李璇 劉宇飛 樊英怡 禹堯 余紅 裴曉華

摘要 目的：應用網(wǎng)絡藥理學分析對“香附-郁金”藥對治療乳腺增生病的作用機制進行探討與分析。方法：采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）對香附、郁金的有效活性成分進行篩選，并提取其作用靶點，再利用GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取乳腺增生病相關基因。映射疾病靶點與藥物靶點，通過STRING在線數(shù)據(jù)庫構建關鍵蛋白之間所產生的相互作用關系圖;Cytoscape 3.8.0建立“藥物-有效成分-作用靶點”網(wǎng)絡圖，并對關鍵靶點進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。結果：共獲得“香附-郁金”藥對33個活性成分，包括異鼠李素、槲皮素、豆甾醇等，與疾病潛在靶點取交集后得到88個共同作用靶點，包括ESR1、EGFR、PGR等，GO分析得到104個分子功能、41個細胞組分和1 262個生物過程，KEGG通路分析主要涉及119條通路，主要相關通路為PI3K/AKT信號通路。結論：“香附-郁金”藥對治療乳腺增生病多成分、多靶點協(xié)同發(fā)揮作用機制，可能通過調節(jié)人體內激素內分泌水平，從而發(fā)揮治療乳腺增生病的作用，為臨床應用奠定了良好的理論基礎。

關鍵詞 香附;郁金;乳腺增生病;網(wǎng)絡藥理學;藥物活性成分;靶點;通路;作用機制

Abstract Objective：To explore and analyze the mechanism of “Cyperi Rhizoma-Curcumae Radix” in the treatment of hyperplasia of mammary glands.Methods：The traditional Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform（TCMSP） was used to screen the active ingredients of Cyperi Rhizoma-Curcumae Radix，and their targets were extracted，and then the related genes of mammary gland hyperplasia were obtained by using the GeneCards database.Mapping disease targets and drug targets，and the STRING online database was used to construct the interaction diagram between key proteins; Cytoscape 3.8.0 established a “drug-active ingredient-target” network diagram，and analyzed the key targets，gene Ontology（GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analysis.Results：A total of 33 active ingredients of “Cyperi Rhizoma-Curcumae Radix” were obtained，including isorhamnetin，quercetin，stigmasterol，etc.，and 88 common targets were obtained after intersecting with potential disease targets，including ESR1，EGFR，PGR，etc.，104 results were obtained from the GO molecular function analysis，41 results from the cellular component analysis，and 1 262 results from the biological process analysis.The KEGG pathway analysis mainly involved 119 pathways，and the main related pathway was the PI3K-AKT signaling pathway.Conclusion：The mechanism of Cyperi Rhizoma-Curcumae Radix in the treatment of hyperplasia of mammary glands is multi-component and multi-target synergy，which may play a role in the treatment of hyperplasia of mammary glands by regulating the hormone endocrine level in human body，and lay a good theoretical foundation for clinical application.

Keywords Cyperi Rhizoma; Curcumae Radix; Mammary gland hyperplasia; Network pharmacology; Target; Pathway; Mechanism of action

中圖分類號：R285;R282文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.008

乳腺增生病（Hyperplastic Disease of Breast，HDB）是指乳腺導管、乳腺小葉、腺泡上皮、纖維組織的單項或多項良性增生[1]，在臨床上，常伴有一側或者雙側周期性加重的乳房脹痛，或者表現(xiàn)為多發(fā)性乳房腫塊，當月經周期發(fā)生變化之后，也會出現(xiàn)增大、縮小以及變軟變硬等癥狀[2]，部分會伴有乳頭溢液。乳腺增生病是臨床上最常見的良性乳腺疾病[3]，女性在30～50歲比較常見[4]，在乳腺疾病中，所占比例達到了75%，最近幾年，本病發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢，對患者的工作與日常生活造成了不良影響，如果患者出現(xiàn)非典型增生，癌變率也會隨之升高?，F(xiàn)代醫(yī)學認為其病因則是由于卵巢功能失調、內分泌功能紊亂等諸多因素導致的，任何導致性激素（雌激素、孕激素、泌乳素等）或其受體改變的因素均可能增加乳腺增生病的患病風險，如遺傳因素、年齡、月經史、孕育史、哺乳史、服避孕藥史、生活習慣以及精神心理因素等[5-6]。

中醫(yī)理論認為，乳腺增生病屬“乳癖”范疇，臨床以肝郁氣滯型較為多見。癥見憂郁寡歡，心煩易躁;兩側乳房脹痛，可捫及腫塊，其腫塊常隨情志波動而消長;每于經前乳頭、乳房脹痛更甚，經后可有所緩解;兼有兩脅脹悶，少氣懶言，善嘆息，噯氣頻作，舌質淡，苔薄白，脈弦[7-8]。乳頭乳房為肝經循行之處，女子以肝為先天，肝藏血、主疏泄、體陰而用陽，易于怫郁。乳癖屬肝氣郁滯者，每多有性情抑郁，憂思多慮或心煩急躁易怒，胸悶噯氣，而乳房疼痛與腫塊大小變化，亦多與情緒變化有關。乳癖以乳房疼痛及腫塊為主癥，肝郁氣滯，肝失條達，致使血行不暢，乳絡閉阻，氣滯血瘀，不通則痛。經前沖任血液充盈，乳房腫痛加重，月經后氣血得到疏泄，腫痛則減輕，故治療中疏肝理氣、活血化瘀尤為重要[1]。經查閱文獻發(fā)現(xiàn)以疏肝活血為主的中藥復方治療乳腺增生病具有較好的臨床療效，比如：周柏林[9]使用逍遙貝蔞散（瓜蔞15 g、浙貝母10 g、郁金12 g、白術12 g、香附10 g等），崔紅海等[10]使用補腎疏肝活血散結湯（熟地黃30 g、枸杞子15 g、郁金10 g、柴胡10 g、香附10 g等），田新民[11]自擬疏肝活血散結法（柴胡10 g、香附12 g、丹參12 g、郁金15 g等）治療乳腺增生病療效顯著，這類方劑均含有“香附-郁金”藥對，因此本研究通過網(wǎng)絡藥理學分析方法，探索“香附-郁金”藥對乳腺增生病的潛在作用機制，在對乳腺增生病進行治療時，主要對其信號通路與關鍵靶點進行分析，為進一步研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 化學成分篩選和作用靶點的收集

利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），TCMID（https：//bigd.big.ac.cn/databasecommons/database）、TCM@Taiwan（http：//tcm.cmu.edu.tw/）對本研究有關的化學成分進行檢索，所設定的篩選條件即為口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，以及類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18，篩選出香附、郁金的有效化合物，并獲得對應的作用靶點。在Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中，實現(xiàn)以上靶點蛋白標準化。

1.2 收集疾病相關基因

以“Hyperplasia of mammary glands”“Breast hyperplasia”“Mammary hyperplasia”作為檢索詞匯，通過GeneCard數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）進行搜索，從而檢索乳腺增生病相關基因。

1.3 構建成分-靶點網(wǎng)絡及靶點映射

通過映射疾病靶點與藥物預測的靶點得出香附-郁金治療乳腺增生病所產生的作用靶點，繪制韋恩圖;應用Cytoscape 3.8.0軟件進行操作，建立香附-郁金活性成分-乳腺增生病靶點網(wǎng)絡，對于各個節(jié)點（node）來說，指的是基因、分子或者蛋白，各節(jié)點之間的連接（edge），表示中藥成分及其作用靶點之間所產生的關系[12-13]。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡的構建

將香附-郁金治療乳腺增生病的作用靶點導入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），對蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）進行分析，從而建立與之相匹配的PPI網(wǎng)絡。再運用Cytoscape 3.8.0軟件進行拓撲結構分析，進一步篩選關鍵蛋白。

1.5 生物過程與通路分析

通過R語言對香附-郁金治療乳腺增生病核心靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，獲得GO富集分析結果（P<0.05）及KEGG信號通路富集分析結果（P<0.05）。

2 結果

2.1 “香附-郁金”藥對主要活性成分

通過TCMSP檢索出香附104個化學成分、郁金222個化學成分。根據(jù)閾值設定OB≥30%，DL≥0.18，共篩選出33個主要化學成分，其中香附18個，郁金15個。見圖1，表1。檢索香附-郁金的33個主要成分的靶點蛋白，可獲取唯一靶點蛋白質，共計為108個。

2.2 香附-郁金治療乳腺增生的作用靶點及核心活性成分

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，獲取的乳腺增生病相關靶點基因共計4 259個。將香附-郁金的108個潛在作用靶點和GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取的4 259個疾病靶點取交集，繪制韋恩圖，得出香附-郁金治療乳腺增生病所產生的共同作用靶點，總計88個。見圖2。通過Cytoscape 3.8.0軟件構建藥物-疾病靶點相互作用網(wǎng)絡。見圖3。

2.3 香附-郁金治療乳腺增生病關鍵靶點的PPI分析

在線STRING 11.0數(shù)據(jù)庫上傳共有靶點，最高置信度蛋白質參數(shù)評分值>0.9，形成與之相匹配的PPI網(wǎng)絡。見圖4。通過count值降序分析前30位的關鍵靶點。見圖5。利用Cytoscape 3.8.0軟件分析，以DC≥20及DC≥23為篩選條件，得到關鍵基因的拓撲分析圖。見圖6。

2.4 GO功能富集分析

GO富集分析結果包括分子功能（Molecular Function，MF）、細胞組分（Cell Component，CC）和生物過程（Biological Process，BP）。在GO功能富集分析中，設定P<0.05，顯示104個MF，包括DNA結合轉錄激活物活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性（RNA polymerase Ⅱ-specific，GO：0001228）、泛素蛋白連接酶結合（ubiquitin protein ligase binding）、泛素樣蛋白連接酶結合（ubiquitin-like protein ligase binding，GO：0044389，GO：0031625）;41個CC，包括膜筏（membrane raft，GO：0045121），膜微區(qū)（membrane microdomain，GO：0098857），膜區(qū)（membrane region，GO：0098589）;1 262個BP，包括對類固醇激素的反應（response to steroid hormone，GO：0048545）、對金屬離子的響應（response to metal ion，GO：0010038）、對輻射的反應（response to radiation，GO：0009314）。見圖7。

2.5 KEGG通路富集分析

KEGG分析得出與香附-郁金治療乳腺增生病的相關信號通路共計119條。根據(jù)count選取排名前20的信號通路。見圖8。結果顯示香附-郁金治療乳腺增生病的信號通路主要與PI3K/AKT信號通路相關。見圖9。

3 討論

“香附-郁金”是中醫(yī)疏肝活血的經典藥對，其中香附，味辛、微苦、微甘，性平[14]，歸肝、脾、三焦經，具有行氣解郁止痛的功效。主治肝郁氣滯所致胸脅及脘腹脹痛、乳房脹痛、月經不調、經閉痛經等?！侗静菥V目》稱之為“氣病之總司，女科之主帥”[15]。郁金，味辛、苦，性寒，歸肝、心、肺經，具有活血止痛，行氣解郁，清心涼血的功效[16]，主治氣滯血瘀痛證。香附可通十二經，行血中之氣，對于調氣解郁十分有效。然香附行氣有余，且活血之力不足，應用郁金之性味辛香能活血祛瘀、行氣開郁以為助，將取得更顯著的治療效果。蓋香附行氣以活血，郁金則活血以行氣，二者合用，相輔相成，共奏疏肝解郁，活血理氣之效。

在本研究中，分析獲得香附-郁金的主要有效成分包括異鼠李素、槲皮素、豆甾醇、β-谷固醇、山柰酚等。

谷甾醇、豆甾醇屬植物甾醇，在甾醇類的作用下，能夠將一些乳腺細胞在細胞分裂DNA合成期停留，對細胞增殖產生抑制作用，促進細胞凋亡的作用[17-20]。植物甾醇能夠增強人外周血液淋巴細胞和T細胞增殖，從而增強免疫應答，從免疫抑制的方向避免乳腺增生的進一步發(fā)展和乳腺癌的發(fā)生[21]。

異鼠李素是一種黃酮類藥物，不僅可以同自噬/有絲分裂抑制劑結合后促進細胞凋亡，而且還能通過抑制細胞生長、產生細胞毒性、增加氧化應激、阻滯細胞周期、抑制乳腺細胞的增殖，達到治療乳腺疾病的作用[22-23]。

山柰酚屬黃酮類黃酮醇亞屬，有研究證實黃酮醇參與了EGFR/PI3K/AKT、Notch1/PI3K/AKT等多條信號通路，上調促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和下調抗凋亡蛋白Bcl-2，達到阻滯細胞周期、促進細胞凋亡的作用[24]。山柰酚能顯著減少腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-1β（IL-1β）的表達且呈劑量依賴性，從而緩解乳腺的增生程度[25]。

槲皮素是一種類雌激素樣活性的天然植物激素，其結構與雌二醇（E2）相似，可以與雌激素受體（ER）結合，調節(jié)激素水平，并通過下調抗凋亡因子Bcl-2及上調促凋亡因子Bax、Bak的表達調節(jié)乳腺上皮細胞周期，誘導細胞凋亡[26-28]。

PPI分析發(fā)現(xiàn)，存在緊密相互作用關系的關鍵靶點包括雌激素受體1（ESR1）、表皮生長因子受體（EGFR）、孕激素受體（PGR）等。ER的過度表達會誘導乳腺上皮細胞及間質纖維出現(xiàn)增生，使乳腺上皮細胞的修復能力減弱，孕激素受體過度表達會引起乳腺上皮細胞形態(tài)的改變，激活特異性生長因子，使乳腺上皮細胞對孕激素的應答出現(xiàn)異常，進而影響乳腺組織的復舊，所以雌孕激素不平衡引起乳腺結構紊亂導致乳腺增生[29]。雌激素受體編碼ERα蛋白，在結合雌激素之后，對激素水平進行調節(jié)[30]，健康的乳腺腺上皮細胞中所產生的信號通路，與其配體共同結合之后，將會對相關信號轉導通路產生刺激作用，并且影響到乳腺腺上皮細胞的生長以及凋亡等過程[31]。孕激素受體與孕激素相結合后，形成孕激素-孕激素受體復合物，并生成同源二聚體，結合啟動因子并激活孕激素基因轉錄，導致正常乳腺細胞生物學特性的改變[32]。EGFR基因與雌激素分泌相關，張珺等[33]通過探索疏肝中藥治療乳腺增生病的機制發(fā)現(xiàn)，通過抑制EGFR/STAR3信號通路，能同時對體內雌激素的分泌進行抑制，從而起到逆轉阻斷乳腺非典型增生的效果，促使其恢復至常態(tài)。

分析發(fā)現(xiàn)，GO功能主要集中在信號轉導、轉錄以及激素受體結合等方面。而KEGG通路富集結果中關鍵的作用通路是PI3K/AKT信號通路。PI3K/AKT信號通路對雌激素具有調控作用，研究表明，AKT介導的ERα磷酸化在沒有配體的情況下也能增強ERα轉錄活性和ERα靶基因的轉錄[34]，從而造成內分泌環(huán)境紊亂，導致乳腺增生[35]。PI3K的異常激活可繼發(fā)下游靶標AKT磷酸化激活，AKT的持續(xù)激活可引起正常乳腺細胞的生長，抑制其凋亡，并激活下游mTOR的活性，促進乳腺細胞增殖[36-37]。除了調節(jié)ERα外，PI3K/AKT信號通路還顯示出對ERβ的調節(jié)作用，Sanchez等[38]證明，AKT能夠在其Ser255殘基的鉸鏈區(qū)內磷酸化小鼠ERβ，且這種磷酸化能通過抑制AKT與已知的ERβ輔因子CBP的相互作用來抑制ERβ轉錄活性[39]。此外，PI3K/AKT信號轉導激活轉錄因子激活蛋白-1，其與雌激素轉錄活性協(xié)同作用，激活雌激素信號通路。

經進一步查閱文獻，許多相關實驗佐證上述研究結論。蔣寶響等[40]在香舒丸對乳腺增生病作用及性激素調節(jié)機制的研究中發(fā)現(xiàn)，含有香附的香舒丸能顯著改善乳腺增生病模型大鼠的乳腺組織病理變化，顯著降低血清中雌二醇、泌乳素及乳腺組織中ERα、PR的表達，顯著升高血清中孕酮及乳腺組織中ERβ的表達，逆轉模型病理指標，提示香舒丸具有調節(jié)乳腺上游激素、抑制乳腺上皮增生、抑制乳腺內血管生成的作用。錢夢等[41]在觀察柴胡疏肝散對大鼠乳腺的作用中發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散具有減輕肝郁證模型大鼠乳腺增生樣變的作用，而且還有抑制乳腺增生樣變進一步發(fā)展為過度增殖、非典型增生的作用。李蜀平等[42]在郁金乳癖丸的藥效學研究中發(fā)現(xiàn)，含有香附郁金的郁金乳癖丸對注射苯甲酸雌二醇致大鼠雌激素水平增高和對大鼠乳腺組織增生有抑制作用，使乳腺腺泡數(shù)量和乳腺直徑顯著性降低，降低乳腺增生大鼠血清中雌二醇和孕酮含量。

綜上所述，“香附-郁金”藥對治療乳腺增生病的過程涉及了多個活性成分、作用靶標及生物過程，其作用機制復雜多樣，并非只由單個成分、單個靶標或單個通路發(fā)揮作用。本研究觀點認為，“香附-郁金”藥對可能是主要通過調節(jié)人體內激素內分泌水平，從而發(fā)揮治療乳腺增生病的作用，整體上預測了“香附-郁金”藥對的活性成分及其在乳腺增生病中的分子機制，并探索了多種潛在的治療靶點。因此，本研究為進一步研究乳腺增生病的分子機制提供了方向，為“香附-郁金”藥對指導臨床應用奠定了良好的理論基礎。

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（2020-11-02收稿 本文編輯：楊覺雄）