高 仁 田時祎 汪 晶 朱偉云

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，國家動物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心，南京 210095)

眾所周知，腸道菌群在調(diào)節(jié)宿主腸道功能和腸道健康中起著十分重要的作用[1-2]。腸道微生物群落的定植始于生命早期，出生后的第1周為腸道微生物群落定植的關(guān)鍵時期[3]。而在生命早期，所攝入營養(yǎng)成分的變化可以有效地影響哺乳期幼體的腸道菌群組成[4]，因此，在生命早期通過營養(yǎng)干預(yù)的手段來獲得更佳的腸道微生態(tài)環(huán)境，對于仔豬的腸道健康和后續(xù)的生長發(fā)育都具有重要意義。

低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides，GOS)是一種具有天然屬性的功能性寡糖，在人母乳中含量較為豐富，在動物乳汁中僅微量存在[5]。作為一種常見的益生元，由于其結(jié)構(gòu)特性，GOS在小腸中不易被消化水解，而是進(jìn)入后腸被微生物利用，促進(jìn)有益菌的大量增殖，有助于腸道微生態(tài)的穩(wěn)定，因此GOS越來越受到人們的關(guān)注[6]。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁最外層由脂質(zhì)和多糖構(gòu)成的物質(zhì)，是一種強(qiáng)烈的炎癥刺激物[7]。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，LPS主要通過誘導(dǎo)信號級聯(lián)反應(yīng)最終激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)，從而促進(jìn)一系列炎癥因子分泌增多，包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)等，造成腸道產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[8]。因此，目前，使用LPS刺激構(gòu)建動物腸道炎癥損傷模型是一種常用手段[9]。根據(jù)以往的研究報(bào)道，GOS已被證明可以改善仔豬的生長性能和腸道健康，但GOS在腸道炎癥損傷模型中的作用尚不清楚[10-12]。目前，GOS在飼料添加劑中還未得到廣泛使用。因此，研究GOS對LPS刺激哺乳仔豬腸道健康的影響可以為GOS作為仔豬飼料添加劑的開發(fā)和利用提供更有力的理論支持。

隨著對腸道微生物的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)仔豬腸道微生物與仔豬腸道健康和腸道功能之間存在著密切聯(lián)系[13]。因此，研究人員更加關(guān)注于通過調(diào)節(jié)仔豬腸道微生物來促進(jìn)仔豬的腸道功能和維持腸道健康。目前，GOS已在一些動物試驗(yàn)上取得了初步成效。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，早期GOS干預(yù)可以通過調(diào)節(jié)哺乳仔豬的腸道微生物群來發(fā)揮有益作用，包括改善腸道炎癥狀態(tài)和維持腸道屏障功能。但GOS在LPS刺激誘導(dǎo)的仔豬腸道炎癥損傷模型中的作用尚不清楚。因此，本試驗(yàn)旨在研究GOS是否可以調(diào)節(jié)LPS刺激哺乳仔豬的盲腸微生物區(qū)系，改善腸道炎癥和屏障功能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用GOS為食品級，購于量子高科(中國)生物股份有限公司。LPS來源于大腸桿菌(E.coli)055∶B5，購于美國Sigma-Aldrich公司，純度≥99%。

1.2 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取2窩新生的“杜×長×大”哺乳仔豬，每窩9頭，初始體重為(1.57±0.05) kg。將每窩仔豬分為3個組，分別為對照組(CON組)、LPS刺激組(LPS-CON組)和GOS添加組(LPS-GOS組)，每組3頭。在進(jìn)行研究之前，參考了一些先前的研究，以確保GOS的濃度安全有效。在先前的研究中，Pan等[15]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠每天喂食1 g/kg BW的GOS可以增加小鼠的盲腸總重和壁重；但Anthony等[16]研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠每天喂食2.5或5.0 g/kg BW的GOS會降低大鼠的攝食量。此外，在本實(shí)驗(yàn)室先前的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)每天給哺乳仔豬喂食1 g/kg BW的GOS可以提高哺乳仔豬的生長性能，調(diào)節(jié)仔豬腸道微生物區(qū)系和改善腸道功能[12,14]。因此，綜合考慮之前研究中使用的GOS濃度，本研究使用的GOS濃度為1 g/kg BW。從出生后第1天開始，LPS-GOS組的仔豬每天灌喂1 g/kg BW的GOS溶液，對照組和LPS-CON組的仔豬則灌喂等量的無菌生理鹽水，連續(xù)灌喂13 d。第14天，LPS-CON組和LPS-GOS組的仔豬腹腔注射80 μg/kg BW的LPS溶液，對照組的仔豬注射等量的無菌生理鹽水。腹腔注射LPS溶液或無菌生理鹽水2 h后，對仔豬進(jìn)行屠宰取樣。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在湖北省恩施市大石堡農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社豬場完成。試驗(yàn)期間仔豬由母豬照料，自由采食母乳和飲水。灌喂GOS溶液或無菌生理鹽水時使用無菌醫(yī)用注射器將溶液緩慢注入仔豬口腔，避免操作損傷仔豬。衛(wèi)生防疫、斷尾、免疫等操作按照豬場相關(guān)規(guī)章制度進(jìn)行。

1.4 樣品采集

腹腔注射LPS溶液或無菌生理鹽水2 h后進(jìn)行屠宰采樣，將仔豬解剖后分離盲腸，收集盲腸食糜置于無菌凍存管中并存于-80 ℃液氮中直至分析。將盲腸組織用預(yù)冷的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行沖洗，清洗干凈后用無菌載玻片刮取盲腸黏膜并保存于-80 ℃液氮中直至分析。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 盲腸食糜微生物16S rRNA測序

1.5.2 生物信息學(xué)分析

將測序得到的序列按照重疊關(guān)系進(jìn)行拼接，同時對序列進(jìn)行質(zhì)控和過濾。使用Usearch 7.0.1090(http://www.drive5.com/uparse/)將操作分類單元(OTU)以97%的一致性進(jìn)行OTU聚類。為了得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier 2.2 (http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)比對，比對的數(shù)據(jù)庫為Sliva 132(http://www.arb-silva.de)，物種分類比對的置信度值是70%。使用Mothur1.30.2(https://www.mothur.org/wiki/Download_mothur)分析盲腸食糜微生物群的α多樣性指數(shù)，包括Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)。用R 3.5.1軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)，并對樣品進(jìn)行相似性分析(ANOSIM)以評估樣本間的顯著差異。

1.5.3 盲腸食糜pH測定

在解剖盲腸采集樣品過程中，用滅菌的離心管收集結(jié)腸食糜后立即用pH計(jì)(pb-10，Sartorius Group，德國)測定pH。

1.5.4 盲腸食糜微生物代謝物測定

根據(jù)Shi等[17]所描述的方法，使用氣相色譜法測定盲腸食糜中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和總短鏈脂肪酸含量。使用乳酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)并按其操作說明測定盲腸食糜中乳酸含量。

1.5.5 盲腸黏膜細(xì)胞因子含量測定

稱取0.1 g盲腸黏膜組織，加入1 000 μL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液后用勻漿機(jī)粉碎提取總蛋白。粉碎后的組織在4 ℃條件下以10 000 r/min離心15 min，然后吸取上層清液備用。提取總蛋白后，用BCA蛋白檢測試劑盒(白鯊生物科技有限公司)測定蛋白濃度，然后用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(R&D Systems Inc.，美國)測定盲腸黏膜中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、TNF-α和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)含量。

1.5.6 盲腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá)測定

稱取0.1 g盲腸黏膜組織，加入900 μL含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液(菲爾特生物技術(shù)有限公司)，然后4 ℃勻漿，將組織徹底破碎。接著將勻漿液12 000×g、4 ℃離心15 min。吸取上清液用于蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測。提取總蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒(白鯊生物科技有限公司)測定蛋白濃度。將濃度歸一化后，煮沸蛋白，然后用12%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白。接著將蛋白印跡轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。隨后，用含5%脫脂奶粉的1×Tris-buffered saline-Tween(TBST)緩沖液在室溫下封閉膜1 h，然后用一抗在4 ℃下孵育過夜。使用的特異性一抗包括β-肌動蛋白(β-actin)(Cell Signaling Technology，美國)，閉合小環(huán)蛋白-1(ZO-1)、閉鎖蛋白(occludin)和閉合蛋白-1(claudin-1)(Proteintech Group，美國)。過夜后，將膜用1×TBST清洗3次，每次10 min，然后用Antirabbit IgG HRP-conjugated二抗(Cell Signaling Technology，美國)在常溫下孵育1 h，孵育完成后再次用1×TBST清洗3次，每次10 min。最后，按1∶1的比例配制顯影發(fā)光液，現(xiàn)用現(xiàn)配并在避光環(huán)境下操作，然后在曝光機(jī)中顯影記錄條帶。用Image J 1.8.0軟件處理目的條帶測量灰度值，目標(biāo)蛋白的蛋白表達(dá)水平為目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2016對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，隨后利用SPSS 20.0對其進(jìn)行單因素方差分析，選用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。各組數(shù)據(jù)表示為平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05≤P<0.10表示具有趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 GOS對LPS刺激哺乳仔豬盲腸食糜微生物多樣性的影響

如表1所示，盲腸食糜微生物α多樣性指數(shù)結(jié)果表明，LPS-GOS組的Shannon指數(shù)有高于LPS-CON組的趨勢(P=0.051)，各組之間Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)沒有顯著差異(P>0.05)。

表1 GOS對LPS刺激哺乳仔豬盲腸食糜微生物α多樣性的影響Table 1 Effects of GOS on cecal digesta microbial α diversity of suckling piglets stimulated by LPS (n=6)

如圖1所示，PCA結(jié)果表明，3個組的微生物區(qū)系顯示出明顯的聚類。

圖1 盲腸食糜微生物區(qū)系PCAFig.1 PCA of cecal digesta microbiota

2.2 GOS對LPS刺激哺乳仔豬盲腸食糜微生物結(jié)構(gòu)的影響

如圖2所示，通過對盲腸食糜微生物進(jìn)行16S rRNA測序發(fā)現(xiàn)，在門水平上，厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)是3組盲腸食糜中主要的優(yōu)勢菌群，其次是變形菌門(Proteobacteria)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、螺旋體門(Spirochaetes)和梭桿菌門(Fusobacteria)。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Proteobacteria：變形菌門；Synergistetes：互養(yǎng)菌門；Actinobacteria：放線菌門；Spirochaetes：螺旋體門；Fusobacteria：梭桿菌門；Others：其他。圖2 GOS對LPS刺激哺乳仔豬盲腸食糜 微生物在門水平組成的影響Fig.2 Effects of GOS on cecal digesta microbial composition at phylum level of suckling piglets stimulated by LPS (n=6)

如圖3所示，與LPS-CON組相比，LPS-GOS組盲腸食糜中厚壁菌門的相對豐度顯著提高(P<0.05)。

#表示與LPS-CON組相比差異顯著(P<0.05)。# mean significant difference compared with the LPS-CON group (P<0.05).圖3 GOS對LPS刺激哺乳仔豬盲腸 食糜厚壁菌門的差異影響Fig.3 Differential effects of GOS on Firmicutes in cecal digesta of LPS-stimulated suckling piglets (n=6)

如圖4所示，在屬水平上，將在所有樣本中相對豐度占比均小于1%的菌屬歸為其他(others)，乳桿菌屬(Lactobacillus)、未分類的擬桿菌門S24-7菌科(norank_f_Muribaculaceae)、狹窄梭菌屬1(Clostridium_sensu_stricto_1)、大腸桿菌賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)和糞桿菌真核菌群([Eubacterium]_coprostanoligenes_group)是3組盲腸食糜中主要的優(yōu)勢菌屬。

如圖5所示，與對照組相比，LPS-CON組盲腸食糜中瘤胃球菌科NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)和普雷沃氏菌科NK3B31群(Prevotellaceae_NK3B31_group)的相對豐度極顯著降低(P<0.01)，乳桿菌屬(Lactobacillus)(P=0.054)和未分類的毛螺菌科(unclassified_f_Lachnospiraceae)(P=0.051)的相對豐度有降低趨勢。與LPS-CON組相比，LPS-GOS組盲腸食糜中糞桿菌真核菌群和糞桿菌屬(Faecalibacterium)的相對豐度極顯著提高(P<0.01)，考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、普氏菌屬2(Prevotella_2)和毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)的相對豐度顯著提高(P<0.05)。

2.3 GOS對LPS刺激哺乳仔豬盲腸食糜pH和微生物代謝產(chǎn)物含量的影響

如表2所示，與對照組相比，LPS-CON組盲腸食糜pH有升高的趨勢(P=0.052)，而LPS-GOS組仔豬盲腸食糜pH顯著低于LPS-CON組(P<0.05)。與對照組相比，LPS-CON組盲腸食糜中乙酸、丁酸、總短鏈脂肪酸以及乳酸含量顯著降低(P<0.05)。與LPS-CON組相比，LPS-GOS組盲腸食糜中乙酸含量顯著升高(P<0.05)，丁酸和總短鏈脂肪酸含量極顯著升高(P<0.01)。

表2 GOS對LPS刺激哺乳仔豬盲腸食糜pH和微生物代謝產(chǎn)物含量的影響Table 2 Effects of GOS on cecal digesta pH and microbial metabolites contents of suckling piglets stimulated by LPS (n=6)

續(xù)表2項(xiàng)目Items組別 GroupsCON LPS-CONLPS-GOSSEMP值P-value異戊酸 Isovalerate/(μmol/g)2.41 2.70 2.48 0.14 0.700 戊酸 Valerate/(μmol/g)2.95 2.95 2.64 0.12 0.502 總短鏈脂肪酸 Total SCFAs/(μmol/g)61.90Ba56.44Bb64.85Aa1.10 0.001 乳酸 Lactate/(μmol/g)1.75a 1.38b1.52ab0.06 0.041

2.4 GOS對LPS刺激哺乳仔豬盲腸黏膜細(xì)胞因子含量的影響

如表3所示，與對照組相比，LPS-CON組盲腸黏膜中IL-1β和TNF-α含量極顯著升高(P<0.01)，IL-6和IL-8含量顯著升高(P<0.05)。與LPS-CON組相比，LPS-GOS組盲腸黏膜中IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著降低(P<0.05)。各組之間盲腸黏膜中IL-10和TGF-β含量無顯著差異(P>0.05)。

表3 GOS對LPS刺激哺乳仔豬盲腸黏膜細(xì)胞因子含量的影響Table 3 Effects of GOS on cecal mucosa cytokine contents of suckling piglets stimulated by LPS (n=6) pg/μg prot

2.5 GOS對LPS刺激哺乳仔豬盲腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與對照組相比，LPS-CON組盲腸黏膜中claudin-1的蛋白表達(dá)水平極顯著降低(P<0.05)，ZO-1的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，occludin的蛋白表達(dá)水平有降低的趨勢(P=0.088)。與LPS-CON組相比，LPS-GOS組盲腸黏膜中claudin-1的蛋白表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)，ZO-1的蛋白表達(dá)水平有提高的趨勢(P=0.075)。

圖6 GOS對LPS刺激哺乳仔豬盲腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of GOS on expression of tight junction proteins in cecal mucosa of suckling piglets stimulated by LPS

3 討 論

仔豬在出生后第1周是腸道微生物群落定植的關(guān)鍵時期，并且腸道菌群在宿主腸道內(nèi)的定植和演替是影響新生兒建立特定微生物群組成和塑造表型的關(guān)鍵因素[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物在很大程度上影響了宿主的先天性免疫功能與適應(yīng)性免疫功能的發(fā)育以及腸道屏障功能的穩(wěn)態(tài)[18]。盲腸作為機(jī)體內(nèi)微生物發(fā)酵的重要場所，其中微生物的數(shù)量遠(yuǎn)超前腸[19]。腹腔注射LPS會引起仔豬腸道炎癥，破壞仔豬腸道屏障功能，已被廣泛用于構(gòu)建仔豬腸道炎癥損傷模型[9]。由于腸道菌群和腸道炎癥以及屏障功能之間存在密切的聯(lián)系，因此，在本研究中，我們著重關(guān)注GOS對LPS刺激哺乳仔豬盲腸微生物群、腸道炎癥和屏障功能的影響，并且探討它們之間可能存在的聯(lián)系。本試驗(yàn)中，LPS-GOS組中盲腸食糜微生物Shannon指數(shù)高于LPS-CON組。通常情況下，Shannon指數(shù)常被用于衡量環(huán)境內(nèi)的微生物多樣性，腸道內(nèi)高水平的微生物多樣性有利于腸道的健康，因?yàn)樵谀c道受到體外應(yīng)激時，高水平的微生物多樣性有助于維持腸道生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和抵抗性[20]。如，早期使用抗生素會降低人類嬰兒腸道微生物多樣性，并導(dǎo)致其在學(xué)齡期患過敏性疾病和哮喘的風(fēng)險(xiǎn)增高[21]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示GOS提高了LPS刺激哺乳仔豬的盲腸微生物多樣性，這表明GOS有利于維持仔豬腸道健康，降低患病風(fēng)險(xiǎn)。

Lactobacillus：乳桿菌屬；norank_f_Muribaculaceae：未分類的擬桿菌門S24-7菌科；Clostridium_sensu_stricto_1：狹窄梭菌屬1；Escherichia-Shigella：大腸桿菌賀氏菌屬；[Eubacterium]_coprostanoligenes_group：糞桿菌真核菌群；Cloacibacillus：氯酸桿菌屬；unclassified_f_Prevotellaceae：未分類的普雷沃氏菌科；Olsenella：歐陸森氏菌屬；Prevotellaceae_NK3B31_group：普雷沃氏菌科NK3B31群；Bacteroides：擬桿菌屬；Veillonell：韋榮球菌屬；Christensenellaceae_R-7_group：克里斯滕森菌科R-7群；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研氏菌科RC9腸道群；Parabacteroides：副擬桿菌屬；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Alloprevotella：擬普雷沃氏菌屬；Ruminococcaceae_UCG-002：瘤胃球菌科UCG-002菌屬；Ruminococcaceae_NK4A214_group：瘤胃球菌科NK4A214群；Fusobacterium：梭菌屬；Romboutsia：羅姆布茨菌屬；Sphaerochaeta：螺旋體屬；Faecalibacterium：糞桿菌屬；Lachnoclostridium：腔隙桿菌屬；Family_ⅩⅡ_AD3011_group：ⅩⅡ_AD3011族群；Blautia：布勞特氏菌屬；Terrisporobacter：土孢桿菌屬；Megasphaera：巨球型菌屬；Treponema_2：密螺旋體屬_2；Dorea：多雷亞菌屬；Actinobacillus：放線桿菌屬；Prevotellaceae_UCG-003：普雷沃氏菌科UCG-003菌屬；Ruminococcaceae_UCG-005：瘤胃球菌科UCG-005菌屬；Mogibacterium：艱難桿菌屬；[Eubacterium]_nodatum_group：纏結(jié)真桿菌屬；Ruminococcus_2：瘤胃球菌屬2；Prevotella_7：普氏菌屬7；unclassified_f_Lachnospiraceae：未分類的毛螺菌科；Lachnospiraceae_NK4A136_group：毛螺菌科NK4A136群；Prevotella_2：普氏菌屬2。圖4 GOS對LPS刺激哺乳仔豬盲腸食糜微生物在屬水平組成的影響Fig.4 Effects of GOS on cecal digesta microbial composition at genus level of suckling piglets stimulated by LPS (n=6)

GOS作為一種益生元，已有研究發(fā)現(xiàn)它可以改變大鼠和仔豬的腸道微生物組成[22-23]。在本試驗(yàn)中，3組哺乳仔豬盲腸食糜中最主要的優(yōu)勢菌門是厚壁菌門和擬桿菌門，這與趙方舟等[24]的研究結(jié)果一致。與LPS-CON組相比，LPS-GOS組哺乳仔豬盲腸食糜中厚壁菌門的的相對豐度更高，厚壁菌門相對豐度的提高對于腸道健康有益，因?yàn)楹癖诰T包含大量的短鏈脂肪酸產(chǎn)生細(xì)菌，如產(chǎn)丁酸細(xì)菌直腸真桿菌(Eubacteriumrectale)和霍氏真桿菌(Eubacteriumhallii)[25]。由此可見，早期GOS干預(yù)提高了LPS刺激哺乳仔豬盲腸中厚壁菌門的相對豐度，有助于提高仔豬盲腸中短鏈脂肪酸含量。

Lactobacillus：乳桿菌屬；Prevotellaceae_NK3B31_group：普雷沃氏菌科NK3B31群；Ruminococcaceae_NK4A214_group：瘤胃球菌科NK4A214群；unclassified_f_Lachnospiraceae：未分類的毛螺菌科；[Eubacterium]_coprostanoligenes_group：糞桿菌真核菌群；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Prevotella_2：普氏菌屬2；Lachnospiraceae_NK4A136_group：毛螺菌科NK4A136群；Faecalibacterium：糞桿菌屬。*表示與CON組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與CON組相比差異極顯著(P<0.01)；#表示與LPS-CON組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與LPS-CON組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。* mean significant difference compared with the CON group (P<0.05), and ** mean extremely significant difference compared with the CON group (P<0.01); # mean significant difference compared with the LPS-CON group (P<0.05), and ## mean extremely significant difference compared with the LPS-CON group (P<0.01). The same as below.圖5 GOS對LPS刺激哺乳仔豬盲腸食糜微生物組成在屬水平的差異影響Fig.5 Differential effects of GOS on cecal digesta microbial composition at genus level of suckling piglets stimulated by LPS (n=6)

進(jìn)一步分析盲腸食糜微生物在屬水平上的變化，發(fā)現(xiàn)LPS刺激降低了乳桿菌屬的相對豐度。作為一種常見的益生菌，乳桿菌屬在仔豬出生后不久就會在腸道內(nèi)定植并成為整個腸道微生態(tài)環(huán)境中穩(wěn)定的一員[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬可以通過下調(diào)一些炎癥因子如TNF-α來緩解結(jié)腸炎模型大鼠的腸道炎癥反應(yīng)[27]。此外，乳桿菌屬可以與彎曲桿菌等病原菌爭奪黏膜結(jié)合位點(diǎn)來防止腸道病原體感染，保護(hù)腸道健康[28]。因此，LPS對于乳桿菌屬的抑制在一定程度不利于腸道的健康，并且可能加重LPS的刺激作用。而在LPS-GOS組中，未發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬的相對豐度發(fā)生顯著變化，表明了GOS可以維持LPS刺激哺乳仔豬盲腸中乳桿菌屬的穩(wěn)定，從而有利于仔豬的腸道健康。此外，LPS刺激主要造成了短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌包括瘤胃球菌科NK4A214菌群、普雷沃氏菌科NK3B31菌群和未分類的毛螺菌科相對豐度的降低。與LPS-CON組相比，LPS-GOS組哺乳仔豬盲腸食糜中則顯示出更高相對豐度的糞桿菌真核菌群。研究發(fā)現(xiàn)，糞桿菌真核菌群是一種厭氧菌，可以催化膽固醇轉(zhuǎn)化為糞甾醇，具有降低膽固醇的作用[29-30]。此外，有研究報(bào)道，糞便中糞桿菌真核菌群的相對豐度與仔豬的腹瀉發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)[31]。因此，糞桿菌真核菌群可能是腸道內(nèi)具有一定益處的細(xì)菌，而GOS對它生長增殖的促進(jìn)作用可能有利于維持LPS刺激仔豬的腸道微生態(tài)穩(wěn)定。除此之外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與LPS-CON組相比，LPS-GOS組中短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌考拉桿菌屬、普氏菌屬2、毛螺菌科NK4A136群和糞桿菌屬的相對豐度顯著提高。因此，GOS改變了LPS刺激哺乳仔豬的盲腸菌群組成，通過提高糞桿菌真核菌群和短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的相對豐度在一定程度上有利于維持仔豬的腸道健康。

短鏈脂肪酸、乳酸、膽汁酸等是腸道微生物的主要代謝產(chǎn)物，能將腸道微生物與宿主的各項(xiàng)生理功能和免疫反應(yīng)建立密切的聯(lián)系[32]。從上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS刺激以及GOS添加對于短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌產(chǎn)生了較大的影響，因此，本試驗(yàn)進(jìn)一步分析了盲腸中微生物代謝產(chǎn)物含量的變化，結(jié)果表明，與對照組相比，LPS-CON組哺乳仔豬盲腸食糜中乙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸含量顯著降低，這可能主要是因?yàn)長PS刺激降低了盲腸中瘤胃球菌科NK4A214菌群、普雷沃氏菌科NK3B31菌群和未分類的毛螺菌科的相對豐度，而這些細(xì)菌可以分解膳食中纖維多糖和低聚糖等成分，產(chǎn)生乙酸和丁酸等短鏈脂肪酸[33-35]。而與LPS-CON組相比，LPS-GOS組哺乳仔豬盲腸食糜中乙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸含量極顯著升高，這可能是由于GOS提高了短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌考拉桿菌屬、普氏菌屬2、毛螺菌科NK4A136菌群和糞桿菌屬的相對豐度，進(jìn)而增加了盲腸中短鏈脂肪酸含量[35-36]。短鏈脂肪酸是調(diào)節(jié)宿主腸道功能和腸道免疫的關(guān)鍵因子，對宿主有多種有益作用，包括維持腸道水平屏障功能和抗炎作用[37]。值得注意的是，乙酸在腸道中不僅可以發(fā)揮抗炎作用，而且在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道中乙酸含量的提高可以抑制大腸桿菌毒素從腸腔內(nèi)轉(zhuǎn)移到血液中，改善小鼠腸道上皮細(xì)胞介導(dǎo)的腸道免疫，保護(hù)宿主的腸道健康[38]。丁酸是大腸上皮細(xì)胞的主要能量來源，參與腸道上皮細(xì)胞的修復(fù)和再生，對維持腸道屏障功能并抑制炎癥十分重要[39]。Yan等[40]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸通過調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞能量狀態(tài)，促進(jìn)腸上皮緊密連接蛋白的表達(dá)，對LPS刺激導(dǎo)致的腸上皮損傷具有保護(hù)作用。因此，GOS通過提高盲腸食糜中的乙酸和丁酸等短鏈脂肪酸含量，可能有助于改善LPS刺激的哺乳仔豬的腸道屏障功能和腸道健康。此外，與對照組相比，LPS刺激降低了哺乳仔豬盲腸食糜中乳酸含量，這與盲腸食糜中乳酸桿菌相對豐度的降低結(jié)果一致。Neal-Mckinney等[41]研究指出，乳酸是減少牲畜病原菌彎曲桿菌生長的重要因素。因此，LPS刺激造成了乳酸含量的下降可能導(dǎo)致病原體的快速入侵，從而損害腸道健康。但在LPS-GOS組中，并未發(fā)現(xiàn)LPS刺激導(dǎo)致盲腸食糜中乳酸含量發(fā)生顯著變化，因此GOS對于LPS刺激哺乳仔豬乳酸含量的維持作用在一定程度上有利于仔豬的腸道健康。隨著LPS刺激后盲腸中短鏈脂肪酸和乳酸含量的降低，以及LPS-GOS組中短鏈脂肪酸和乳酸含量的升高，本試驗(yàn)相對應(yīng)地發(fā)現(xiàn)LPS-CON組與對照組相比盲腸食糜pH提高，而LPS-GOS組與LPS-CON組相比盲腸食糜pH降低。pH是反映腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要指標(biāo)，較低的pH意味著盲腸內(nèi)酸性環(huán)境的維持，這有利于抵御病原體入侵，抑制大腸桿菌和沙門氏菌等潛在致病菌的生長與定植[42]。因此，GOS可以通過提高LPS刺激哺乳仔豬盲腸中微生物代謝產(chǎn)物含量來發(fā)揮對腸道的有益作用，同時，GOS降低了LPS刺激哺乳仔豬盲腸的pH，有利于維持盲腸內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

基于短鏈脂肪酸的抗炎作用，本試驗(yàn)進(jìn)一步分析了盲腸的炎癥狀態(tài)，結(jié)果表明，LPS刺激顯著提高了哺乳仔豬盲腸黏膜中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量，對于抑炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β含量沒有產(chǎn)生顯著影響，這在一定程度上表明了LPS刺激造成了仔豬盲腸炎癥反應(yīng)。但與LPS-CON組相比，LPS-GOS組哺乳仔豬盲腸黏膜中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量顯著降低，表明了GOS對LPS刺激造成的盲腸炎癥具有緩解作用。研究發(fā)現(xiàn)，LPS主要通過信號級聯(lián)反應(yīng)最終激活NF-κB，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子分泌增多，從而誘導(dǎo)腸道炎癥反應(yīng)[8]。而Meijer等[43]研究報(bào)道，短鏈脂肪酸可以通過抑制NF-κB的激活來下調(diào)炎癥細(xì)胞因子的分泌。此外，短鏈脂肪酸已被證明在腸道內(nèi)可以發(fā)揮抗炎活性。因此，GOS可以緩解LPS刺激哺乳仔豬的盲腸炎癥，這可能主要與GOS提高了盲腸中短鏈脂肪酸的含量有關(guān)。

腸道微生物及其代謝產(chǎn)物以及腸道炎癥和腸道屏障功能之間都存在密切聯(lián)系。有研究報(bào)道，IL-1β、IL-6、IL-8可以通過重組腸道上皮緊密連接蛋白來降低腸道屏障功能，而TNF-α則會顯著破壞腸上皮細(xì)胞之間的緊密連接[44]。這可能解釋了為何LPS刺激造成了緊密連接蛋白claudin-1、occludin和ZO-1的蛋白表達(dá)水平降低。緊密連接是構(gòu)成仔豬腸道屏障功能的重要組分，其蛋白表達(dá)水平的降低直接削弱了腸道的屏障功能，容易導(dǎo)致病原體和大分子物質(zhì)如內(nèi)毒素不受調(diào)控地進(jìn)入腸黏膜進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致局部或全身炎癥[45]。有研究報(bào)道，給仔豬補(bǔ)充乳酸桿菌等益生菌可以提高仔豬腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，改善大腸桿菌攻毒仔豬的腸道屏障功能[46]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路來增強(qiáng)腸道屏障功能[47]。因此，早期GOS干預(yù)提高了LPS刺激哺乳仔豬盲腸中緊密連接蛋白的表達(dá)，改善了仔豬的腸道屏障功能，這可能與GOS改善了LPS刺激哺乳仔豬盲腸微生物組成、提高了短鏈脂肪酸的含量和緩解了盲腸炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果表明了GOS可以調(diào)節(jié)LPS刺激哺乳仔豬的盲腸微生物群組成，并且提高了盲腸食糜中短鏈脂肪酸含量，降低了盲腸pH，維持了健康的盲腸內(nèi)環(huán)境。此外，GOS對盲腸微生物和短鏈脂肪酸的調(diào)節(jié)作用有利于緩解LPS刺激造成的腸道炎癥反應(yīng)和維持LPS刺激哺乳仔豬的腸道屏障功能。

4 結(jié) 論

① 早期GOS干預(yù)調(diào)節(jié)了LPS刺激哺乳仔豬的盲腸微生物群組成，并且提高了盲腸食糜中短鏈脂肪酸含量，降低了盲腸pH，有利于維持盲腸健康的內(nèi)環(huán)境。

② 早期GOS干預(yù)降低了LPS刺激哺乳仔豬盲腸黏膜中促炎細(xì)胞因子含量，有利于緩解腸道炎癥反應(yīng)。

③ 早期GOS干預(yù)提高了LPS刺激哺乳仔豬盲腸黏膜中緊密連接的蛋白表達(dá)水平，有利于改善仔豬的腸道屏障功能。