姜宜妮 梁健 劉江源 伍慶華 閔建新

摘要 目的：探討二至丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型鼠的作用機(jī)制。方法：將108只雌性SD鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組、模型（PMOP）組、雌激素治療（E2）組、二至丸低劑量治療（EZW-L）組、二至丸中劑量治療（EZW-M）組、二至丸高劑量治療（EZW-H）組，每組18只。E2組接受E2針劑皮下注射，EZW-L組、EZW-M組、EZW-H組分別予以6 g/kg、9 g/kg、12 g/kg混懸液灌胃，Sham組與PMOP組均予以1 mL生理鹽水灌胃，均干預(yù)12周。檢測(cè)各組大鼠右側(cè)股骨頭骨密度（BMD）、股骨生物力學(xué)/病理變化以及骨代謝血清標(biāo)志物BALP、TRACP-5b、Cath-K、OPG、RANK、RANKL的水平變化。結(jié)果：藥物干預(yù)12周后，與PMOP組比較，EZW-M組、E2組、EZW-H組的BMD、彈性模量、最大載荷、BV/TV、Tb.Th、Joint、血清骨代謝標(biāo)志物BALP、TRACP-5b、Cath-K的蛋白表達(dá)均顯著增高（均P<0.05），F(xiàn)LAW顯著降低（P<0.05）;HE染色顯示PMOP組骨組織出現(xiàn)明顯病理改變，E2組和EZW-H組疏松病理現(xiàn)象改善明顯。POMP組、EZW-L組、EZW-M組股骨中OPG蛋白含量較Sham組、E2組、EZW-H組明顯下降;RANK、RANKL蛋白含量升高。與PMOP組比較，EZW-M組的OPG/RANKL比值顯著增高（P<0.05），RANK/RANKL比值顯著降低（P<0.05），E2組、EZW-H組的OPG/RANKL比值顯著增高（P<0.01），E2組、EZW-H組的RANK/RANKL比值顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：二至丸可改善骨質(zhì)疏松，其作用機(jī)制可能是OPG骨保護(hù)素重組蛋白/核因子κB受體激活物配體/RANKL信號(hào)軸抑制破骨細(xì)胞成熟分化實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞 骨質(zhì)疏松;絕經(jīng)后;二至丸;生物力學(xué);病理改變;機(jī)制;骨保護(hù)素重組蛋白;核因子κB受體激活物配體

Abstract Objective：To explore the mechanism of Erzhi Pills in the treatment of postmenopausal osteoporosis model rats.Methods：A total of 108 female SD rats were randomly divided into a sham operation（Sham） group，a model（PMOP） group，an estrogen treatment group（E2），an Erzhi Pill low dose treatment group（EZW-L），an Erzhi Pill medium dose treatment group（EZW-M） and an Erzhi Pill high dose treatment group（EZW-H），with 18 rats in each group.Group E2 received subcutaneous injection of E2.Group EZW-L，group EZW-M and group EZW-H were given intragastric administration of 6g/kg，9g/kg and 12 g/kg suspension respectively.group Sham and group PMOP were given intragastric administration of 1ml normal saline for 12 weeks.The bone mineral density（BMD） of right femoral head，biomechanical/pathological changes of femur and the levels of serum markers of bone metabolism，such as BALP，TRACP-5b，Cath-K，OPG，RANK and RANKL，were measured in each group.Results：After 12 weeks of drug intervention，the protein expressions of BMD，elastic modulus，maximum load，BV/TV，Tb.Th，Joint，serum bone metabolic markers BALP，TRACP-5b and BCath-K in EZW-M group，E2 group and EZW-H group were significantly higher than those in EZW-H group（Ps<0.05），and FLAW significantly lower（P<0.05）.HE staining showed that there were obvious pathological changes in bone tissue in PMOP group，and the above-mentioned loose pathological phenomena were significantly improved in E2 group and EZW-H group.The content of OPG protein in femur of POMP group，EZW-L group and EZW-M group was significantly lower than that of Sham group，E2 group and EZW-H group，while the content of RANK and RANKL protein was increased.Comparing with PMOP group，OPG/RANKL ratio in EZW-M group was significantly higher（P<0.05）; RANK/RANKL ratio was significantly lower（P<0.05）; OPG/RANKL ratio in E2 group and EZW-H group was significantly higher（P<0.01）; and RANK/RANKL ratio in E2 group and EZW-H group was significantly lower（P<0.01）.Conclusion：Erzhi Pill can improve osteoporosis，and its mechanism may be related to the inhibition of osteoclast maturation and differentiation by OPG/RANK/RANKL signal axis.

Keywords Osteoporosis; Postmenopausal; Erzhi Pill; Biomechanics; Pathological changes; Mechanism; OPG; RANKL

中圖分類(lèi)號(hào)：R289.5;R274.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.016

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（Postmenopausal Osteoporosis，PMOP）是指絕經(jīng)后女性的卵巢功能衰退、內(nèi)分泌失調(diào)、雌激素水平下降，導(dǎo)致成骨細(xì)胞的骨形成低于破骨細(xì)胞的骨吸收，造成骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，骨小梁排列紊亂，使得骨密度下降、骨脆性增加，易于發(fā)生骨折，嚴(yán)重影響中老年女性的生命質(zhì)量[1]。目前研究認(rèn)為，骨保護(hù)素重組蛋白（Osteoprotegerin，OPG）/核因子κB受體激活物配體（NF-κB Receptor Activator Ligand，RANKL）信號(hào)軸是參與調(diào)節(jié)骨吸收與骨生成平衡的重要途徑，其在雌激素治療PMOP中起著舉足輕重的作用[2]，然而雌激素的不良反應(yīng)令人擔(dān)憂(yōu)[3-4]，因此尋找一種安全有效的防治方法迫在眉睫。PMOP屬中醫(yī)學(xué)中“骨痿”“骨枯”等的范疇，主要病因病機(jī)為腎精虧虛、骨髓生化乏源。補(bǔ)腎陰經(jīng)典方二至丸（女貞子、墨旱蓮）具有滋腎陰、益精血之效，可抑制骨量減少、改善骨微結(jié)構(gòu)的改變，增強(qiáng)骨強(qiáng)度和生物力學(xué)強(qiáng)度[5-6]，不僅能夠預(yù)防PMOP的發(fā)生發(fā)展，而且能夠改善PMOP臨床癥狀[7-8]，但機(jī)制未明。為此，本研究建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型，觀察二至丸對(duì)骨代謝的影響與OPG/RANKL信號(hào)軸的相關(guān)性，探討二至丸改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選用SPF級(jí)20周齡SD雌性大鼠，體質(zhì)量（320±20）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)碼：SCXX（滬）2007-0005]提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行[許可證號(hào)為：SYXK（閩）2005-004]。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（25±2）℃，濕度（50±1）%，晝夜12 h/12 h交替。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)大鼠可自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物管理制度和使用委員會(huì)批準(zhǔn)而進(jìn)行，并嚴(yán)格按照科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》中的動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)處理動(dòng)物。

1.1.2 藥物 二至丸（500粒/瓶，雷允上藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z32020882）。懸濁液制備：以成人臨床用藥劑量按照人和動(dòng)物等效劑量換算公式計(jì)算動(dòng)物用藥劑量，用0.9%生理鹽水將二至丸配制成90 mg/mL的混懸液，4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑與儀器 雌二醇（E2）針劑（100 μg/支，武漢峰耀同輝化學(xué)制品有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z38922），戊巴比妥鈉（廣州沛瑜生物制品有限公司，批號(hào)：2930-2），OPG一抗抗體（貨號(hào)：68495S）、RANK一抗抗體（貨號(hào)：4816S）、RANKL一抗抗體（貨號(hào)：5312SC）、β-actin一抗抗體（貨號(hào)：4870t）均購(gòu)于美國(guó)CST公司，BALP ELISA試劑盒（上?？祈樕锕こ逃邢薰?，貨號(hào)：KS15752）、TRACP-5b ELISA試劑盒（南京森貝伽生物工程有限公司，貨號(hào)：SBJ-R0426）、Cath-KELISA試劑盒（上海江萊生物工程有限公司，貨號(hào)：JL11782）;雙能X線BMD儀（奧斯托公司，韓國(guó)，型號(hào)：EXA-3000），轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)：1704150），臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（BECKMAN公司，美國(guó)，型號(hào)：X22），酶標(biāo)自動(dòng)分析儀（biotek公司，美國(guó)，型號(hào)：ELx800），精密電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)（大邁儀器有限公司，型號(hào)：AG-IS），微計(jì)算機(jī)斷層掃描設(shè)備（Micro-CT，BRUKER microCT公司，美國(guó)，型號(hào)：SKY SCAN-1172）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將108只SD大鼠隨機(jī)分為2組：其中，18只假手術(shù)組，90只手術(shù)組。假手術(shù)組不切除卵巢，手術(shù)組進(jìn)行PMOP造模。PMOP模型的制備：手術(shù)組大鼠用戊巴比妥鈉（10 g/L）按照3 mg/kg劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后分別從雙側(cè)背部切開(kāi)進(jìn)入腹腔，依次摘除雙側(cè)卵巢，止血縫合切口。75%乙醇消毒切口，注射用慶大霉素液涂擦術(shù)口防治感染，連續(xù)3 d。Sham組大鼠不切除卵巢，而是切除附在卵巢旁邊的一塊脂肪，大小與卵巢相仿，余過(guò)程同造模組。造模后7 d，再將手術(shù)組大鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為模型（PMOP）組、雌激素治療（E2）組、二至丸低劑量治療（EZW-L）組、二至丸中劑量治療（EZW-M）組、二至丸高劑量治療（EZW-H）組，每組18只。

1.2.2 給藥方法 Sham組：造模術(shù)后7 d，使用0.9%生理鹽水灌胃（1 mL/100 g），1次/d，連續(xù)12周，同時(shí)進(jìn)行正常的飲食以及活動(dòng)，不做治療處理。PMOP組：造模術(shù)后7 d，使用生理鹽水灌胃（1 mL/100 g），1次/d，連續(xù)12周，同時(shí)進(jìn)行正常的飲食以及活動(dòng)，不做治療處理。E2組：造模術(shù)后7 d，用E2針劑皮下注射（200 μg/kg），2次/周，治療12周，同時(shí)進(jìn)行正常的飲食以及活動(dòng)。EZW-L組：造模術(shù)后7 d，二至丸混懸液（6 g/1 kg）灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃12周，同時(shí)進(jìn)行正常的飲食以及活動(dòng)。EZW-M組：造模術(shù)后7 d，二至丸混懸液（9 g/1 kg）灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃12周，同時(shí)進(jìn)行正常的飲食以及活動(dòng)。EZW-H組：造模術(shù)后7 d，二至丸混懸液（12 g/1 kg）灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃12周，同時(shí)進(jìn)行正常的飲食以及活動(dòng)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1）骨密度檢測(cè)：分別取6組大鼠右側(cè)股骨，應(yīng)用DiscoveryWi雙能X線骨密度儀檢測(cè)右側(cè)股骨頭骨密度（Bone Mineral Density，BMD）。2）生物力學(xué)檢測(cè)：應(yīng)用三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)檢測(cè)股骨生物力學(xué)情況。采用AGS-J系列精密電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)檢測(cè)最大載荷和彈性模量。具體方法：將檢測(cè)完BMD的股骨頭凹面朝下，股骨頭端朝前的位置放置于跨距為17 mm的2個(gè)支撐點(diǎn)上，壓頭大概在股骨長(zhǎng)度中間位置的正上方給標(biāo)本施加向下10 mm/min的載荷，直至股骨斷裂，股骨斷裂前所能承受的最大力為最大載荷，股骨斷裂時(shí)所承受的力為斷裂載荷。3）組織學(xué)檢測(cè)：取6組大鼠右側(cè)股骨頭進(jìn)行常規(guī)固定、脫水、包埋、切片后，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。4）骨小梁檢測(cè)：采用micro CT對(duì)各組大鼠右側(cè)股骨進(jìn)行骨組織形態(tài)掃描，由股骨近心端骨骺線消失處開(kāi)始掃描，直至股骨遠(yuǎn)心端，掃描厚度10 μm，共掃描70層。應(yīng)用全自動(dòng)圖像數(shù)字化分析儀對(duì)所得圖片分析處理，記錄骨小梁骨體積分?jǐn)?shù)（Bone Volume/Tissue Volume，BV/TV）、骨小梁表面密積度（Trabecular Thickness，Tb.Th）、骨小梁平均間距（Trabecular Separation）、骨小梁數(shù)、成骨細(xì)胞指數(shù)（Osteoblast Index，OBI，個(gè)/mm）、礦化沉積率（MAR）、礦化延遲時(shí)間（MLT）、骨形成率（BFR）。5）骨代謝標(biāo)志物血清含量檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清中BALP、TRACP-5b、Cath-K含量，具體檢測(cè)方法按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。6）OPG/RANK/RANKL信號(hào)軸檢測(cè)：采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blotting）檢測(cè)骨組織中OPG、RANK、RANKL的蛋白含量。將各組大鼠充分麻醉后處死，于冰上快速取出右側(cè)股骨。200 mg大鼠股骨組織加入l mL PMSF，勻漿30 min，將樣本置于4 ℃，5 000 r/min，離心半徑10 cm條件下離心20 min，取上清液（總蛋白溶液）。檢測(cè)蛋白濃度（DAB方法），蛋白變性。以50 μg蛋白量為上樣標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算上樣量。電泳（12%分離膠，5%濃縮膠，60 V，40 mA，2.0 h），轉(zhuǎn)膜（120 V，250 mA，30～60 min），封閉（5%脫脂奶粉）2 h，分別加入OPG、RANK、RANKL和β-actin一抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，加入堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶2 000）室溫孵育2 h。上述每一過(guò)程均用TBS洗3次，5 min/次。加入顯色液15～30 min，計(jì)算機(jī)掃描圖像，采用Model Gel Doc 2000型生物圖像分析系統(tǒng)處理所得數(shù)據(jù)信息。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有結(jié)果均選擇3個(gè)或3個(gè)以上數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠骨密度比較 藥物干預(yù)12周后，與Sham組比較，PMOP組、EZW-L組、EZW-M組、EZW-H組股骨BMD極顯著降低（均P<0.01）;與Sham組比較，E2組股骨BMD顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，EZW-M組BMD增高（P<0.05），E2組、EZW-H組的BMD極顯著增高（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 6組大鼠彈性模量、最大載荷比較 藥物干預(yù)12周后，與Sham組比較，PMOP組、EZW-L組、EZW-M組、EZW-H組彈性模量、最大載荷顯著降低（均P<0.01）;與Sham組比較，E2組股骨彈性模量、最大載荷降低（均P<0.05）;與PMOP組比較，EZW-M組的彈性模量、最大載荷增高（均P<0.05），E2組、EZW-H組的彈性模量、最大載荷極顯著增高（均P<0.01）。見(jiàn)表2。

2.3 6組大鼠骨組織病理學(xué)比較 在進(jìn)行藥物干預(yù)12周后，股骨頭HE染色在Sham組呈現(xiàn)的是股骨頭致密且厚的周?chē)瞧べ|(zhì)，大小適中的骨髓腔，大小、粗細(xì)正常的骨皮質(zhì)小梁，且排列規(guī)律，位于骨陷窩內(nèi)的骨細(xì)胞大小正常，骨細(xì)胞與骨陷窩壁緊密鑲貼。PMOP組可見(jiàn)股骨頭變薄的周?chē)瞧べ|(zhì)，萎縮變小的骨細(xì)胞，骨細(xì)胞與骨陷窩壁間隙明顯增大，并可見(jiàn)變小變短的骨皮質(zhì)小梁，骨小梁之間間隙明顯比Sham組增大，呈明顯骨質(zhì)疏松病理表現(xiàn)。與PMOP組比較，E2組和EZW-H組觀察到股骨頭周邊骨皮質(zhì)較厚，骨小梁排列密度較均勻，骨小梁之間間隙亦變小，大小正常的骨細(xì)胞，骨細(xì)胞與骨陷窩之間未見(jiàn)明顯腔隙，疏松病理現(xiàn)象被明顯改善。E2組和EZW-H組鏡下骨組織切片形態(tài)結(jié)構(gòu)相近。見(jiàn)圖1。

2.4 6組大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)比較 藥物干預(yù)12周后，與Sham組比較，PMOP組、EZW-L組、EZW-M組、EZW-H組的骨小梁骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁平均寬度、骨小梁數(shù)均極顯著減少（均P<0.01），骨小梁平均間距則極明顯增加（P<0.01）;與Sham組比較，E2組的骨小梁骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁平均寬度、骨小梁數(shù)顯著減少（均P<0.05），骨小梁平均間距顯著增加（P<0.05）;與PMOP組比較，EZW-M組的骨小梁骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁平均寬度、骨小梁數(shù)顯著增高（均P<0.05），骨小梁平均間距顯著降低（P<0.05），E2組、EZW-H組的骨小梁骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁平均寬度、骨小梁數(shù)極顯著增高（均P<0.01），骨小梁平均間距極顯著降低（P<0.01）。見(jiàn)表3。

2.5 6組大鼠血清骨代謝標(biāo)志物BALP、TRACP-5b、Cath-K比較 藥物干預(yù)12周后，與Sham組比較，PMOP組、EZW-L組、EZW-M組的血清骨代謝標(biāo)志物BALP、TRACP-5b、Cath-K的蛋白表達(dá)均顯著下降（均P<0.01），E2組、EZW-H組的BALP、TRACP-5b、Cath-K蛋白表達(dá)顯著下降（均P<0.05）;與PMOP組比較，EZW-M組的血清骨代謝標(biāo)志物BALP、TRACP-5b、Cath-K的蛋白表達(dá)顯著增高（均P<0.05），E2組、EZW-H組的BALP、TRACP-5b、Cath-K蛋白表達(dá)極顯著增高（均P<0.01）。見(jiàn)表4。

2.6 6組大鼠骨組織OPG/RANK/RANKL信號(hào)軸蛋白表達(dá)情況及比較 藥物干預(yù)12周后，POMP組、EZW-L組、EZW-M組股骨中OPG蛋白含量較Sham組、E2組、EZW-H組明顯下降;而POMP組、EZW-L組、EZW-M組、EZW-H組股骨中RANK、RANKL蛋白含量較Sham組、E2組明顯增高。與Sham組比較，PMOP組、EZW-L組、EZW-M組的OPG/RANKL比值顯著下降（均P<0.01），E2組、EZW-H組的OPG/RANKL比值顯著下降（均P<0.05）;與PMOP組比較，EZW-M組的OPG/RANKL比值顯著增高（P<0.05），E2組、EZW-H組的OPG/RANKL比值顯著增高（均P<0.01）。與Sham組比較，PMOP組、EZW-L組、EZW-M組的RANK/RANKL比值顯著增高（均P<0.01），E2組、EZW-H組的RANK/RANKL比值顯著增高（均P<0.05）;與PMOP組比較，EZW-M組的RANK/RANKL比值顯著降低（P<0.05），E2組、EZW-H組的RANK/RANKL比值顯著降低（均P<0.01）。見(jiàn)圖2，表5。

3 討論

生理情況下，正常的骨代謝周期是骨吸收與骨形成的動(dòng)態(tài)平衡。若某種原因?qū)е抡５墓谴x動(dòng)態(tài)平衡被打破，則出現(xiàn)骨形成小于骨吸收的病理狀態(tài)，造成骨量的丟失[9-10]。女性絕經(jīng)后常發(fā)生骨質(zhì)疏松，是由于絕經(jīng)后女性卵巢功能衰退，減少了雌激素的分泌，骨代謝周期失衡，破骨細(xì)胞活性相對(duì)增強(qiáng)，加快了骨小梁吸收，陷窩加深，且骨形成率下降，造成骨丟失是不可逆的，引起骨小梁變薄、間隙增寬、連接破壞、骨體積減小等病理特征，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折[1]。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，OPG/RANKL信號(hào)軸是女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展的重要路徑之一。OPG是抑制骨吸收、增加皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨密度、面積和骨強(qiáng)度的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其主要功能是競(jìng)爭(zhēng)性地與RANKL結(jié)合，阻斷RANK與RANKL結(jié)合，從而抑制骨吸收，維持骨代謝平衡[11]，因此OPG/RANKL比值可作為衡量骨量及骨健康的重要指標(biāo)[12]。RANK是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞成熟的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其主要功能是在破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞表面與RANKL結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟、分化，且減慢破骨細(xì)胞凋亡[13]。RANKL是調(diào)控骨吸收的關(guān)鍵細(xì)胞因子。Weitzmann[14]研究認(rèn)為，RANKL是骨吸收和細(xì)胞因子對(duì)于破骨細(xì)胞的分化成熟的最后下游效應(yīng)。

在絕經(jīng)后雌激素缺乏首先是對(duì)成骨細(xì)胞的直接作用減弱，成骨細(xì)胞表達(dá)OPG能力減弱，OPG/RANKL比值降低，破骨細(xì)胞分化成熟力及活性增強(qiáng)。成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞均存在雌激素受體，而雌激素可直接作用于成骨細(xì)胞的雌激素受體α，上調(diào)OPGmRNA及蛋白的表達(dá)，增加OPG/RANKL比值[15-16]。體外實(shí)驗(yàn)表明[17]，人破骨細(xì)胞中OPG mRNA的表達(dá)對(duì)17β-雌二醇呈劑量及時(shí)間依賴(lài)性，上調(diào)OPG能降低RANKL與RANK相互作用，減少骨吸收。給切除卵巢的小鼠注射OPG能預(yù)防骨流失。17β-雌二醇通過(guò)抑制RANK旁通路（JNK）活性來(lái)調(diào)節(jié)OPG/RANKL信號(hào)軸，從而減弱RANK受體應(yīng)答力，降低RANK的生物活性[18]。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松歸屬于中醫(yī)“骨痿”“骨痹”“骨枯”等疾病的范疇?！夺t(yī)精經(jīng)義》曰：“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，故骨者，腎之合也，髓者，精之所生也，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足則骨強(qiáng)?！敝嗅t(yī)認(rèn)為腎為機(jī)體的先天之根本，功能主骨生髓，骨髓生化之源依賴(lài)于腎中精氣的充盛，腎精的盛衰決定著骨質(zhì)的強(qiáng)健與衰弱，腎精充盛則骨得所養(yǎng)，腎氣充足則推動(dòng)并調(diào)節(jié)和控制著機(jī)體骨的生長(zhǎng)發(fā)育?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》亦云“年四十而陰氣自半”。女性至更年期，腎氣漸衰，精虧血少，則腎陰更顯不足，再加之肝火、心火之暗耗，故圍絕經(jīng)期婦女以腎陰虛居多，因此補(bǔ)益肝腎是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵。二至丸由女貞子、墨旱蓮2味藥組成，以《醫(yī)方集解》記載者為常用方，有益肝腎、補(bǔ)陰血、壯筋骨的功效。

本研究建立PMOP大鼠模型，以不同劑量的二至丸為干預(yù)方式，E2治療為金標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，PMOP組大鼠骨切片HE染色可見(jiàn)骨細(xì)胞萎縮變小、骨細(xì)胞與骨陷窩壁間隙明顯增大，是骨質(zhì)疏松的典型表現(xiàn)，說(shuō)明本研究模型制備是成功的。通過(guò)E2干預(yù)后，大鼠股骨骨質(zhì)疏松情況、骨微結(jié)構(gòu)、骨生物力學(xué)、血清骨代謝標(biāo)志物等改變得到明顯好轉(zhuǎn)，骨組織中OPG明顯提高，而RANKL和RANK明顯降低，OPG/RANKL比值增高，RANK/RANKL比值下降，認(rèn)為雌激素有通過(guò)促進(jìn)OPG分泌，競(jìng)爭(zhēng)性地與RANKL結(jié)合，抑制RANK與其結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞的成熟分化。EZW-M組及EZW-H組也有E2組相似作用，說(shuō)明其具有雌激素樣作用，也能改善骨微結(jié)構(gòu)、骨生物力學(xué)，改善骨質(zhì)疏松，可用于PMOP治療;其作用機(jī)制可能是通過(guò)OPG/RANK/RANKL信號(hào)軸促進(jìn)成骨細(xì)胞形成，抑制破骨細(xì)胞活性。

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（2020-11-11收稿 本文編輯：楊覺(jué)雄）