王文文 王 園* 孟子琪 安曉萍 齊景偉

(1.內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018；2.內蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術研究中心，呼和浩特 010018；3.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院動物營養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特 010031)

瘤胃對于反芻動物消化吸收營養(yǎng)物質至關重要。瘤胃微生物會將飼料中的碳水化合物和蛋白質發(fā)酵，降解生成短鏈脂肪酸、氨基酸及維生素等物質[1-2]。這些營養(yǎng)物質通過瘤胃上皮被吸收，為機體供能[3]。瘤胃上皮除具有吸收代謝營養(yǎng)物質的作用外，還具有阻止細菌有害代謝產物(組胺、脂多糖)通過上皮細胞入血、保護瘤胃的作用[4-5]。因此，通過營養(yǎng)手段調控瘤胃菌群結構和瘤胃上皮屏障功能對改善瘤胃內環(huán)境和維持瘤胃健康具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，功能性多糖在調控瘤胃菌群結構和改善瘤胃發(fā)酵方面有積極作用。李穎[6]研究表明，猴頭菇多糖可通過調控瘤胃菌群結構和與酸代謝相關的酶活性進而緩解山羊瘤胃酸中毒，維持瘤胃健康。發(fā)酵麩皮多糖(fermented wheat bran polysaccharides，F(xiàn)WBPs)作為一種功能性多糖，具有抗氧化[7]、抗炎[8]及調節(jié)免疫[9]等多種作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)WBPs具有調節(jié)大鼠腸道菌群結構和提高腸道屏障功能的作用[9-10]。同時，F(xiàn)WBPs還可以優(yōu)化杜寒雜交肉羊瘤胃內環(huán)境，改善瘤胃發(fā)酵功能[11]。然而，目前關于FWBPs的研究主要集中于單胃動物上，其對反芻動物瘤胃菌群結構及瘤胃上皮屏障影響的研究未見報道。因此，本試驗擬研究FWBPs對杜寒雜交肉羊瘤胃組織緊密連接蛋白和細胞因子基因表達及瘤胃菌群結構的影響，以期為FWBPs應用于反芻動物生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 FWBPs的制備

參照史俊祥[12]的FWBPs制備方法。以小麥麩皮為原料，配以豆粕粉、玉米粉，三者比例為80.46∶9.32∶10.22；使用枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌混菌發(fā)酵，二者比例為6.7∶3.3；接種量10.4%，添加0.1%尿素，發(fā)酵溫度35.4 ℃，時間52.7 h，料水比1∶1。發(fā)酵結束后，將發(fā)酵底物45 ℃烘干48 h，粉碎。與蒸餾水1∶20混合后80 ℃水浴提取30 min，離心棄沉淀，上清液加入4倍體積的95%乙醇，靜置過夜，離心收集沉淀，干燥沉淀后即為FWBPs，經測定，其含量可達130.21 mg/g。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

試驗選取健康且體重[(21.85±0.64) kg]相近的6周齡杜寒雜交肉羊21只，隨機分為3個組，每組7只羊。對照組、低劑量組和高劑量組分別在基礎飼糧中添加0、200、400 mg/kg BW的FWBPs?；A飼糧根據《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T 816—2004)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1?；A飼糧為全混合顆粒飼料，直徑為6 mm，長度為10 mm。預試期14 d，正試期56 d。試驗在內蒙古農業(yè)大學實驗基地海流圖牧場進行，常規(guī)飼養(yǎng)管理，每日定時飼喂(08:00和17:00)，每天根據前1天的剩料量重新調整飼喂量，保證料槽中每天有10%左右的剩料，自由飲水。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.3 樣品采集

試驗結束后，屠宰所有羊只，采集未過濾瘤胃食糜2 mL和瘤胃組織，液氮速凍，并將樣品存于-80 ℃冰箱中待測。

1.4 瘤胃組織緊密連接蛋白和細胞因子基因表達的測定

采用Trizol法提取瘤胃組織總RNA。經微孔板分光光度計測得260和280 nm吸光度比值為1.8～2.0，瓊脂糖凝膠電泳法評價RNA質量。參照FastQant RT Kit(with gDNase)說明書分別將各樣品的總RNA進行逆轉錄合成cDNA，并以此為模板，使用表2所列的引物，按照SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)說明書進行實時熒光定量PCR檢測。以β-肌動蛋白(β-actin)為內參，干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素-12(interleukin-12，IL-12)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、閉合小環(huán)蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)、閉鎖蛋白(occludin)、閉合蛋白-1(claudin-1)及閉合蛋白-4(claudin-4)的mRNA相對表達量采用2-△△Ct法進行計算。引物由生工生物(上海)股份有限公司合成，基因引物序列信息見表2。

表2 基因引物序列信息Table 2 Information of primer sequences of genes

1.5 Illumina-Nova測序分析

1.5.1 瘤胃食糜總DNA的提取、擴增及測序

1.5.2 生物信息學分析

測序所得的原始序列，首先使用Flash V1.2.7軟件進行拼接，參照Qiime V1.7.0軟件進行質量控制，得到有效序列。利用Uparse v7.0.1001軟件對所有樣品的有效序列以97%的一致性進行操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類，用Mothur軟件與SILVA的SSUrRNA數(shù)據庫進行物種注釋分析(設定閾值為0.8～1.0)，在門水平、屬水平下統(tǒng)計每個樣品的菌群組成。各樣品的數(shù)據經過均一化處理后，采用Qiime軟件進行Alpha多樣性和Beta多樣性分析。通過線性判別分析(LDA)和線性判別分析效應大小(LEfSe)分析找出導致組間菌群變化的生物標志物。

1.6 統(tǒng)計分析

基因表達和菌群Alpha多樣性指標數(shù)據使用SAS 9.2軟件進行單因素方差分析，并進行Duncan氏法多重比較檢驗，試驗結果以平均值和均值標準誤(SEM)表示。菌群相對豐度數(shù)據使用SPSS 21.0進行非參數(shù)t檢驗分析，試驗結果以平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 FWBPs對杜寒雜交肉羊瘤胃組織中緊密連接蛋白基因表達的影響

由表3可知，與對照組相比，低劑量組和高劑量組肉羊瘤胃組織中occludin、claudin-1和claudin-4的mRNA相對表達量顯著增加(P<0.05)，且低劑量組和高劑量組之間無顯著差異(P>0.05)；此外，高劑量組肉羊瘤胃組織中ZO-1的mRNA相對表達量顯著增加(P<0.05)。

表3 FWBPs對杜寒雜交肉羊瘤胃組織中緊密連接蛋白基因表達的影響Table 3 Effects of FWBPs on expression of tight junction protein gene in rumen tissue of Dorper×thin-tailed Han crossbred meat lambs

2.2 FWBPs對杜寒雜交肉羊瘤胃組織中細胞因子基因表達的影響

由表4可知，各組之間肉羊瘤胃組織中IL-12和TNF-α的mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。高劑量組肉羊瘤胃組織中IFN-γ和IL-6的mRNA相對表達量顯著高于對照組和低劑量組(P<0.05)。

表4 FWBPs對杜寒雜交肉羊瘤胃組織中細胞因子基因表達的影響Table 4 Effects of FWBPs on expression of cytokine gene in rumen tissue of Dorper×thin-tailed Han crossbred meat lambs

2.3 FWBPs對杜寒雜交肉羊瘤胃菌群結構的影響

2.3.1 FWBPs對杜寒雜交肉羊瘤胃菌群Alpha多樣性指數(shù)的影響

由表5可知，對照組、低劑量組和高劑量組瘤胃菌群的測序覆蓋率為99.87%～99.88%。各組之間肉羊瘤胃菌群觀測物種數(shù)、Chao1指數(shù)及ACE指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。高劑量組肉羊瘤胃菌群Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著高于對照組和低劑量組(P<0.05)。

表5 FWBPs對杜寒雜交肉羊瘤胃菌群Alpha多樣性指數(shù)的影響Table 5 Effects of FWBPs on rumen microbiota Alpha diversity indexes of Dorper×thin-tailed Han crossbred meat lambs

2.3.2 FWBPs對杜寒雜交肉羊瘤胃菌群Beta多樣性的影響

由圖1可知，主成分1(PC1)的貢獻率為39.94%，主成分2(PC2)的貢獻率為25.75%。高劑量組與對照組和低劑量組瘤胃菌群結構有一定的差異，而對照組和低劑量組瘤胃菌群結構相似。

S3：低劑量組 low dose group；S4：高劑量組 high dose group；S5：對照組 control group。下圖同 the same as below。圖1 主成分分析圖Fig.1 PCA diagram

2.3.3 FWBPs對杜寒雜交肉羊瘤胃菌群相對豐度的影響

由表6可知，與對照組相比，低劑量組肉羊瘤胃菌群中螺旋菌門(Spirochaetota)的相對豐度顯著增加(P<0.05)；高劑量組肉羊瘤胃菌群中變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度顯著降低(P<0.05)，擬桿菌門(Bacteroidota)的相對豐度顯著增加(P<0.05)。高劑量組肉羊瘤胃菌群中Proteobacteria的相對豐度極顯著低于低劑量組(P<0.01)，Spirochaetota的相對豐度顯著低于低劑量組(P<0.05)；而Bacteroidota的相對豐度極顯著高于低劑量組(P<0.01)。

表6 瘤胃菌群在門水平的顯著性分析Table 6 Significance analysis of rumen microbiota at phylum level %

由表7可知，與對照組相比，低劑量組肉羊瘤胃菌群中琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio)的相對豐度顯著增加(P<0.05)；高劑量組肉羊瘤胃菌群中琥珀酸弧菌科_UCG-001(Succinivibrionaceae_UCG-001)的相對豐度極顯著降低(P<0.01)，解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)的相對豐度顯著降低(P<0.05)，新月形單胞菌屬(Selenomonas)的相對豐度顯著增加(P<0.05)。高劑量組肉羊瘤胃菌群中韋榮球菌科_UCG-001(Veillonellaceae_UCG-001)和Selenomonas的相對豐度極顯著高于低劑量組(P<0.01)，而Succinivibrionaceae_UCG-001的相對豐度極顯著低于低劑量組(P<0.01)。

表7 瘤胃菌群在屬水平的顯著性分析Table 7 Significance analysis of rumen microbiota at genus level %

LEfSe分析可以實現(xiàn)多個分組之間的比較，從而找到組間在相對豐度上有顯著差異且影響力較大的標記物種。由圖2可知，當LDA閾值設定為4.0時，柔膜菌目(Erysipelotrichales)、氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)、氨基酸球菌目(Acidaminococcales)、Succiniclasticum在對照組中富集；琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)、氣單胞菌目(Aeromonadales)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、Proteobacteria、Succinivibrionaceae_UCG-001在低劑量組中富集；Bacteroidota、擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌目(Bacteroidales)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、新月形單胞菌科(Selenomonadaceae)、棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella_ruminicola)、Selenomonas、反芻獸月形單胞菌(Selenomonas_ruminantium)、Veillonellaceae_UCG-001在高劑量組中富集。

Erysipelotrichales：柔膜菌目；Acidaminococcaceae：氨基酸球菌科；Acidaminococcales：氨基酸球菌目；Succiniclasticum：解琥珀酸菌屬；Bacteroidia：擬桿菌綱；Bacteroidales：擬桿菌目；Prevotellaceae：普雷沃氏菌科；Selenomonadaceae：新月形單胞菌科；Prevotella_ruminicola：棲瘤胃普雷沃氏菌；Selenomonas：新月形單胞菌屬；Selenomonas_ruminantium：反芻獸月形單胞菌；Veillonellaceae_UCG-001：韋榮球菌科_UCG-001；Succinivibrionaceae：琥珀酸弧菌科；Aeromonadales：氣單胞菌目；Gammaproteobacteria：γ-變形菌綱；Proteobacteria：變形菌門；Succinivibrionaceae_UCG-001：琥珀酸弧菌科_UCG-001。圖2 瘤胃菌群LDA判別柱形圖Fig.2 LDA discrimination column of rumen microbiota

3 討 論

瘤胃上皮作為反芻動物吸收營養(yǎng)物質的重要場所和抵御病原微生物的屏障，其生理結構的完整對保持瘤胃健康具有重要意義。在集約化的養(yǎng)殖模式下，適應高精料飼糧對肉羊瘤胃微生物和瘤胃上皮是一個巨大的挑戰(zhàn)。瘤胃微生物在對高精料飼糧進行發(fā)酵時，會產生大量有機酸，降低瘤胃pH，殺死革蘭氏陰性菌并釋放脂多糖，改變緊密連接蛋白的表達和分布，從而破壞瘤胃屏障并引發(fā)瘤胃上皮組織的炎癥反應[13-14]。李碧波[15]研究發(fā)現(xiàn)，高精料飼糧會降低絨山羊瘤胃pH，增加脂多糖含量，降低瘤胃黏膜ZO-1、occludin、claudin-1及claudin-4的mRNA相對表達量，并提高白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、TNF-α和白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的mRNA相對表達量。緊密連接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-4)是評價瘤胃上皮屏障功能的重要指標，其mRNA相對表達量的下降代表瘤胃屏障功能受損。IFN-γ、IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α是調節(jié)機體免疫功能的重要細胞因子，其中IFN-γ、IL-6、IL-1β和TNF-α為促炎細胞因子，IL-10為抗炎細胞因子[16]。正常情況下，這些細胞因子會誘導并激活免疫細胞前往感染部位，發(fā)揮正向調節(jié)作用。但是，當機體內促炎細胞因子大量產生時就會引發(fā)炎癥反應。本試驗結果顯示，飼糧添加200 mg/kg BW的FWBPs可增加肉羊瘤胃組織中occludin、claudin-1及claudin-4的mRNA相對表達量，而添加400 mg/kg BW的FWBPs可增加肉羊瘤胃組織中ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-4的mRNA相對表達量。由此可推斷，F(xiàn)WBPs可通過增加ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-4的mRNA相對表達量來提高肉羊瘤胃屏障功能。有趣的是，F(xiàn)WBPs也提高了肉羊瘤胃組織中IFN-γ和IL-6的mRNA相對表達量。瘤胃中革蘭氏陰性菌大量繁殖釋放脂多糖是導致瘤胃炎癥的主要原因[14]。Proteobacteria中含有很多產脂多糖的革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌(Escherichiacoli)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)和希瓦氏菌屬(Shewanella)等[17]。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧添加400 mg/kg BW的FWBPs會降低瘤胃食糜中Proteobacteria的相對豐度。由此推測，肉羊瘤胃組織中IFN-γ和IL-6的mRNA相對表達量增加可能與瘤胃炎癥無關，具體原因有待進一步研究。

飼料添加劑主要通過調控瘤胃內環(huán)境，穩(wěn)定瘤胃pH，減少乳酸產量，增強纖維消化能力，進而改善瘤胃健康狀況[18]。調控瘤胃內環(huán)境的關鍵是調節(jié)瘤胃微生物區(qū)系，而瘤胃中細菌的數(shù)量和種類最多。因此，本文主要討論瘤胃細菌。已有研究表明，攝食功能性多糖可改變瘤胃菌群多樣性和相對豐度。金鹿等[19]研究發(fā)現(xiàn)，沙蒿多糖組合制劑可改變?yōu)┭蛄鑫妇航Y構，提高Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，增加了瘤胃菌群的多樣性和豐富度，有利于促進瘤胃健康。與上述試驗結果相似，本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧添加400 mg/kg BW的FWBPs顯著提高了肉羊瘤胃菌群Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)；在門水平上，飼糧添加200 mg/kg BW的FWBPs可增加瘤胃菌群中Spirochaetota的相對豐度；添加400 mg/kg BW的FWBPs可增加瘤胃菌群中Bacteroidota的相對豐度，并降低Proteobacteria的相對豐度。此外，高劑量組瘤胃菌群中Proteobacteria和Spirochaetota的相對豐度顯著低于低劑量組，而Bacteroidota的相對豐度顯著高于低劑量組。與本試驗結果相似，在蕎麥秸稈飼糧中添加甘露寡糖可提高灘羊瘤胃菌群中Bacteroidota和厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度，降低Proteobacteria的相對豐度[20]。Han等[21]研究顯示，高精料飼糧會導致瘤胃中放線菌門(Actinobacteriota)和Proteobacteria的相對豐度增加，而Bacteroidota的相對豐度下降。Proteobacteria中的含有很多產脂多糖的革蘭氏陰性菌，其相對豐度的增加會導致脂多糖增加，破壞瘤胃屏障，誘發(fā)瘤胃炎癥[14]。Bacteroidota基因組中含有較多編碼糖苷水解酶和多糖裂解酶的基因，這2類酶能降解纖維類物質[22]?；谏鲜鲅芯客茰y，飼糧添加400 mg/kg BW的FWBPs可能通過增加Bacteroidota的相對豐度和降低Proteobacteria的相對豐度來提高纖維物質的消化和減少脂多糖釋放，進而改善瘤胃健康狀況。在屬水平上，與對照組相比，低劑量組瘤胃菌群中Succinivibrio的相對豐度增加；而高劑量組瘤胃菌群中Selenomonas的相對豐度增加，Succinivibrionaceae_UCG-001和Succiniclasticum的相對豐度減少。高劑量組瘤胃菌群中Veillonellaceae_UCG-001和Selenomonas的相對豐度高于低劑量組，而Succinivibrionaceae_UCG-001的相對豐度低于低劑量組。與本研究結果不同，甘露寡糖可增加灘羊瘤胃菌群中普氏菌屬_1(Prevotella_1)、理研菌科_RC9_腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)和Succiniclasticum的相對豐度，這可能是由于添加多糖種類或羊品種不同導致的[20]。

LEfSe分析的結果也顯示，Succiniclasticum在對照組中富集；Succinivibrionaceae、Proteobacteria和Succinivibrionaceae_UCG-001在低劑量組中富集；Bacteroidota、Prevotella_ruminicola、Selenomonas、Selenomonas_ruminantium、Veillonellaceae_UCG-001在高劑量組中富集。Succiniclasticum主要以淀粉為發(fā)酵底物，也能發(fā)酵纖維或纖維二糖，主要代謝產物是琥珀酸和乙酸[23]。本試驗所用基礎飼糧中玉米(含70%淀粉)比例較高，會促使Succiniclasticum大量繁殖，使其成為對照組中的標志物種。Succinivibrionaceae_UCG-001可以發(fā)酵多種糖類，主要的代謝終產物是乙酸、琥珀酸和乳酸[24]。當給反芻動物飼喂大量可發(fā)酵的碳水化合物時，瘤胃中通過糖酵解生成乳酸的速率遠大于其被利用的速率，導致乳酸積累，瘤胃pH急速下降，造成酸中毒。因此，低劑量組肉羊瘤胃菌群中Succinivibrionaceae_UCG-001的相對豐度增加可能會造成乳酸積累，且Proteobacteria的相對豐度增加也可能會造成脂多糖的大量生成，損傷瘤胃。研究發(fā)現(xiàn)，活性干酵母可以通過降低荷斯坦奶牛瘤胃中Succinivibrionaceae_UCG-001的相對豐度，進而減少高精料條件下瘤胃乳酸的產生量，維持瘤胃pH的穩(wěn)定[25]。Bacteroidota中的Prevotella_ruminicola是一種降解菌，在蛋白質、淀粉、木聚糖和果膠的降解過程中發(fā)揮著重要作用[26-27]，其相對豐度的增加有利于提高肉羊對營養(yǎng)物質的消化。Selenomonas中的Selenomonas_ruminantium是瘤胃中非常重要的一種乳酸利用菌，其比例的提高有利于減低瘤胃乳酸累積，穩(wěn)定瘤胃pH[28]。Veillonellaceae_UCG-001也是一種乳酸利用菌，可以發(fā)酵乳酸、丙酮酸、延胡索酸、L-蘋果酸，但不能發(fā)酵糖類物質[26]。有學者認為瘤胃微生物區(qū)系紊亂和乳酸代謝菌菌群比例失衡是導致瘤胃中乳酸積累，誘發(fā)瘤胃酸中毒的直接原因[29]。本試驗中，高劑量組肉羊瘤胃菌群中Veillonellaceae_UCG-001和Selenomonas的相對豐度增加，這有利于減少乳酸積累，穩(wěn)定瘤胃pH。本課題組前期研究結果也顯示，飼糧添加400 mg/kg BW的FWBPs可穩(wěn)定肉羊瘤胃pH，瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸含量較對照組減少了19%[11]?；谏鲜鼋Y果推測，飼糧添加400 mg/kg BW的FWBPs可能通過調控杜寒雜交肉羊瘤胃中乳酸產生菌(Succinivibrionaceae_UCG-001)和乳酸利用菌(Veillonellaceae_UCG-001和Selenomonas)的相對豐度，減少乳酸累積，穩(wěn)定瘤胃pH，改善瘤胃健康狀況。

4 結 論

① 飼糧添加200和400 mg/kg BW的FWBPs均能提高杜寒雜交肉羊瘤胃組織中緊密連接蛋白(occludin、claudin-1、claudin-4)的mRNA相對表達量，添加400 mg/kg BW的FWBPs可提高細胞因子(IFN-γ和IL-6)的mRNA相對表達量。

② 飼糧添加FWBPs可影響瘤胃菌群中Succinivibrio、Selenomonas、Veillonellaceae_UCG-001、Succinivibrionaceae_UCG-001和Succiniclasticum的相對豐度。

③ 綜上所述，F(xiàn)WBPs能夠提高杜寒雜交肉羊瘤胃組織中緊密連接蛋白和細胞因子的mRNA相對表達量，調控瘤胃菌群結構，有利于維持瘤胃健康。