荊林娜，段 濤，劉勝寒，解東祥，段月巖，張 微

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

褪黑素是由動(dòng)植物體內(nèi)的色氨酸在一系列酶的催化下生成的一種吲哚類(lèi)激素，具有改善睡眠、抗氧化、抗衰老和調(diào)節(jié)免疫等功能。睡眠障礙是當(dāng)今時(shí)代尤為突出的健康問(wèn)題，為了解決這一問(wèn)題，人們開(kāi)始服用以褪黑素為有效成分的保健品。現(xiàn)在市場(chǎng)上的褪黑素以化工合成為主，純度較高，但其安全性問(wèn)題備受關(guān)注，因此開(kāi)發(fā)富含天然褪黑素的食品具有重要意義。

牛奶中含有天然的褪黑素，又是當(dāng)今大眾消費(fèi)最多的乳制品，因此開(kāi)發(fā)富含天然褪黑素牛奶的市場(chǎng)前景廣闊。有研究指出，飲用富含褪黑素的牛奶在夜間能夠幫助兒童形成出生時(shí)尚未充分發(fā)育的日常生活節(jié)律，可以改善老人的睡眠質(zhì)量，增加日間活動(dòng)，對(duì)于年輕人也可以從喝牛奶中受益。Voltonen等研究了富含天然褪黑素的夜間牛奶對(duì)患癡呆癥老年人的影響，發(fā)現(xiàn)低劑量的褪黑素（不影響體內(nèi)正常褪黑素的分泌）也能夠增加老年人的日間活動(dòng)，但是由于是在不同季節(jié)進(jìn)行的試驗(yàn)，因此季節(jié)原因?qū)τ谠囼?yàn)結(jié)論影響很大。調(diào)查發(fā)現(xiàn)普通市售牛奶中褪黑素含量較低，因此生產(chǎn)富含天然高褪黑素的牛奶成為當(dāng)今時(shí)代的需求。芬蘭、德國(guó)、英國(guó)和中國(guó)都已經(jīng)針對(duì)天然高褪黑素牛奶的生產(chǎn)發(fā)明了專(zhuān)利。本試驗(yàn)在以上專(zhuān)利文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上研究了16 h光照8 h黑暗和8 h光照16 h黑暗2種光照制度對(duì)奶牛褪黑素分泌的影響，為天然高褪黑素奶的生產(chǎn)提供參考。

1 試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn) 于2018年12月—2019年1月進(jìn)行16 h光照處理的試驗(yàn)；于2019年4月—2019年5月進(jìn)行16 h黑暗處理的試驗(yàn)。試驗(yàn)地點(diǎn)為北京金龍騰達(dá)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇10頭健康經(jīng)產(chǎn)（2～3胎）、泌乳階段相近（120±40）d的荷斯坦奶牛，每天2次投料，自由飲水，擠奶時(shí)間為05:00及17:00，分別設(shè)定為夜奶及日奶。試驗(yàn)選擇自身對(duì)照。試驗(yàn)處理前連續(xù)采集2 d奶樣并于23:00采集血樣作為對(duì)照；試驗(yàn)處理第1、6、11、16、21、26、31天采集奶樣并采集23:00血樣。分離血樣以獲得血清，將血清及奶樣于-20℃凍存用于檢測(cè)褪黑素濃度。記錄每天產(chǎn)奶量。

在16 h光照8 h黑暗處理中，試驗(yàn)牛于17:00擠奶完成后進(jìn)入密閉牛棚，并打開(kāi)全光譜日光燈，保證牛棚內(nèi)各位置光強(qiáng)均大于300 lx；21:00關(guān)閉日光燈，牛棚中處于完全黑暗狀態(tài)，夜間人工操作使用紅色LED燈作為光源，牛只眼睛處光強(qiáng)不超過(guò)2lx；05:00擠奶完成后將試驗(yàn)牛趕入密閉牛棚，打開(kāi)日光燈；09:00將試驗(yàn)牛趕出牛棚繼續(xù)接受日光。

在8 h光照16 h黑暗處理中，試驗(yàn)牛于17:00擠奶完成后進(jìn)入密閉牛棚，保證牛棚內(nèi)全黑，夜間人工操作使用紅色LED燈作為光源，牛只眼睛處光強(qiáng)不超過(guò)2 lx；05:00擠奶完成后將試驗(yàn)牛趕入密閉牛棚；09:00將實(shí)驗(yàn)牛趕出牛棚繼續(xù)接受光照。

1.3 樣品前處理及測(cè)定 首先對(duì)血清樣和奶樣進(jìn)行解凍，血清樣解凍之后可以直接進(jìn)行褪黑素濃度的測(cè)定；在測(cè)定奶樣時(shí)，首先采用高速離心機(jī)（德國(guó)產(chǎn)D-37520 Osterode am Harz）對(duì)其進(jìn)行脫脂處理，4℃下4 000×g離心15 min。所有樣品褪黑素濃度檢測(cè)采用德國(guó)IBL公司ELISA試劑盒（RE54021），檢測(cè)過(guò)程遵循試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行初步整理，然后采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析，<0.05為差異顯著。采用Graphpad Prism8進(jìn)行折線(xiàn)圖繪制，折線(xiàn)圖中誤差的大小用標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示。

2 結(jié)果

2.1 16 h光照處理對(duì)奶牛褪黑素分泌的影響

2.1.1 16 h光照處理對(duì)奶牛血清褪黑素濃度的影響 由圖1可知，處理前2 d的平均褪黑素濃度為20.49 pg/mL，處理后在18.97 pg/mL上下波動(dòng)。16 h光照處理對(duì)血清褪黑素濃度無(wú)影響，處理1個(gè)月內(nèi)各采樣時(shí)間點(diǎn)血清褪黑素濃度無(wú)差異。

圖1 16 h光照處理對(duì)奶牛23:00血清褪黑素濃度的影響

2.1.2 16 h光照處理對(duì)日奶及夜奶中褪黑素濃度的影響 由圖2可知，日奶在處理前褪黑素濃度最高達(dá)到4.71 pg/mL，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，日奶褪黑素濃度顯著降低，處理后最低為2.18 pg/mL。由圖3可知，夜奶褪黑素濃度處理前后差異不顯著，處理前褪黑素濃度平均為6.63 pg/mL，處理后在6.60 pg/mL上下波動(dòng)。所以16 h光照處理對(duì)日奶中褪黑素濃度的影響較夜奶更為明顯。

圖2 16 h光照處理日奶中褪黑素濃度的變化

圖3 16 h光照處理夜奶中褪黑素濃度的變化

2.2 16 h黑暗處理對(duì)奶牛褪黑素分泌的影響

2.2.1 16 h黑暗處理對(duì)奶牛血清褪黑素濃度的影響 由圖4可知，處理前2 d的平均褪黑素濃度為27.03 pg/mL，隨著天數(shù)增加，血清褪黑素濃度有升高趨勢(shì)，最高達(dá)到30.92 pg/mL。16 h黑暗處理對(duì)血清褪黑素濃度無(wú)影響，在處理的1個(gè)月內(nèi)，各采樣時(shí)間點(diǎn)血清褪黑素濃度無(wú)差異。

圖4 16 h黑暗處理對(duì)奶牛23:00血清中褪黑素濃度的影響

2.2.2 16 h黑暗處理對(duì)日奶及夜奶中褪黑素濃度的影響由圖5、6可知，日奶、夜奶中褪黑素濃度均在第6天突然降低。除去第6天，日奶及夜奶褪黑素濃度均在處理第16天以后降低。在處理前，日奶褪黑素濃度平均為3.67pg/mL，處理后最低為2.63 pg/mL；夜奶褪黑素濃度處理前平均為8.72 pg/mL，處理后最低為5.70 pg/mL，16 h黑暗處理對(duì)夜奶褪黑素濃度的影響更為明顯。

圖5 16 h黑暗處理日奶中褪黑素濃度的變化

圖6 16 h黑暗處理夜奶中褪黑素濃度的變化

3 討 論

3.1 光照強(qiáng)度對(duì)褪黑素分泌的影響 褪黑素分泌受光照強(qiáng)度的制約，當(dāng)光照強(qiáng)度超過(guò)50 lx時(shí)，就會(huì)抑制奶牛褪黑素的分泌。但有研究指出，這種光照強(qiáng)度抑制的持續(xù)時(shí)間較短，一般為2 h，光照強(qiáng)度稍強(qiáng)則持續(xù)時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)，直至當(dāng)光照強(qiáng)度超過(guò)400 lx時(shí)就會(huì)抑制夜間時(shí)長(zhǎng)為8 h的整個(gè)過(guò)程。因此在實(shí)際生產(chǎn)中，生產(chǎn)天然高濃度褪黑素牛奶需要嚴(yán)格控制夜間的光照強(qiáng)度，使奶牛正常分泌褪黑素。Asher等研究發(fā)現(xiàn)，與夜間黑暗[光照強(qiáng)度（5.08±0.04）lx]相比，在夜間用光強(qiáng)為（105±3.91）lx的光照時(shí)，無(wú)論是日奶或夜奶的褪黑素濃度都相對(duì)較低?？梢?jiàn)在夜間當(dāng)光照強(qiáng)度超過(guò)一定強(qiáng)度時(shí)，就會(huì)抑制褪黑素分泌。總體來(lái)說(shuō)，嚴(yán)格控制好夜間的光照強(qiáng)度，使奶牛夜間正常分泌褪黑素，在天然高褪黑素牛奶的生產(chǎn)中是非常必要的。本試驗(yàn)中，光照處理時(shí)的光照強(qiáng)度大于300 lx，黑暗時(shí)的光照強(qiáng)度不超過(guò)2 lx，因此夜晚不會(huì)抑制褪黑素的分泌。

3.2 日、夜奶分離在天然高褪黑素奶生產(chǎn)中的必要性本試驗(yàn)中，2種光照制度中夜奶褪黑素濃度都顯著高于日奶。也有很多研究證實(shí)了這一結(jié)論，并提出夜間擠奶并實(shí)行日、夜奶分離制度是生產(chǎn)天然高褪黑素奶的有效途徑。如Eriksson等研究發(fā)現(xiàn)牛奶中褪黑素濃度在夜間增加；Romanini等測(cè)定了從30頭荷斯坦奶牛采集的奶樣中的褪黑素濃度，發(fā)現(xiàn)夜奶褪黑素濃度高于日奶（14.87±7.69 VS 6.98±3.05 pg/mL）；Milagres等研究發(fā)現(xiàn)02:00采的牛奶中褪黑素濃度（39.43 pg/mL）顯著高于15:00采的牛奶（4.03 pg/mL）。Castro等測(cè)定了12頭奶牛24 h血漿和牛奶中的褪黑素濃度，結(jié)果表明血漿和牛奶中的褪黑素濃度在暗周期高，在光周期低。與以上研究相比，本試驗(yàn)測(cè)得的奶中褪黑素濃度較低，這有可能是褪黑素濃度的測(cè)定方法不同造成，另外采奶季節(jié)、飼養(yǎng)環(huán)境和奶牛狀態(tài)等因素也會(huì)影響褪黑素濃度。

綜合以上研究，在實(shí)際生產(chǎn)中可以將夜間牛奶與日間牛奶分開(kāi)儲(chǔ)存、加工和商品化生產(chǎn)，這是獲得天然高褪黑素牛奶的一種有效途徑。

3.3 不同光照制度對(duì)牛奶中褪黑素濃度的影響 根據(jù)褪黑素的分泌特點(diǎn)，實(shí)行光控管理是生產(chǎn)天然高褪黑素奶的重要途徑。依照芬蘭專(zhuān)利中推薦的光照制度（光照/黑暗為17/7）與之前的光照制度（光照/黑暗為12/12）相比，牛奶中褪黑素濃度從8.9 pg/mL增加到56.4 pg/mL。英國(guó)專(zhuān)利中光周期比暗周期長(zhǎng)4～8 h，1次擠奶在暗周期結(jié)束前進(jìn)行，暗周期和其他時(shí)間內(nèi)的牛奶分開(kāi)收集和加工，應(yīng)用此專(zhuān)利方法生產(chǎn)的牛奶中褪黑素濃度為15～30 pg/mL。德國(guó)專(zhuān)利中光周期比暗周期長(zhǎng)8～12 h，擠奶在暗周期結(jié)束之前進(jìn)行，用該牛奶加工制作的奶粉中，群體平均的褪黑素含量大于200 pg/g，動(dòng)物個(gè)體能達(dá)到500 pg/g以上。我國(guó)專(zhuān)利中光周期和暗周期的時(shí)長(zhǎng)分別為12 h和11.5 h，采奶時(shí)間為30 min，應(yīng)用此專(zhuān)利方法生產(chǎn)的原料乳中褪黑素濃度為50～71 pg/mL。這些專(zhuān)利都對(duì)光照制度進(jìn)行了一定程度的調(diào)整，并強(qiáng)調(diào)在暗周期結(jié)束之前進(jìn)行擠奶使褪黑素濃度達(dá)到一個(gè)較高的水平。

在芬蘭、英國(guó)、德國(guó)專(zhuān)利中推薦的方法中，光照時(shí)間都超過(guò)了12 h，得到的牛奶褪黑素濃度都比較高。與以上專(zhuān)利相比，本試驗(yàn)中16 h光照8 h黑暗處理顯著降低了日奶中的褪黑素濃度，對(duì)夜奶褪黑素濃度沒(méi)有顯著影響，沒(méi)有得到與專(zhuān)利一致的結(jié)果，這可能是本試驗(yàn)設(shè)置的具體光照強(qiáng)度和光的種類(lèi)與專(zhuān)利方法以及擠奶時(shí)間不一致，詳細(xì)原因有待繼續(xù)開(kāi)展相關(guān)研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)中，16 h光照處理對(duì)夜間血清和夜奶褪黑素濃度無(wú)影響，顯著降低了日奶褪黑素濃度；16 h黑暗處理對(duì)夜間血清褪黑素濃度無(wú)影響，使日奶和夜奶中褪黑素濃度在16 d以后降低，與處理前相比夜奶褪黑素濃度降低較顯著。2種光照制度的夜奶褪黑素濃度均高于日奶褪黑素濃度，因此日、夜奶分離是生產(chǎn)天然高褪黑素奶的一種簡(jiǎn)單有效方法。