梅景雁 沈創(chuàng)鵬 孫治中 曾麗盈 萬曉剛

摘要 目的：利用中藥整合藥理學平臺及分子對接研究探討麻黃-葛根藥治療糖尿病周圍神經病變的分子機制。方法：首先在疾病靶點篩選數據庫和中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索獲取與糖尿病周圍神經病變（DPN）相關的靶標基因及麻黃、葛根的活性成分;然后使用Excel查重獲得藥物與疾病的共同靶點，使用Cytoscape繪制蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖，對共同靶點進行基因本體（GO）富集分析，通過DAVID網站進行京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析;最后用Cytoscape軟件構建“藥物-活性成分-關鍵靶點基因”關系網絡，并用Systems Dock網站進行分子對接，評估活性成分及靶點結合的穩(wěn)定性。結果：麻黃-葛根藥對作用于DPN的活性成分有21個，共同靶點基因138個。該藥對治療DPN富集結果主要集中于去除超氧自由基等7個功能組別中，主要富集的通路包括蛋白激酶C通路、多元醇通路等，治療作用的靶標主要是PKC、PTGS2、Nrf2等。結論：麻黃-葛根藥可能是通過對抗氧化應激及炎癥反應、減緩神經髓鞘及施萬細胞的損害、改善微循環(huán)等途徑來治療DPN的。

關鍵詞 網絡藥理學;分子對接;信號通路;關鍵靶點;麻黃;葛根;糖尿病周圍神經病變

Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Herba Ephedrae and Radix Puerariae drug pair in the treatment of diabetic peripheral neuropathy by using the integrated pharmacology platform of traditional Chinese medicine and molecular docking research.Methods：Firstly searched the disease target screening database and TCMSP platform to obtain the related target genes of DPN，Herba Ephedrae and Radix Puerariae and the active ingredients of the latter; then use excel to checked the common targets of drugs and diseases，and used Cytoscape to draw PPI Network diagram，GO enrichment analysis of common targets，and KEGG pathway analysis through DAVID website; finally used Cytoscape software to construct a “drug-active ingredient-key target-Gene” relationship network，and use the Systems Dock website for molecular docking to evaluate the stability of active ingredients and target binding.Results：Herba Ephedrae and Radix Puerariae drug pair had 21 active ingredients that act on diabetic peripheral neuropathy，and 138 common target genes.The results of the drug′s treatment of DPN enrichment mainly focused on removal of Among the seven functional groups such as removal of superoxide radicals，the main enriched pathways included PKC signaling pathway，Polyol pathway activation，etc.The main therapeutic target is PKC，PTGS2，Nrf2，etc.Conclusion：Herba Ephedrae and Radix Puerariae may be treated by anti-oxidative stress and inflammatory response，slowing down the damage of nerve myelin and Schwann cells，and improving microcirculation.

Keywords Network pharmacology; Molecular docking; Signal pathway; Key target; Herba Ephedrae; Radix Puerariae; Diabetic peripheral neuropathy

中圖分類號：R282;R587.2文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.009

麻黃，性溫，味辛、微苦，入肺、膀胱經[1]，《神農本草經》里記載其“主上氣咳逆，結氣，喉痹吐吸，利關節(jié)”;葛根，性平，味甘、辛，入脾、胃經[1]。古代醫(yī)方有二者共用者，如《傷寒論》中治療太陽經脈不利之桂枝加葛根湯、葛根湯，又如《圣濟總錄》中治療傷寒溫病吐下、余熱未盡之麻黃葛根湯，皆取麻黃-葛根配伍后發(fā)散解表、通絡生津之效。

糖尿病周圍神經病變（Diabetic Peripheral Neuropathy，DPN）是糖尿病神經病變最常見的類型，其發(fā)病與糖類物質沉積于周圍微小血管壁，引發(fā)神經組織供血匱乏等有關，臨床表現為四肢末端感覺障礙、麻木、刺痛等[2-3]。相關研究提示麻黃有保護胰島以及改善糖耐量異常的作用[4]，葛根素可改善DPN患者血液流變學及肌電圖[5]。臨床上取麻黃開腠發(fā)汗、葛根解肌舒經之效，將此藥對用于DPN表現為四肢麻木、痹痛的患者，多有效果。

目前西醫(yī)治療DPN的途徑主要集中在控制血糖、改善微循環(huán)、改善代謝紊亂、營養(yǎng)神經等[6]。但由于中藥成分的復雜多樣性，針對中藥作用于DPN的分子機制的相關論述研究仍然較少。本研究運用網絡藥理學方法[7]，從靶點及通路探索麻黃-葛根藥對與DPN的現代藥理學聯系，以期為進一步研究提供基礎理論支持。

1 資料與方法

1.1 麻黃與葛根化學成分和成分靶點信息獲取及收集

使用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（version 2.3），設定藥物成分口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18和藥物半衰期（Half Life，HL）≥4分析篩選出麻黃、葛根中具有良好的OB、DL和藥物HL的化合物及其靶點。將TCMSP篩選出的成分靶點全稱輸入DrugBank獲取基因簡稱。

1.2 麻黃-葛根藥治療DPN潛在靶點的獲取及收集

以關鍵詞“Diabetic peripheral neuropathy”在DisGeNET、GeneCards和Drugbank這3個疾病靶點篩選數據庫檢索獲取與DPN相關的靶標基因，合并數據去重，將最后篩選出的靶點基因全稱輸入DrugBank、UniProt獲取基因簡稱。將獲取的藥物成分靶點及疾病靶點導入Excel查重，這些重復的靶點即為麻黃-葛根作用于DPN的可能靶點。再將上述靶點與對應的活性成分導入Cytoscape 3.6.0進行匹配映射，并繪制成分靶點圖。

1.3 潛在靶點蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖的構建

利用string數據庫，檢索以上潛在治療靶點之間的關系，導入Cytoscape 3.6.0軟件，生成蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡圖。

1.4 功能富集分析與通路富集分析

使用Cytoscape中GlueGO功能對獲取的靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析，通過DAVID網站進行京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，設定P<0.01，選擇gene值在前20的通路，利用OmicShare網站將結果以氣泡圖的形式呈現。

1.5 藥物活性成分-靶點-通路網絡圖的構建

將以上獲得的通路，結合麻黃-葛根的活性成分及DPN治療靶標，使用Cytoscape軟件（Version3.6.0）構建“藥物-活性成分-關鍵靶點基因”關系網絡，該網絡展示了藥物活性成分-DPN靶標-KEGG通路之間的聯系。

1.6 分子對接

運用Systems Dock網站對Degree值排名前5名的預測靶標與藥物活性成分進行分子對接，通過比較Docking Score值來評估活性成分及靶點結合的穩(wěn)定性。若Docking Score值在4.25分以上，則認為分子與靶點有一定的結合活性，大于5.0說明有較好的結合活性，大小7.0說明具有強烈的結合活性。

2 結果

2.1 DPN疾病靶點的收集

基于DisGeNET，GeneCards，Drugbank數據庫共收集DPN相關靶點基因共2 722個，刪除重復靶點后得到DPN疾病作用靶點2 680個，得到的靶點信息進行基因名的標準化。

2.2 麻黃-葛根活性成分的篩選

通過TCMSP數據庫以OB≥30%、DL≥0.18和HL≥4為條件檢索的麻黃潛在活性成分17個，葛根潛在活性成分4個。見表1。

2.3 麻黃-葛根藥治療DPN潛在靶點

將麻黃、葛根2味藥物與DPN重復的138個靶點基因及其對應的21個活性成分導入Cytoscape軟件進行網絡構建及可視化。見圖1。

2.4 靶點PPI網絡圖

將上述138個靶點，導入string數據庫分析靶點之間的相互作用，利用Cytoscape 3.6.0軟件生成PPI網絡圖。利用Cytoscape 3軟件中network analysis功能分析靶點的degree值，以degree二倍中位值作為篩選條件，選取核心靶點共47個，構建出核心靶點網絡圖，圖中節(jié)點顏色越深、大小越大表示該靶點的degree值越高、與其他靶點相關性越大。其中連接度前5的關鍵靶點基因為PKC（蛋白激酶C）、PTGS2（前列腺素G/H合成酶2）、Nrf2、IGF-1（胰島素樣生長因子1）、glu-LDL（糖基化低密度脂蛋白）。見圖2。

2.5 GO富集分析

應用Cytoscape中GlueGO功能，進行GO富集中的生物過程分析，得到7個功能組別，主要集中在Regulation of mononuclear cell migration（調節(jié)單核細胞遷移）、Removal of superoxide radicals（去除超氧自由基）、Negative regulation of epithelial cell apoptotic process（上皮細胞凋亡過程的負調控）、Synaptic transmission dopaminergic（突觸傳遞多巴胺能）、Negative regulation of muscle contraction（肌肉收縮的負調節(jié)）、Positive regulation of macrophage differentiation（巨噬細胞分化的正調節(jié)）、Activation of cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic signaling pathway（凋亡信號通路中半胱氨酸型內肽酶活性的活化）上。見圖3～4。

2.6 KEGG通路富集分析

通過KEGG通路富集分析，根據P值篩選出與糖尿病相關的富集通路共20條，其中PKC signaling pathway（蛋白激酶C通路）占比最大，其余主要富集的通路還有Polyol pathway activation（多元醇通路）、AGEs signaling pathway（晚期糖基化終末產物通路）、RAGE signaling pathway（晚期糖基化終末產物受體通路）、Phosphatidylinositol signal pathway（肌醇代謝通路）等。見圖5。

2.7 藥物活性成分-靶點-通路網絡圖的構建

結合以上得到的靶點及通路分析結果，使用Cytoscape軟件（Version 3.6.0）構建關系網絡，展示藥物活性成分-DPN靶標-KEGG通路之間的聯系，通過構建這一網絡探析麻黃-葛根治療DPN的作用機制。麻黃-葛根治療DPN與槲皮素（quercetin），β-谷甾醇（beta-sitosterol）等活性成分有關，與PKC、PTGS2等靶點有關，與Polyol pathway activation、AGEs signaling pathway等通路有關，通路主要集中作用在氧化應激、炎癥反應、周圍神經損害、微循環(huán)障礙4個方面。見圖6。

2.8 分子對接

運用Systems Dock網站，選取Degree值排名前5的預測靶標與麻黃-葛根活性成分進行分子對接，分析Docking Score值，再使用GraphPiad Prisn 7.0軟件制作出熱圖。大部分Docking Score值可高于4.25，所選取麻黃-葛根的活性成分與預測靶標有一定結合能力。見圖7。

3 討論

3.1 靶點分析

根據以上分析結果，本研究得到麻黃-葛根藥對中可能作用于DPN的活性成分主要包括槲皮素（quercetin），β-谷甾醇（beta-sitosterol），芒柄花黃素（formononetin），山柰酚（kaempferol）等。而可能發(fā)揮治療作用的靶標主要是蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）、前列腺素G/H合成酶2（Prostaglandin G/H Synthase 2，PTGS2）、Nrf2、胰島素樣生長因子-1（Insulin-like Grown Factor-1，IGF-1）、糖基化低密度脂蛋白（glu-LDL）等。PKC是一種分布在細胞質的酶，在第二信使的作用下能被激活參與包括糖代謝在內的生化反應。例如體內過多的三酰甘油就可激活PKCθ，抑制胰島素受體底物酪氨酸的磷酸化，從而導致2型糖尿病的胰島素抵抗[8]。有研究表明，PKC-β選擇性抑制劑可以改善鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠周圍神經的血流量及傳導速度[9]。另一關鍵靶點基因PTGS2也稱COX-2，是一種誘導性酶，它與眾多炎癥介質表達相互作用，是細胞炎癥反應過程的關鍵環(huán)節(jié)之一[10-11]。有研究用藥物抑制COX-2活性，阻斷脊髓背角pERK的活化和IL-1β/COX-2/PGE2通路，能減輕神經根炎性疼痛[12]、減少高炎癥水平導致的胰島B細胞的功能損傷、減少胰島B細胞的凋亡[13]。Nrf2因子是抗氧化反應的主要調節(jié)劑，它在高糖環(huán)境下的調節(jié)紊亂會導致氧化應激失衡及高血糖損害[14]，有研究證實，糖尿病大鼠的坐骨神經中Nrf2的表達較正常大鼠下調[15]。IGF-1是一種與胰島素分子結構相似的多肽蛋白質，Chu等[16]的實驗證明提高IGF-1的循環(huán)水平可以改善STZ治療糖尿病小鼠的高痛覺過敏和神經元功能，若通過基因療法進一步提高血清IGF-1水平，還能改善其運動功能。另外IGF-1還能通過胰島素受體磷酸化來磷酸化PI3-K，從而激活AKT通路，促進周圍神經系統(tǒng)中的神經膠質細胞——施萬細胞成活，阻止其凋亡[17]。DPN與血脂代謝異常相關[18]，糖基化低密度脂蛋白是低密度脂蛋白（LDL）糖基化后形成的產物，它可被糖基化末端產物受體內化，釋放三酰甘油及游離脂肪酸，啟動炎癥信號途徑，同時消耗NADPH產生超氧自由基啟動氧化應激反應[19]。其他的相關靶點，如COX-2、TNF-α、DRP1等，則涉及炎癥反應、神經元細胞凋亡、血管內皮損傷等多個病理過程。

3.2 通路分析

KEGG通路富集分析顯示，麻黃-葛根治療DPN的關鍵靶點基因富集程度靠前的通路包括PKC signaling pathway（蛋白激酶C通路）、Polyol pathway activation（多元醇通路）、AGEs signaling pathway（晚期糖基化終末產物通路）、RAGE signaling pathway（晚期糖基化終末產物受體通路）、Phosphatidylinositol signal pathway（肌醇代謝通路）等。查閱相關文獻資料后可發(fā)現，排名前5的通路對DPN作用主要集中在神經本身的損害及氧化應激2個方面。當體內處于高糖環(huán)境時，Polyol代謝通路被施萬細胞中的醛糖還原酶激活，生成山梨醇，山梨醇在施萬細胞內大量堆積，使得細胞內呈高滲狀態(tài)，從而加快了神經細胞的水腫、變性及壞死，進一步則引起神經髓鞘脫失及神經纖維再生延遲[20]。同時，Polyol通路生成的三酰甘油還能激活PCK通路，PCK通路則通過影響核因子κB、血管內皮生長因子等，導致組織缺氧、微循環(huán)障礙，最終降低DPN患者的血流速度和神經傳導速度并引起疼痛[21]。RAGE即AGEs受體，AGEs與RAGE結合后，可破壞神經髓鞘的完整性，影響神經組織的微管蛋白，導致軸突萎縮、變性，使神經的再生和修復受阻[22-23]。肌醇與葡萄糖的結構極其相似，在高血糖狀態(tài)下葡萄糖可競爭性抑制神經組織攝取肌醇，使得Na+-K+-ATP酶活性的下降，引起異常信號轉導及血管改變，最終導致神經纖維的結構被破壞。

另一方面，由于Polyol通路中醛糖還原酶過度的活躍及果糖過量的生成，還原型輔酶Ⅱ被大量消耗，ROS清除不足，可誘發(fā)胞內氧化應激反應[24]。有研究發(fā)現，在缺血再灌注的DPN大鼠中應用醛糖還原酶抑制劑后，大鼠的神經傳導速度和神經癥狀都能得到一定程度的改善[25]。AGEs/RAGE信號通路的激活同樣可以釋放活性氧（ROS）誘發(fā)氧化應激，還可通過激活Nox-1和核因子κB、降低SOD-1的表達來增加氧化應激，從而促進糖尿病介導的血管鈣化及神經營養(yǎng)不足[26]。除上述通路外，關鍵靶點還富集于核因子κB、PPAR、Hexosamine、PI3K等眾多通路上，表明麻黃-葛根治療DPN是各通路協調作用的結果。

綜上所述，麻黃-葛根藥對治療糖尿病周圍神經病變可能是通過對抗氧化應激及炎癥反應、減緩神經髓鞘及施萬細胞的損害、改善微循環(huán)等途徑來取得治療效果的，這是一個中藥活性成分作用于疾病的多靶點、多通路的過程。

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（2020-10-20收稿 本文編輯：楊覺雄）