dá)水平隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增多的現(xiàn)象。

綜上所述，我們推斷缺氧可導(dǎo)致hPASMCs內(nèi)線粒體ROS生成增加，從而損傷線粒體膜，線粒體膜通透性增加，Cyt-C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)致hPASMCs的凋亡不斷增加，進(jìn)而使得hPASMCs的增殖/凋亡水平比值逆轉(zhuǎn)，hPASMCs將出現(xiàn)先增多后減少的趨勢(shì)，從而出現(xiàn)了肺動(dòng)脈血管的重構(gòu)，并最終導(dǎo)致了肺動(dòng)脈高壓的形成。故細(xì)胞內(nèi)ROS水平及Cyt-C水平均可成為阻止肺動(dòng)脈高壓形成的潛在靶點(diǎn)。雖然如此，缺氧對(duì)線粒體內(nèi)ROS及Cyt-C影響的詳細(xì)機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。