方 靜 石寶明 何 威 秦小童 王 亮 王富辰 孟慶維

(東北農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所,哈爾濱 150030)

小麥是我國最重要的糧食作物之一，是山東、河南等地區(qū)人民重要的主食。2020年我國小麥總產(chǎn)量達13 359萬t，約占我國糧食總產(chǎn)量的20%。小麥麩是小麥谷殼，呈片狀，占小麥加工副產(chǎn)品的45%[1-2]。小麥麩是由多個組織形成的具有3個離散層的復合飼料原料，其中糊粉層富含礦物質和B族維生素[3]。小麥麩主要由非淀粉多糖(約38%)、淀粉(約19%)、蛋白質(約18%)和木質素(約6%)組成。小麥麩中非淀粉多糖由70%的木聚糖、19%的纖維素和6%的β-(1，4)和β-(1，3)葡聚糖構成。小麥麩淀粉含量高，可產(chǎn)生大量的淀粉酶。小麥麩中膳食纖維的含量為45%，且絕大部分為不溶性纖維[4-6]。小麥麩產(chǎn)量高、營養(yǎng)物質也相對豐富，但由于其纖維含量高，目前在飼料市場中只能作為中低檔的能量飼料。固態(tài)發(fā)酵工藝一般將農業(yè)生產(chǎn)的邊角料或營養(yǎng)價值較低的原料作為發(fā)酵底物，應用具有降解非淀粉多糖功能的微生物進行發(fā)酵，提高飼料利用率。固態(tài)發(fā)酵飼料具有較高的營養(yǎng)價值，且抗營養(yǎng)因子含量降低，被認為是一種潛在的抗生素替代品[7]。與未發(fā)酵飼料相比，發(fā)酵飼料含有較多的乳酸菌、較少的大腸桿菌，較高的有機酸和較低的pH[8]。小麥麩經(jīng)發(fā)酵后，可有效降解中性洗滌纖維和抗營養(yǎng)因子，微生物在生長過程中會產(chǎn)生大量的生物活性物質，如維生素等，可以提高麥麩的營養(yǎng)價值。李加友等[9]研究發(fā)現(xiàn)，添加發(fā)酵小麥麩于肥育豬飼糧中，可提高肥育豬的平均日采食量(ADFI)，降低料重比(F/G)，增加平均日增重(ADG)，提高經(jīng)濟效益。Kraler等[10]研究還發(fā)現(xiàn)發(fā)酵小麥麩可以降低仔豬結腸中甲胺的含量。發(fā)酵小麥麩具有眾多優(yōu)點，但在斷奶仔豬生產(chǎn)中應用的研究較少。本試驗旨在研究發(fā)酵小麥麩替代未發(fā)酵麥麩對斷奶仔豬生長性能、養(yǎng)分表觀消化率、血漿炎癥因子與免疫球蛋白含量及糞便菌群的影響，為發(fā)酵飼料在養(yǎng)豬業(yè)中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取35日齡的健康杜×長×大三元雜交雄性斷奶仔豬[體重為(11.58±0.27) kg]12頭，隨機分為2組，每組6個重復，每個重復1頭豬。試驗所用飼糧參考NRC(2012)豬營養(yǎng)需要進行配制，營養(yǎng)水平滿足仔豬所需?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。對照組飼喂基礎飼糧(含有10%未發(fā)酵小麥麩)，發(fā)酵組飼喂以發(fā)酵小麥麩替代基礎飼糧中全部未發(fā)酵麥麩的試驗飼糧。預試期3 d，正試期28 d。試驗期間，試驗豬在漏縫地板式代謝籠中單欄飼養(yǎng)，按照常規(guī)飼養(yǎng)管理，自由采食和飲水，飼糧配制成粉狀進行飼喂，每日飼喂3次。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

續(xù)表1項目 Items含量 Content石粉 Limestone0.88預混料 Premix1)1.00合計 Total100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)代謝能 ME/(MJ/kg)13.14凈能 NE/(MJ/kg)10.13粗蛋白質 Crude protein18.08賴氨酸 Lysine1.26蛋氨酸 Methionine0.36蘇氨酸 Threonine0.75色氨酸 Tryptophan0.20鈣 Calcium0.70總磷 Total phosphorus0.60有效磷 Available phosphorus0.32

1.2 試驗材料

試驗用仔豬購買于黑龍江谷實農牧集團股份有限公司哈爾濱分公司。

試驗用小麥麩來自某面粉集團有限公司。發(fā)酵小麥麩由實驗室制備，利用枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母混合發(fā)酵，旨在降低小麥麩纖維含量，提高蛋白質含量，發(fā)酵條件為：接菌量5%，接菌比(枯草芽孢桿菌：產(chǎn)朊假絲酵母)為1∶1，發(fā)酵溫度為35 ℃，含水量為40%，發(fā)酵時間為2 d?？莶菅挎邨U菌和產(chǎn)朊假絲酵母購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，為標準菌株。枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為1.8×108CFU/mL，產(chǎn)朊假絲酵母菌活菌數(shù)為2.8×107CFU/mL。小麥麩發(fā)酵前后的營養(yǎng)成分及pH如表2所示。

表2 小麥麩發(fā)酵前后的營養(yǎng)成分及pHTable 2 Nutritional composition and pH of wheat bran before and after fermentation

1.3 檢測指標

1.3.1 生長性能

在試驗的第1、28天對經(jīng)過空腹過夜的仔豬稱重以計算平均日增重；每周記錄1次采食量，以計算平均日采食量；根據(jù)平均日采食量和平均日增重計算料重比。

1.3.2 養(yǎng)分表觀消化率

在試驗后期(第24～27天)，每組收集糞便，采用酸不溶灰分法測定養(yǎng)分表觀消化率。根據(jù)Ren[11]的方法每天08:00和20:00分2次收集仔豬所有糞便，裝于塑封袋中，稱重并記錄。為防止糞樣氨的損失，加入10 mL H2SO4，然后將糞便儲存在-20 ℃冰箱中。測定前，將糞樣從冰箱中取出解凍并把每只豬4 d的糞樣混合均勻，取出混合糞樣約200 g，于(60±5) ℃烘箱中干燥48～72 h，然后用粉碎機將烘干后的糞樣粉碎，過40目篩網(wǎng)，待測。根據(jù)GB/T 23742—2009內源指示劑法測定糞樣和飼糧中酸不溶灰分、干物質(DM)、粗蛋白質(CP)、粗脂肪(EE)、總能(GE)、鈣(Ca)和磷(P)含量。測定完后計算養(yǎng)分表觀消化率，計算公式如下：

某養(yǎng)分表觀消化率(%)=100-100×(糞中該養(yǎng)分含量×飼糧中酸不溶灰分含量)/(飼糧中某養(yǎng)分含量×糞中酸不溶灰分含量)。

1.3.3 血漿炎癥因子和免疫球蛋白含量

在試驗第28天，每組的6頭仔豬空腹12 h，次日稱重后對仔豬進行前腔靜脈采血，置于抗凝管中，隨后以3 000 r/min的條件在4 ℃低溫高速離心機中離心15 min。離心后立即分裝血漿于1.5 mL EP管中，做好標記并保存在-20 ℃冰箱中，待測。仔豬血漿炎癥因子[白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]和免疫球蛋白[免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)]含量的測定采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測定，試劑盒購于北京華英生物技術研究所。

1.3.4 糞便菌群

試驗結束后將仔豬處死，快速移除結腸腸段，擠出結腸內容物置于5 mL凍存管中并做好標記，于液氮中快速冷凍并保存于-80 ℃冰箱，用干冰郵寄至杭州聯(lián)川生物科技有限公司進行16S rDNA的V3～V4區(qū)域擴增、測序及數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

首先使用Excel 2019對試驗數(shù)據(jù)進行整理，然后采用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)。數(shù)據(jù)分析結果以平均值±標準誤表示。統(tǒng)計過程以發(fā)酵小麥麩為唯一變量因素。每頭仔豬被認為是1個試驗單位。如果P<0.05，數(shù)據(jù)被認為存在顯著差異；如果0.05

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬生長性能的影響

由表3可知，與對照組相比，發(fā)酵小麥麩對仔豬的平均日增重、平均日采食量和料重比沒有顯著影響(P>0.05)。

表3 發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬生長性能的影響Table 3 Effects of fermented wheat bran on growth performance of weaned piglets

2.2 發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表4可知，發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬干物質、粗脂肪、粗纖維、能量和磷的表觀消化率無顯著影響(P>0.05)，但有提高粗蛋白質和鈣的表觀消化率的趨勢(P=0.099)。

表4 發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響Table 4 Effects of fermented wheat bran on nutrient apparent digestibility of weaned piglets %

2.3 發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬血漿炎癥因子和免疫球蛋白含量的影響

由表5可知，與對照組相比，發(fā)酵小麥麩可顯著降低仔豬血漿中IL-6和TNF-α含量(P<0.05)，對血漿中IL-1β、IL-8含量無顯著影響(P>0.05)；發(fā)酵小麥麩對血漿中IgA、IgM含量無顯著影響(P>0.05)，但可顯著提高血漿中IgG含量(P<0.05)。

表5 發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬血漿炎癥因子和免疫球蛋白含量的影響Table 5 Effects of fermented wheat bran on plasma inflammatory factor and immunoglobulin contents of weaned piglets

2.4 發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬糞便菌群的影響

2.4.1 發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬糞便菌群門水平的影響

發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬糞便菌群門水平組成的影響如圖1所示。由圖可知，斷奶仔豬糞便菌群門水平中相對豐度較高的為厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，且發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬糞便各菌門的相對豐度均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Proteobacteria：變形菌門；Spirochaetes：螺旋菌門；Actinobacteria：放線菌門；Cyanobacteria：藍藻門；Tenericutes：柔壁菌門；Fibrobacteres：纖維桿菌門；Planctomycetes：浮霉菌門；Chlamydiae：衣原體門；Deferribacteres：脫鐵桿菌門；Unclassified：未分類。圖1 糞便菌群門水平組成Fig.1 Composition of fecal microbiota at phylum level

2.4.2 發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬糞便菌群屬水平的影響

發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬糞便菌群屬水平組成的影響如圖2所示。發(fā)酵組仔豬糞便中相對豐度排在前30的菌屬無顯著變化(P>0.05)。而對于排在30以外的菌屬的相對豐度，如表6所示，發(fā)酵小麥麩顯著提高了毛螺菌屬(Lachnospira)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、Pelomonas、Sphingopyxis、鐮刀菌屬(Fusicatenibacter)的相對豐度(P<0.05)，顯著降低了鐮孢菌屬(Catenisphaera)和醋酸桿菌屬(Acetitomaculum)的相對豐度(P<0.05)。

表6 糞便菌群屬水平的相對豐度Table 6 Relative abundance of fecal microbiota at genus level

3 討 論

3.1 發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬生長性能的影響

動物生長性能是評價經(jīng)濟效益的指標之一。發(fā)酵飼料具有芳香氣味，適口性有所改善，可提高動物的食欲。發(fā)酵飼料雖具有較高的營養(yǎng)價值，但多項研究得出的發(fā)酵飼料對豬生長性能的影響并不一致。本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬生長性能無顯著影響。而有研究表明，在育肥豬飼糧中以發(fā)酵小麥麩替代未發(fā)酵小麥麩，可使育肥豬平均日采食量增加3.8%，料重比降低4.3%，平均日增重提高8.2%，提高了經(jīng)濟效益[9]。而Zhang等[12]研究則表明發(fā)酵豆粕可顯著提高仔豬的平均日增重和平均日采食量，而不影響仔豬的料重比。由此可見，發(fā)酵飼料對于斷奶仔豬生長性能的影響結果并不統(tǒng)一，發(fā)酵原料和發(fā)酵菌種的不同都可產(chǎn)生差異。本試驗結果表明發(fā)酵小麥麩對于斷奶仔豬生長性能無顯著影響，試驗期的長短以及試驗動物的數(shù)量也會影響生長性能的結果，本實驗室后續(xù)會進一步對發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬生長性能的影響進行研究。

3.2 發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

動物胃腸道適宜的酸性環(huán)境是斷奶仔豬具有正常消化功能的基礎，飼糧中添加發(fā)酵小麥麩可降低斷奶仔豬胃腸道的pH，維持酸性環(huán)境。動物攝入的飼糧經(jīng)過機械性消化進入胃腸道后，與消化系統(tǒng)內的消化液和消化酶充分混合分解為易吸收的小分子營養(yǎng)物質。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵小麥麩雖對斷奶仔豬干物質、粗脂肪、粗纖維、能量和磷的表觀消化率無顯著影響，但對于粗蛋白質和鈣的表觀消化率有提高的趨勢，可能是因為益生菌發(fā)酵使小麥麩中酸溶蛋白含量提高，而酸溶蛋白分子較小更容易被動物吸收利用。因此，發(fā)酵飼料可改善飼料品質，促進動物對養(yǎng)分的消化吸收，提高飼糧養(yǎng)分消化率。

3.3 發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬血漿炎癥因子和免疫球蛋白含量的影響

IgG是血液中含量最高的免疫球蛋白，具有多種免疫學活性[13]。小麥麩中阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖是含量最高的抗營養(yǎng)因子，但它們被酶解后產(chǎn)生的小分子糖可改善機體免疫，具有免疫調節(jié)作用[14]。本試驗結果表明，發(fā)酵小麥麩可顯著提高血漿中IgG含量。免疫球蛋白含量的高低反映了動物抵抗疾病的能力，IgG含量的增加表明了發(fā)酵小麥麩可提高斷奶仔豬機體免疫力。此外，發(fā)酵小麥麩還可顯著降低斷奶仔豬血漿中TNF-α和IL-6含量。這可能是由于小麥麩中含有阿拉伯木聚糖，而阿拉伯木聚糖具有可降低仔豬血液中TNF-α含量的功能[15]。因此，飼糧中添加10%發(fā)酵小麥麩替代未發(fā)酵小麥麩對提高斷奶仔豬機體免疫力具有促進作用。

3.4 發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬糞便菌群的影響

使用發(fā)酵飼料可減少腸道致病菌的定植，改善腸道健康[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬糞便菌群門水平中以厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度較高，且飼糧中添加10%發(fā)酵小麥麩對各菌門的相對豐度沒有顯著影響,但顯著提高了Lachnospira、Klebsiella、Pelomonas、Sphingopyxis、Fusicatenibacter幾個屬的相對豐度。Lachnospira為厭氧菌屬，屬于厚壁菌門，是微生物區(qū)系中重要的一員，是斷奶后仔豬的優(yōu)勢菌屬，在人體微生物區(qū)系中也很常見，具有促進健康的作用。Lachnospira的相對豐度會被飲食所影響[17-20]。本試驗中，發(fā)酵小麥麩的添加增加了斷奶仔豬糞便中Lachnospira的相對豐度，該結果說明飼糧中添加發(fā)酵小麥麩有利于豬結腸菌群結構的平衡；同時，發(fā)酵小麥麩的添加還增加了糞便中Klebsiella的相對豐度。Klebsiella為兼性厭氧菌屬，是人和動物腸道的共生菌群，對羥基苯甲酸具有高效降解作用，能降低羥基苯甲酸對環(huán)境的污染和對人體健康的威脅[21-22]。此外，發(fā)酵小麥麩的添加使糞便中Pelomonas、Sphingopyxis和Fusicatenibacter的相對豐度也顯著提高。斷奶仔豬飼糧中添加發(fā)酵小麥麩顯著降低了糞便中Acetitomaculum和Catenisphaera的相對豐度。Acetitomaculum為好氧菌屬，氧化能力較強，屬于變形菌門，有研究表明變形菌門相對豐度顯著增加會導致仔豬腹瀉[23]。發(fā)酵小麥麩的添加降低了Acetitomaculum的相對豐度，表明發(fā)酵小麥麩對仔豬腹瀉具有緩解作用。研究表明Catenisphaera中的尖銳鐮孢菌對馬鈴薯種植有負面影響，導致馬鈴薯枯萎病的發(fā)生[24]。發(fā)酵小麥麩改善了糞便菌群組成，間接表明發(fā)酵小麥麩可改善腸道菌群健康[25]。研究顯示，發(fā)酵飼料可顯著提高斷奶仔豬腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌的數(shù)量，降低大腸桿菌等有害菌的數(shù)量，促進仔豬腸道健康[26]。綜上可知，飼糧中添加10%發(fā)酵小麥麩增加了腸道有益菌的數(shù)量，調節(jié)了腸道菌群平衡，對斷奶仔豬腸道健康發(fā)育具有促進作用。

Megasphaera：巨球型菌屬；Anaerovibrio：厭氧弧菌屬；Prevotella_9：普雷沃氏菌屬9；Selenomonas：月形單胞菌屬；Treponema_2：密螺旋體屬2；Lactobacillus：乳桿菌屬；Streptococcus：鏈球菌屬；Prevotella：普雷沃氏菌屬；Eubacterium_coprostanoligenes_group：真桿菌屬；Prevotella_2：普雷沃氏菌屬2；Succinivibrio：琥珀酸弧菌屬；Prevotella_1：普雷沃氏菌屬1；Prevotellaceae_UCG-003：普雷沃氏菌科_UCG-003；Clostridium_sensu_stricto_1：梭菌屬；Ruminococcaceae_UCG-005：瘤胃球菌科UCG-005；Prevotellaceae_NK3B31_group：普雷沃氏菌科NK3B31群；Ruminococcaceae_UCG-014：瘤胃球菌科UCG-014；Ruminococcus_1：瘤胃球菌屬1；Lachnospiraceae_unclassified：未分類毛螺科菌；Alloprevotella：擬普雷沃菌屬；Ruminococcaceae_UCG-002：瘤胃球菌科UCG-002；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9腸道群；Agathobacter：直腸真桿菌屬；Faecalibacterium：糞桿菌屬；Ruminococcaceae_NK4A214_group：瘤胃球菌科NK4A214群；Oscillospira：顫螺旋菌屬；Firmicutes_unclassified：未分類厚壁菌門；Christensenellaceae_R-7_group：克里斯滕森菌科R-7群；Others：其他。圖2 糞便菌群屬水平組成Fig.2 Composition of fecal microbiota at genus level

4 結 論

① 飼糧中添加10%發(fā)酵小麥麩對斷奶仔豬生長性能無顯著影響，對粗蛋白質和鈣的表觀消化率有提高的趨勢。

② 飼糧中添加10%發(fā)酵小麥麩可提高斷奶仔豬機體免疫功能。

③ 飼糧中添加10%發(fā)酵小麥麩可有效調節(jié)腸道菌群結構，促進斷奶仔豬腸道健康。