王金輝，鄧紫璇，黎頌超，張續(xù)勐，李婉雁，沈 栩，黃運茂，江丹莉*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 動物科技學(xué)院，廣東廣州 510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣東廣州 510225）

我國是蛋鴨養(yǎng)殖和消費大國，南方地區(qū)蛋鴨養(yǎng)殖多以傳統(tǒng)的水域放牧（半放牧）或大棚地面飼養(yǎng)為主要模式，養(yǎng)殖密度和群體規(guī)模至今仍無標(biāo)準，為追求更高的生產(chǎn)效益，農(nóng)戶不斷擴大飼養(yǎng)密度，然而過度增加飼養(yǎng)密度不僅會影響家禽的生產(chǎn)性能，還會引起應(yīng)激反應(yīng)并降低動物福利，造成一定的經(jīng)濟損失。研究表明，飼養(yǎng)密度和群體過大會導(dǎo)致禽舍內(nèi)擁擠，加劇家禽的環(huán)境競爭壓力，引起互相擠壓、采食不均，造成機體應(yīng)激反應(yīng)，使家禽不安和恐懼，導(dǎo)致死亡率上升。張璐爽等對北京鴨籠養(yǎng)密度的研究發(fā)現(xiàn)，高飼養(yǎng)密度會加強北京鴨免疫系統(tǒng)的代償反應(yīng)，并使脾臟萎縮，而中飼養(yǎng)密度使北京鴨體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平增加。賀衛(wèi)華等研究發(fā)現(xiàn)，高密度養(yǎng)殖不僅降低黃羽肉雞的抗氧化和免疫能力，還造成肌酸激酶（CK）活性、皮質(zhì)酮、熱休克蛋白70等應(yīng)激指標(biāo)上升，對肉雞的生長和免疫造成不利影響。

長期以來，對飼養(yǎng)密度的探究多以肉雞和肉鴨為模型，極少聚焦于蛋鴨飼養(yǎng)密度的研究，尤其是對育成期和初產(chǎn)期蛋鴨的飼養(yǎng)密度探究更是鮮有報道。因此，本試驗通過研究不同飼養(yǎng)密度對育成期蛋鴨血清免疫、抗氧化指標(biāo)及應(yīng)激反應(yīng)的影響，以期獲得適宜的飼養(yǎng)密度范圍，為蛋鴨的科學(xué)飼養(yǎng)管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 本試驗所用育成期山麻鴨蛋鴨，由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院鐘村養(yǎng)殖基地提供。選取180只飼養(yǎng)水平和體重一致的健康7周齡山麻鴨蛋鴨，隨機分為低密度（n=30）、中密度（n=60）和高密度（n=90）3組，于3個飼養(yǎng)條件相同的半開放式鴨棚中進行“水陸-平養(yǎng)”。鴨舍內(nèi)分布如下，鴨棚:運動場:水池=6 m:6 m:3 m，即低密度、中密度、高密度3個試驗組的舍內(nèi)密度分別為5、10、15 只/m。每日08:00—18:00為鴨群在運動場和水池自由活動時間。試驗期間蛋鴨嚴格按照生產(chǎn)日糧飼喂，日糧組成及營養(yǎng)水平見表1，嚴格控制每組的料槽和飲水器個數(shù)，保證所有鴨的料位和飲水面積相同，限食不限水，其他條件均按照常規(guī)飼養(yǎng)規(guī)程執(zhí)行。試驗預(yù)試期1周，正試期11周。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 器官指數(shù)測定 于蛋鴨11周齡和19周齡時對所有蛋鴨進行稱重，每組隨機挑選6只鴨翅下采血后剖殺并采集肝臟和脾臟，稱重后計算器官指數(shù)，器官指數(shù)=器官重（g）/體重（g）×100%。

1.3 血清指標(biāo)測定 于蛋鴨11周齡和19周齡時，每組挑選6只鴨進行翅下采血，并于室溫下靜置2 h后3 000 r/min 離心5 min，取血清于-20℃凍存?zhèn)溆?，總蛋白、白蛋白、免疫球蛋白A（IgA）和超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所。促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和皮質(zhì)酮（COR）激素水平利用Elisa方法測定，試劑盒均購自武漢華美（Cusabio）生物工程有限公司。球蛋白濃度=總蛋白濃度-白蛋白濃度。

1.4 RT-PCR分析 于蛋鴨11周齡和19周齡時，每組挑選6只鴨采集下丘腦和垂體。用Trizol 法提取下丘腦和垂體總RNA，使用Toyobo東洋紡反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩⒄誈enBank中鴨或近緣物種相關(guān)基因的mRNA序列，使用NCBI的Primer Blast網(wǎng)站設(shè)計促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素基因（），糖皮質(zhì)激素受體基因（）、促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素受體2基因（）、阿片促黑素皮質(zhì)素原基因（）和內(nèi)參的熒光定量引物（表2），送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，按照SYBR Green PCR Master Mix熒光定量試劑使用說明書配制20 μL 反應(yīng)體系，進行實時熒光定量檢測。PCR反應(yīng) 體 系20 μL：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上 下 游 引 物 各0.5 μL（10 μmol/μL），ddHO 8 μL，cDNA 1μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 1 min，95℃ 10 s，58℃ 30 s，40個循環(huán)，每個樣品設(shè)3次重復(fù)。

表2 引物序列

1.5 統(tǒng)計分析 熒光定量PCR擴增數(shù)據(jù)采用2法進行處理。試驗數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，組間差異顯著性采用LSD多重比較法進行檢驗，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準誤表示，<0.05表示差異顯著，>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼養(yǎng)密度對蛋鴨體重和免疫器官指數(shù)的影響 表3結(jié)果顯示，11周齡和19周齡時低密度組蛋鴨體重均高于中密度組和高密度組（<0.05）；11周齡時，3組間脾臟和肝臟指數(shù)均無顯著性差異；隨著飼養(yǎng)時間的增長，19周齡時脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)均為高密度組>中密度組>低密度組（<0.05）。

表3 飼養(yǎng)密度對體重和器官指數(shù)的影響

2.2 飼養(yǎng)密度對蛋鴨體液免疫指標(biāo)的影響 表4結(jié)果顯示，11周齡時，高密度組的白蛋白濃度低于低密度組和中密度組（<0.05），總蛋白、球蛋白和IgA濃度沒有差異；19周齡時，中、高密度組的白蛋白濃度低于低密度組（<0.05），而球蛋白和IgA濃度高于低密度組（<0.05），中密度與高密度組間差異不顯著。

表4 飼養(yǎng)密度對體液免疫指標(biāo)的影響 g/L

2.3 飼養(yǎng)密度對蛋鴨抗氧化指標(biāo)的影響 表5結(jié)果顯示，11周齡時，中密度和高密度組血液SOD濃度低于低密度組（<0.05），3組間T-AOC濃度差異不顯著；19周齡時，中密度組的SOD低于低、高密度組（<0.05），中、高密度組的T-AOC濃度低于低密度組（<0.05）。

表5 飼養(yǎng)密度對抗氧化指標(biāo)的影響

2.4 飼養(yǎng)密度對蛋鴨應(yīng)激基因表達水平的影響 圖1結(jié)果顯示，11周齡時，不同飼養(yǎng)密度對蛋鴨的基因的相對表達水平影響不顯著，但飼養(yǎng)至19周齡時，高密度組的相對表達量高于低、中密度組（<0.05），基因的相對表達量高于低密度組（<0.05）。

圖1 飼養(yǎng)密度對蛋鴨應(yīng)激相關(guān)基因表達的影響

2.5 飼養(yǎng)密度對蛋鴨激素水平的影響 圖2結(jié)果顯示，11周齡和19周齡蛋鴨的ATCH水平差異均不顯著，但19周齡高密度組的ATCH 水平較低密度組和中密度均有所有上升；11周齡蛋鴨組間的COR水平差異不顯著，19周齡中、高密度組的COR水平高于低密度組（<0.05）。

圖2 飼養(yǎng)密度對蛋鴨應(yīng)激激素水平的影響

3 討 論

3.1 飼養(yǎng)密度對體重及免疫器官指數(shù)的影響 本研究結(jié)果表明，試驗期間，隨著飼養(yǎng)密度增加，蛋鴨體重呈下降趨勢，免疫器官指數(shù)也受到相應(yīng)的影響。免疫器官指數(shù)是反映機體免疫器官生長發(fā)育的重要指標(biāo)，可用來評定家禽的免疫水平。肝臟具備抗氧化、解毒及抗凝血等功能，由肝臟合成的血清總蛋白在代謝旺盛時可促進動物機體生長和發(fā)育，而脾臟與免疫息息相關(guān)，幾乎參與機體內(nèi)所有的免疫應(yīng)答。本試驗發(fā)現(xiàn)，隨著飼養(yǎng)密度增加，鴨肝臟指數(shù)呈遞增趨勢，與以往的研究結(jié)果一致。高密度飼養(yǎng)方式導(dǎo)致動物長期受應(yīng)激，在ACTH的持續(xù)刺激下，肝臟脂肪酸的合成增加，加強了肝臟脂肪沉積，從而導(dǎo)致肝臟肥大，最終表現(xiàn)出肝臟指數(shù)顯著增加。本研究中，中、高密度組的脾臟指數(shù)在11周齡時均略低于低密度組，而19周齡時隨著密度的增加，脾臟指數(shù)呈顯著上升趨勢，其原因可能是隨著飼養(yǎng)密度升高，蛋鴨在高飼養(yǎng)密度情況下應(yīng)激增大，免疫機能減弱，免疫性能受到影響，早期呈現(xiàn)出脾臟指數(shù)下降，但后期由于應(yīng)激加劇，導(dǎo)致肝臟損傷，最終使脾臟代償性增大，免疫功能受損。

3.2 飼養(yǎng)密度對體液免疫指標(biāo)的影響 本試驗中，隨著飼養(yǎng)密度增加，血清白蛋白濃度下降，而球蛋白和IgA濃度上升。血清白蛋白濃度下降可能是由于較高的飼養(yǎng)密度導(dǎo)致肝功能受損，肝細胞產(chǎn)生白蛋白的能力下降。血清中免疫球蛋白大部分在肝細胞外生成，與機體免疫力相關(guān)，其中Ig A是抗炎性反應(yīng)中重要的免疫球蛋白，球蛋白和IgA含量的增加表明了機體免疫系統(tǒng)受到損傷，這意味著高飼養(yǎng)密度會影響機體的免疫應(yīng)答和免疫功能。

3.3 飼養(yǎng)密度對抗氧化指標(biāo)的影響 SOD可有效清除體內(nèi)過多的超氧陰離子（O），具有保護內(nèi)皮細胞的功能，是機體清除自由基的第一道防線，而T-AOC可反映機體非酶促抗氧化能力的大小，是抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合指標(biāo)。在整個試驗期內(nèi)，隨著飼養(yǎng)密度的增大，蛋鴨血清中SOD水平均顯著降低，而T-AOC水平也于19周齡時出現(xiàn)顯著降低，其主要原因可能是增大飼養(yǎng)密度會引起群體秩序混亂，刺激群體間的爭斗，導(dǎo)致動物體內(nèi)產(chǎn)生過多的自由基，使機體抗氧化系統(tǒng)受到損傷。

3.4 飼養(yǎng)密度對應(yīng)激反應(yīng)的影響 動物受到內(nèi)外環(huán)境刺激時，會引起下丘腦室旁核神經(jīng)元分泌和釋放CRH，CRH與靶細胞上的受體結(jié)合后，激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，增加基因的表達，促進ACTH的分泌和釋放，進而引起血液循環(huán)中的糖皮質(zhì)激素水平變化。COR是主要的糖皮質(zhì)激素，垂體分泌的ACTH通過血液作用于靶細胞可促進COR的分泌。當(dāng)機體處于應(yīng)激狀態(tài)時，機體會合成并分泌大量COR，以增加機體抵抗應(yīng)激的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼養(yǎng)密度增大，和相對表達量增加，血清中的ACTH和COR水平升高，且在19周齡時表現(xiàn)得更為明顯。這與以往研究結(jié)果相一致，即加大群體數(shù)量和高飼養(yǎng)密度會導(dǎo)致家禽的應(yīng)激，糖皮質(zhì)激素水平升高。

免疫功能系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)是相互交叉互相作用的，這些系統(tǒng)可以產(chǎn)生雙向信號，將信號傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)和下丘腦系統(tǒng)，急性應(yīng)激對免疫功能的影響并不明顯，但是長期的慢性應(yīng)激將損害機體的免疫功能進而影響著機體的生長。因此，生產(chǎn)上應(yīng)重視高飼養(yǎng)密度所引起的長期的綜合性的應(yīng)激反應(yīng)。增加飼養(yǎng)密度會引起機體應(yīng)激反應(yīng)，從而可能會影響機體的免疫功能和抗氧化功能，進而影響整個機體的免疫狀態(tài)。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果顯示，在水陸-平養(yǎng)飼養(yǎng)模式下，增大飼養(yǎng)密度會抑制蛋鴨的生長性能，影響機體免疫和氧化指標(biāo)，高飼養(yǎng)密度所帶來的應(yīng)激會導(dǎo)致的體組織分解代謝及氧化損傷，同時影響免疫應(yīng)答和免疫功能。綜合育成期及初產(chǎn)期蛋鴨血清免疫指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)及應(yīng)激相關(guān)激素、相關(guān)基因表達的結(jié)果，建議水陸-平養(yǎng)飼養(yǎng)模式下，蛋鴨由育成期轉(zhuǎn)為初產(chǎn)期分群時，舍內(nèi)飼養(yǎng)密度應(yīng)控制在5～10只/m。