任俊豪,徐 萍,李雙陽,唐紅梅,王饒瓊,白 雪

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2. 四川省自貢市第三人民醫(yī)院，四川 自貢 643000)

血管性癡呆是由各種腦血管病危險因素及腦血管病引起不同程度的學(xué)習(xí)和記憶能力障礙為主要表現(xiàn)的臨床綜合征[1]，是繼阿爾茨海默病之后的第二大癡呆類型，早期預(yù)防及治療對延緩病情進(jìn)展具有重大意義。腦生理功能的維持依賴于良好的血氧供應(yīng)，腦血管事件引起腦血流量下降，缺氧缺血導(dǎo)致神經(jīng)血管解耦聯(lián)，同時可繼發(fā)多種病理生理損傷[2]，其中以血腦屏障損傷為核心的神經(jīng)血管單元功能障礙是血管性癡呆的早期核心病理環(huán)節(jié)[3-4]。有研究證實(shí)，腦缺氧缺血狀態(tài)可導(dǎo)致血腦屏障損傷，且血腦屏障的改變甚至早于認(rèn)知障礙臨床癥狀的出現(xiàn)，提示血腦屏障損傷可能是血管性癡呆的早期標(biāo)志和干預(yù)靶點(diǎn)，改善血腦屏障功能，促進(jìn)血管新生，改善腦血流灌注，從而恢復(fù)神經(jīng)血管單元的功能是血管性癡呆防治的重點(diǎn)[5-6]。課題組基于全國名老中醫(yī)王明杰“玄府理論”[7]，認(rèn)為血管性癡呆的根本病機(jī)為腦玄府郁閉，神機(jī)失用，提出重用風(fēng)藥開通玄府，輔以蟲類藥，佐以補(bǔ)益藥的配伍原則。前期研究表明風(fēng)藥組方開通玄府可改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[8-9]。結(jié)合腦玄府與神經(jīng)血管單元在形態(tài)、功能和病理方面的高度相似性，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察了風(fēng)藥組方通竅益智顆粒對血管性癡呆大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)和通透性、海馬CA1區(qū)微血管密度及血管新生相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，從腦玄府與神經(jīng)血管單元的角度探討了該組方治療血管性癡呆的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性SD大鼠130只，8～10周齡，體重220～250 g，購自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)和使用許可證:SCXK(川)2018-17,SYXK(川)2018-065。所有大鼠均按照3～5只/籠的標(biāo)準(zhǔn)分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±2)℃，自由飲食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始造模。實(shí)驗(yàn)經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審核通過(DWLL2018001)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)藥物 通竅益智顆粒組方：葛根30 g(四川)、黃芪30g(甘肅)、人參10g(吉林)、水蛭3 g(河北)、地龍10 g(廣東)、靈芝15 g(四川)、川芎15 g(四川)、石菖蒲15 g(四川)，藥物購自西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院并由制劑室制備。水蛭、地龍經(jīng)70%乙醇浸泡1周后提取蛋白備用，提取石菖蒲揮發(fā)油備用，其余藥物經(jīng)3次水煎后混勻，過濾殘渣，并加入提取后蛋白及揮發(fā)油制為3 g/mL的濃縮液。尼莫地平片：山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H14022821，規(guī)格：20mg/片，蒸餾水配置成2 mg/mL的混懸液備用。

1.3試劑及儀器 Anti-血管生成素-1(Ang-1)(Abcamab102015)；Anti-血管生成素-2(Ang-2)(proteintech 24613-1-AP)；Anti-內(nèi)皮細(xì)胞TEK酪氨酸激酶(Tie2) (proteintech 19157-1-AP)；Anti-主要促進(jìn)因子超家族成員2a(Mfsd2a)多克隆抗體(Abcam ab105399)；Anti-緊密連接相關(guān)蛋白(Occludin)(Thermo Fisher OC-3F10)；Morris水迷宮(成都泰盟)；光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；機(jī)械組織勻漿機(jī)(瑞士KINEMETICA)；透射電鏡JEM-1011 (日本電子公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)選取20只大鼠作為假手術(shù)組，分離但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈；其余大鼠采取雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法制備血管性癡呆模型[10]，術(shù)后肌注青霉素鈉80 000 IU/d，連續(xù)3 d。術(shù)后28 d根據(jù)Morris水迷宮測試的大鼠逃避潛伏期[11]篩選出造模合格的大鼠，將100只造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、尼莫地平組及通竅益智顆粒高、中、低劑量組，每組20只。根據(jù)人和動物等效劑量換算關(guān)系，通竅益智顆粒高、中、低劑量組每天給予通竅益智顆粒23.54 g/kg、11.77 g/kg、5.88 g/kg灌胃，尼莫地平組每天給予尼莫地平6.25 mg/kg灌胃，假手術(shù)組和模型組每天給予2 mL生理鹽水灌胃，各組均連續(xù)灌胃28 d。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1學(xué)習(xí)、記憶能力 采用Morris水迷宮評價。定位航行實(shí)驗(yàn)：平臺隨機(jī)放置于第Ⅲ象限的中心，灌胃結(jié)束后將大鼠面向第Ⅰ象限水池壁中央放入水中，記錄90 s內(nèi)大鼠從入水到爬上隱藏平臺停留至少2 s這個過程所用時間即逃避潛伏期，同法依次記錄第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限逃避潛伏期。實(shí)驗(yàn)90 s仍未找到平臺大鼠，人為引導(dǎo)其找到平臺并在上面停留20 s，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果為90 s。每天中午訓(xùn)練1次，連續(xù)5 d,根據(jù)大鼠逃避潛伏期評估大鼠學(xué)習(xí)能力。完成定位航行實(shí)驗(yàn)后，第6天移去平臺，使大鼠由任一象限入水，記錄90 s內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限停留時間及穿過原平臺次數(shù)，連續(xù)訓(xùn)練2 d，每天1次，以評價大鼠的記憶能力。

1.5.2血腦屏障通透性 每組隨機(jī)選取4只大鼠，尾靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)溶液(5 mL/kg)，見大鼠鞏膜皮膚變藍(lán)1 h后，予以3.6%水合氯醛溶液5 mL/kg腹腔麻醉，開胸暴露心臟，生理鹽水灌注，以右心耳流出液由血色轉(zhuǎn)為清澈，肺、肝臟變白為準(zhǔn)，開顱取腦，稱重后裝入EP管。剪碎標(biāo)本，加入1.5 mL PBS液，制成勻漿， 4 ℃下2 000 r/min離心30 min，取上清液1 mL，加入等量100%三氯乙酸，4 ℃孵育24 h后，4 ℃下2 000 r/min離心30 min，取上清液200μL加入孔板，1∶1的比例配置空白對照液(即1 mL 100%三氯乙酸∶1 mL PBS液)，伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)液配置：0.5%伊文思藍(lán)0.1 mL加入0.4 mL空白對照液中配置成第一管液(1 000 000 ng/mL)，取上述液體0.1 mL加入0.1 mL空白對照液配置成第二管液(500 000 ng/mL)，以此類推操作，至第十三管液(244.140 625 ng/mL)，酶標(biāo)儀檢測吸光值(OD值)。以第六管至第十三管液的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每克腦組織中伊文思藍(lán)含量。

1.5.3血腦屏障超微結(jié)構(gòu) 每組隨機(jī)選取4只大鼠，麻醉取腦剝離海馬，4%戊二醛電鏡固定液低溫(4 ℃)暫存20 min，雙面刀片樣本修整并組織修剪，3.5%戊二醛電鏡固定液前固定，1%餓酸固定液后固定，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂Epon618滲透、包埋，聚合，半薄切片，光鏡定位，超薄切片機(jī)切片，撈至銅網(wǎng)后予檸檬酸鉛-醋酸鈾雙染色(室溫下15～20 min)，透射電鏡觀察血腦屏障超微結(jié)構(gòu)。

1.5.4微血管密度 每組隨機(jī)選取4只大鼠，麻醉后以生理鹽水灌注，再以4%多聚甲醛溶液灌注,取全腦組織，用4%多聚甲醛固定24 h，剪出海馬所在部位，按蔗糖濃度梯度脫水，常規(guī)冰凍包埋切片，每片厚約6 μm，每個組織隨機(jī)取3張玻片，PBS溶液洗除OCT包埋劑，組化筆劃圈，滴加0.5%Triton X-100室溫通透20 min，山羊血清封閉1 h，滴加一抗CD31(1∶500)，4 ℃孵育過夜，PBS浸洗3次，滴加熒光標(biāo)記二抗(1∶200)，37 ℃避光孵育1 h，PBS浸洗3次，滴加DAPI(1∶1 000)，室溫染色5 min，PBS浸洗3次，甘油明膠封片。于熒光顯微鏡下觀察，100倍視野掃視，選擇海馬CA1區(qū)血管密度最高的區(qū)域，再200倍視野下計數(shù)5個視野內(nèi)被染色的血管數(shù)，計算平均值即微血管密度。

1.5.5海馬組織中Mfsd2a、occludin、Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測。每組隨機(jī)選取8只大鼠，麻醉后進(jìn)行生理鹽水灌注，開顱取腦，冰上分離海馬放入EP管內(nèi)-80 ℃保存。取適量海馬組織冰上勻漿，提取蛋白，BCA法測蛋白濃度，配平后采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后5%BSA封閉，對應(yīng)一抗(Ang-1、Ang-2、Tie2、Mfsd2a、Occludin稀釋比例均為1∶500,β-actin稀釋比例為1∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ELC發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光攝像。利用Image J軟件進(jìn)行靶蛋白條帶灰度值測定。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠第1～5天逃避潛伏期均明顯延長(P均<0.05)；第6天和第7天大鼠穿過原平臺次數(shù)明顯減少(P均<0.05)，目標(biāo)象限停留時間明顯縮短(P均<0.05)。與模型組比較，各給藥組大鼠第1～5天逃避潛伏期均明顯縮短(P均<0.05)；第6天和第7天大鼠穿過原平臺次數(shù)明顯增加(P均<0.05)，目標(biāo)象限停留時間明顯延長(P均<0.05)；且通竅益智顆粒高劑量組上述指標(biāo)較尼莫地平組和通竅益智顆粒低、中劑量組改善明顯(P均<0.05)。見表1及表2。

表2 假手術(shù)組和血管性癡呆各組大鼠穿過原平臺次數(shù)和目標(biāo)象限停留時間比較

2.2各組大鼠血腦屏障通透性比較 假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組和通竅益智顆粒高、中、低劑量組大鼠腦組織中伊文思藍(lán)含量分別為(0.26±0.02)μg/g、(6.30±0.36)μg/g、(2.31±0.41)μg/g、(1.34±0.34)μg/g、(2.14±0.25)μg/g、(3.94±0.08)μg/g，模型組及各給藥組均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，各給藥組均明顯低于模型組(P均<0.05)，通竅益智顆粒高劑量組明顯低于尼莫地平組和通竅益智顆粒中、低劑量組(P均<0.05)。

2.3各組大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu) 假手術(shù)組大鼠血腦屏障結(jié)構(gòu)清晰、完整，微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接，血腦屏障基底膜完整，星形膠質(zhì)細(xì)胞足突未見異常；模型組大鼠血腦屏障結(jié)構(gòu)不完整，內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接松弛，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及細(xì)胞器不清，未見附著的周細(xì)胞，血腦屏障基底膜不完整，管腔表面星形膠質(zhì)細(xì)胞足突水腫明顯；各給藥組大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)較模型組均有不同程度改善，以通竅益智顆粒高劑量組改善最明顯，可見血腦屏障結(jié)構(gòu)清楚且較完整，內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接未見松弛，核膜較完整，周細(xì)胞附著表面，血腦屏障基底膜較完整，周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞足突輕微水腫。見圖1。

圖1 假手術(shù)組和血管性癡呆各組大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)

2.4各組大鼠海馬CA1區(qū)微血管密度 假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組和通竅益智顆粒高、中、低劑量組大鼠海馬CA1區(qū)微血管密度分別為5.20±0.33，9.55±0.30，12.55±0.96，24.55±0.91，13.20±0.28，9.45±0.34，模型組明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，尼莫地平組及通竅益智顆粒高、中劑量組均明顯高于模型組和通竅益智顆粒低劑量組(P均<0.05)，通竅益智顆粒高劑量組明顯高于尼莫地平組和通竅益智顆粒中劑量組(P均<0.05)。免疫熒光染色表現(xiàn)見圖2。

圖2 假手術(shù)組和血管性癡呆各組大鼠海馬CA1區(qū)微血管密度(×200)

2.5各組大鼠海馬組織中Mfsd2a、Occludin、Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白表達(dá)情況 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中Mfsd2a、Occludin蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)，Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白相對表達(dá)量均明顯增高(P均<0.05)；尼莫地平組和通竅益智顆粒中、高劑量組大鼠海馬組織中Mfsd2a、Occludin、Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白相對表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)；通竅益智顆粒高劑量組Occludin、Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白相對表達(dá)量均明顯高于尼莫地平組和通竅益智顆粒低、中劑量組(P均<0.05)，Mfsd2a蛋白相對表達(dá)量明顯高于尼莫地平組和通竅益智顆粒低劑量組(P均<0.05)。見圖3及表3。

圖3 假手術(shù)組和血管性癡呆各組大鼠海馬組織中Mfsd2a、Occludin、Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白表達(dá)情況

3 討 論

神經(jīng)血管單元由血腦屏障、神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等共同組成，是血管和實(shí)質(zhì)細(xì)胞及其周圍環(huán)境的集成系統(tǒng)，神經(jīng)血管單元內(nèi)各組成成分的協(xié)同工作，使腦血流供應(yīng)與代謝需求相匹配，維持腦穩(wěn)態(tài)[12]。慢性或急性腦灌注不足引起腦血流失調(diào)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等導(dǎo)致血腦屏障破壞，激活腦內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)和炎癥環(huán)境，使腦水腫加重，炎細(xì)胞浸潤，進(jìn)一步加重腦灌注異常并引起神經(jīng)元損傷，促進(jìn)神經(jīng)-血管功能解耦聯(lián)，誘導(dǎo)神經(jīng)損傷出現(xiàn)認(rèn)知障礙及神經(jīng)退行性變[4，13-14]。

表3 假手術(shù)組和血管性癡呆各組大鼠海馬組織中Mfsd2a、Occludin、Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白相對表達(dá)量比較

相關(guān)研究表明，非癡呆型血管性認(rèn)知障礙即可出現(xiàn)血腦屏障的滲漏，且發(fā)生時間遠(yuǎn)早于臨床癥狀的出現(xiàn)和惡化[15]；輕度認(rèn)知功能障礙患者中也觀察到血腦屏障損傷早于Aβ、Tau的典型病理改變的出現(xiàn)[16]，提示血腦屏障損傷可能與認(rèn)知障礙的發(fā)生密切相關(guān)。其中緊密連接保證了血腦屏障低通透性屏障作用，限制外源性白細(xì)胞、炎性細(xì)胞因子等有害物質(zhì)進(jìn)入中樞，Occludin是在包括血腦屏障在內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接中發(fā)現(xiàn)的第一個完整的膜蛋白，可有效調(diào)節(jié)血腦屏障功能[17-18]。Mfsd2a特異性表達(dá)于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜，通過介導(dǎo)血腦屏障的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和抑制腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞吞調(diào)控血腦屏障通透性，是血腦屏障的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[19-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織中Mfsd2a和Occludin蛋白表達(dá)量明顯降低，且電鏡和伊文思藍(lán)結(jié)果驗(yàn)證慢性腦缺血大鼠存在血腦屏障破壞，表現(xiàn)為通透性增加；通竅益智顆粒各組血腦屏障結(jié)構(gòu)有所修復(fù)，通透性降低，海馬組織中Mfsd2a及Occludin蛋白表達(dá)量均明顯增高，提示通竅益智顆粒具有降低血管性癡呆大鼠血腦屏障通透性，保護(hù)血腦屏障的作用。

慢性腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)血管單元受損，會出現(xiàn)血管性癡呆等一系列變化[4]，而促進(jìn)血管新生是改善腦灌注、恢復(fù)神經(jīng)血管單元功能的有效方法[21]，新生血管也可引導(dǎo)神經(jīng)再生，并能為膠質(zhì)細(xì)胞以及損傷神經(jīng)元的修復(fù)、突觸重建等創(chuàng)造適宜的環(huán)境。Angiopoietin /Tie2信號通路是主要的血管生成通路，對于血管生成和重建、正常的血管成熟和穩(wěn)定等過程至關(guān)重要[22-23]。正常情況下，神經(jīng)血管單元中周細(xì)胞釋放Ang-1，激活內(nèi)皮細(xì)胞上的Tie2受體并促使其磷酸化，促進(jìn)血管新生及完整；缺氧會促進(jìn)Ang-2生成，與Ang-1競爭性結(jié)合Tie2受體，其與血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的相互作用，可能啟動血管新生[24]。病理性血管生成反應(yīng)是對腦血流量不足的代償，但這種有限的代償不足以改善神經(jīng)血管單元缺血損害以及永久性缺血后神經(jīng)元的損失和認(rèn)知功能的損傷[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬微血管密度及海馬組織中 Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白表達(dá)量均較假手術(shù)組增高，說明腦缺血后存在一定程度血管新生；通竅益智顆粒中、高劑量組海馬區(qū)微血管密度及海馬組織中Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白表達(dá)量均明顯高于模型組，說明通竅益智顆?？捎绊慉ngiopoietin /Tie2信號通路，明顯促進(jìn)血管新生，從而改善神經(jīng)血管單元功能。

血管性癡呆屬于中醫(yī)學(xué)“癡呆”“善忘”范疇，認(rèn)為其病位在腦，是本虛標(biāo)實(shí)之證。歷代醫(yī)家多從補(bǔ)腎填精、化痰通絡(luò)、活血化瘀、醒腦開竅等角度組方用藥[26]，取得了一定療效，但對于癡呆的中醫(yī)微觀病機(jī)和治法研究甚少。本課題組繼承全國名老中醫(yī)王明杰教授學(xué)術(shù)思想，提出微觀腦玄府是氣血升降出入的場所，“神識”的產(chǎn)生依賴于氣血正常交互。腦為髓海，元神之府，神機(jī)的正常交互得益于氣機(jī)通利；而在神經(jīng)血管單元中，血腦屏障和微循環(huán)結(jié)構(gòu)和功能的完整可保證神經(jīng)元對氧、糖的攝取利用。同時，玄府自身功能同樣需要?dú)庋獫B溉，而血腦屏障通過胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)等過程維持其選擇性通透需要正常的能量代謝。玄府郁閉，氣血津液運(yùn)行阻滯，一則神機(jī)失去物質(zhì)基礎(chǔ)無以化生，二則神機(jī)交互失所，故表現(xiàn)為呆癥；而慢性腦低灌注引起的腦血流量降低、血腦屏障損傷，導(dǎo)致腦代謝降低是血管性癡呆的典型病理生理表現(xiàn)。因此課題組認(rèn)為腦玄府郁閉是血管性癡呆的基礎(chǔ)和核心環(huán)節(jié)。

“巔頂之上，唯風(fēng)藥可及”，風(fēng)藥上行下達(dá)，徹內(nèi)徹外，是開通玄府效果最為明顯的一類藥物。課題組針對血管性癡呆重用風(fēng)藥，輔以蟲類藥，契合“風(fēng)邪留于經(jīng)絡(luò)，須以蟲蟻搜剔”的原則，組方通竅益智、補(bǔ)虛達(dá)神，開通郁閉之腦，以開通玄府為先，既不違背中醫(yī)整體觀和辨證論治的大綱，同時針對癡呆的微觀病機(jī)即玄府郁閉進(jìn)行干預(yù)，前期研究證實(shí)可改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力，抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[27-28]。通過臨床用藥和前期研究的優(yōu)化調(diào)整，本研究所用通竅益智顆粒組方中重用葛根為君，取其輕靈透達(dá)、升發(fā)宣通之性，開通玄府；蟲藥地龍、水蛭及川芎為臣，共助氣血調(diào)暢、玄府開通；以黃芪、人參、靈芝為佐，使氣血充沛，支撐玄府運(yùn)轉(zhuǎn)通達(dá)；使以石菖蒲，達(dá)芳香化痰、引諸藥入腦之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，上述諸藥可能具有改善慢性腦缺血、保護(hù)血腦屏障、抑制腦細(xì)胞凋亡、減輕炎癥和再灌注腦組織損傷的作用[29-33]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，通竅益智顆粒改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知障礙可能與修復(fù)血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能障礙，促進(jìn)血管新生，增加腦灌注，從而改善神經(jīng)血管單元功能有關(guān)，但針對神經(jīng)血管單元以及血腦屏障具體各組分作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)仍有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。