劉 攀，姜 徽，巨 星，王 丹，田月珍，付雪峰，李媛媛，茍穆榮，王 震，樊 琛，布佐拉姑麗?庫爾班，黃錫霞*

（1.新疆農業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學院，新疆烏魯木齊 830000）

新疆褐牛是我國經長期選育而成的耐粗飼、耐寒、放牧性能優(yōu)良的乳肉兼用品種牛，是新疆地區(qū)特有的品種資源。同時具有乳成分中乳脂率高、乳蛋白率高、乳房炎抗性性狀中體細胞數低等優(yōu)良特性，深受新疆本地農牧民青睞，在北疆廣大牧區(qū)中得到廣泛推廣。乳房炎是危害奶牛業(yè)最嚴重的疾病之一，發(fā)病率極高，對奶牛業(yè)造成的經濟損失也最大，一直困擾著奶牛業(yè)發(fā)展。據統計，國外奶牛乳房炎的發(fā)病率一般為25%～60%，國內發(fā)病率達20%～70%，個別牛群發(fā)病率更高。因此牛乳房炎的防治問題亟待解決。在乳品安全備受關注的今天，通過遺傳育種技術選育乳房炎抗性強的個體來降低乳房炎的發(fā)生以減少抗生素等藥物的應用尤為重要。信號轉導與轉錄激活子5（Signal Transducer and Activator of Transcription，STAT5）包括5A和5B 2種亞型，和基因主要是由其基因調控元件決定轉錄調控功能的差異，基因最初是在綿羊的乳腺中作為催乳素誘導劑被分離得到，后來在小鼠、大鼠和人的乳腺、脂肪、肝臟、卵巢等組織器官中都可以檢測到基因，并且參與催乳素和生長激素的信號轉導，在組織細胞和生物體的生長、發(fā)育、繁殖等過程中起著非常重要的作用，對家畜生長、生產影響很大。

李勝等人在研究中首次分離到全長的（2 502 bp）和（2 515 bp）基因編碼序列，在水牛乳腺中發(fā)現和基因表達量最高，在水牛腦中發(fā)現基因表達量最高，其試驗結果表明和基因主要表達于水牛乳腺上皮細胞；敲除基因導致乳腺上皮細胞（BuMECs）的功能受到抑制，乳蛋白基因的表達也顯著降低，而基因的過量表達則導致乳蛋白基因的表達顯著升高。He等利用PCR-SSCP技術發(fā)現基因多態(tài)性與荷斯坦奶牛體細胞評分和產奶性能有顯著關聯。

本實驗在前期課題組研究的基礎上運用RTqPCR技術對基因在患乳房炎和健康的新疆褐牛血液中的mRNA表達量進行研究，并且采用生物信息學分析法對基因進行分析；通過NCBI獲得牛和不同物種的基因序列，構建系統進化樹，利用多種在線分析軟件對基因編碼的蛋白進行結構分析和功能預測，并對STAT5B蛋白的亞細胞定位、信號肽的預測和跨膜結構區(qū)進行分析，旨在為后續(xù)研究新疆褐?；虻墓δ艿於ɡ碚摶A。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗動物來自烏魯木齊新疆褐牛繁育中心統一飼養(yǎng)條件下的2～3胎次新疆褐牛（6頭），進行尾根靜脈采血用于RNA提取。根據國際奶業(yè)聯合會（IDF）制定的牛奶中體細胞數推薦分級標準，將6頭新疆褐牛按照不同體細胞數分成2組：I組健康組（n=3，SCC<50萬個/mL），II組乳房炎組（n=3，SCC>100萬個/mL）。

1.1.2 主要試劑和儀器 主要試劑包括血液RNA保存管（BioTeke公司）、血液總RNA提取試劑盒（BioTeke公司）、5×All-In-One RT MasterMix反轉錄試劑盒（ABM公司）、EvaGreen Express2×qPCR MasterMix-Low Rox熒光定量試劑盒（ABM公司）、無水乙醇、氯仿、異丙醇、瓊脂糖。主要儀器包括超微量分光光度計（P100+，Pultton公司）和實時熒光定量PCR儀（LightCycler 9600，羅氏公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據NCBI收錄的牛與基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計定量引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列信息見表1。

表1 引物信息

1.2.2 血液總RNA的提取及反轉錄 按照BioTeke血液總RNA提取試劑盒步驟進行RNA提取。先對RNA進行濃度檢測，純度在1.8～1.9之間，之后進行反轉錄。反轉錄步驟根據ABM說明書進行，實驗步驟均在冰上操作，去除基因組DNA反應體系10.0 μL：RNA 6.0 μL，4×AccuRT Reaction Mix 4.0 μL，將反應液放置于PCR擴增儀中，溫度42℃，時間2 min。

反轉錄的反應體系20.0 μL：步驟一反應液8.0 μL，5×AccuRT Reaction Stopper 2.0 μL，5×All-In-One RT Master Mix 4.0 μL，RNase Free ddHO 6.0 μL，將上述 反應混合液放置于PCR擴增儀中，反應程序：25℃ 10 min，42℃ 50 min，85℃ 5 min，待反應結束后，置于冰上降溫，將獲取的cDNA迅速保存于-20℃冰箱中，用于后續(xù)熒光定量實驗。

1.2.3 PCR反應 以健康新疆褐牛和患乳房炎新疆褐牛血液反轉錄得到的cDNA為模板，按照實時熒光定量PCR試劑盒（ABM）進行擴增反應。實時熒光定量PCR的擴增體系20.0 μL：cDNA 1.0 μL，TB Green Premix Ex Taq II（2×）10.0 μL，上、下游引物（濃度均為10 μmol/L）各1.0 μL，RNase Free ddHO 7.0 μL。擴增程序：95℃ 3 min；95℃ 5 s，60℃ 3 min，95℃ 1 min，40個循環(huán)；4℃保存。擴增結束后分析熔解曲線。

1.3 統計與分析 本實驗采用2方法計算基因在不同乳房健康程度新疆褐牛中的相對表達量，以基因為參照基因，而后利用SPSS19.0軟件中的獨立樣本T檢驗法分析，比較2組不同乳房健康程度新疆褐牛目的基因表達量差異分析。

1.4 生物信息學分析

1.4.1 不同物種基因序列的獲取 利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫獲得牛（）、山羊（）、野豬（）、單峰駱駝（）、非洲野驢（）、普氏野馬（）、彎角大羚羊（）、水牛）、家貓（）的基因序列，登錄號分別為（NM_174617.4、XM_018065117.1、XM_021066239.1、XM_031468752.1、XM_014833666.1、XM_023652509.1、XM_040245263.1、XM_025280122.1、XM_023244609.1）。

1.4.2 生物信息學分析軟件 利用線上軟件Expasy的ProtParam tool模塊（https://web.expasy.org/protparam/）對蛋白質理化性質和一級結構進行分析。利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）對蛋白質的親水性與疏水性進行預測?；蚓幋a蛋白的二級結構使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）在線軟件對其進行預測；運用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件對蛋白質三級結構進行預測。運用MEGA 7.0軟件構建牛、山羊、野豬、單峰駱駝、非洲野驢、普氏野馬、彎角大羚羊、水牛、家貓共9個物種的基因同源序列的系統進化樹。采用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析工具進行蛋白質跨膜域分析，用SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析工具進行蛋白信號肽的預測，用WoLF PSORT（https://psort.hgc.jp/）分析工具進行蛋白亞細胞定位。

1.4.3基因編碼蛋白質理化性質和一級結構預測蛋白質的一級結構指的是蛋白質分子中氨基酸殘基的排列序列，蛋白質的氨基酸序列測定對理解其結構與功能以及生物進化遺傳變異的關系具有重要意義。利用線上軟件Expasy的ProtParam tool模塊對蛋白質進行物理性質及一級結構的分析，運用該軟件ProtScale模塊預測STAT5B編碼蛋白的親水性與疏水性。

1.4.4基因蛋白質二、三級結構預測 蛋白質二級結構是指周期性地出現在蛋白質肽鏈上的連續(xù)氨基酸片段，主要指-螺旋和-轉角。基因編碼蛋白的二級結構使用SOPMA在線軟件對其進行預測；運用SWISS-MODEL在線軟件對蛋白質三級結構進行預測。

1.4.5基因系統進化樹的構建 系統進化樹是描述生物有機體形成或進化順序的拓撲結構，以及被認為具有共同祖先的各物種相互進化關系的樹形。因此構建系統發(fā)育樹對各物種親緣關系的對比具有更直觀的體現。通過在NCBI網站上下載?；虻暮怂嵝蛄?，并使用此網站上的BLAST進行牛與其同源動物基因序列相似性比對分析，最終選擇下載牛、山羊、野豬、單峰駱駝、非洲野驢、普氏野馬、彎角大羚羊、水牛、家貓共9個物種該基因同源序列，再將序列導入MEGA 7.0軟件以構建基因的系統進化樹，從而獲得各物種之間的親緣關系。

1.4.6基因編碼蛋白的亞細胞定位、信號肽的預測和跨膜結構區(qū)分析 蛋白質功能與亞細胞定位具有密切聯系，蛋白質只有在特定的亞細胞中才可以發(fā)揮正常功能，蛋白質亞細胞定位信息可以為蛋白質功能預測提供有用的線索。信號肽在外源蛋白質的表達中具有重要作用，信號肽的提出為下一步研究蛋白質的結構和功能奠定了一定的基礎。通過分析工具TMHMM Server v.2.0、SignalP-5.0 Server、WoLF PSORT對STAT5B蛋白進行分析，可以檢測出STAT5B蛋白是否含有跨膜區(qū)；進行信號肽的預測，該蛋白是否存在信號肽，是否能引導蛋白質的跨膜運輸；進行亞細胞定位，預測STAT5B蛋白表達產物在細胞內的具體存在部位。

2 結果

2.1 熔解曲線及擴增曲線的分析 采用實時熒光定量PCR對基因在不同乳房健康程度的新疆褐牛血液中的表達量進行分析，結果顯示，目的基因和內參基因的擴增曲線都呈現出S型熒光定量動力學曲線，擴增曲線集中且流暢，重復性高，Ct值間隔均勻，擴增指數基本一致。

基因與內參基因的熔解曲線清晰流暢且曲線集中，各基因的熔解峰有且只有一個，表明未出現引物二聚體，熔解溫度相對較高且基本一致，結果真實可靠。擴增曲線圖、熔解曲線與熔解峰圖見圖1A、圖1B、圖1C和圖2A、圖2B、圖2C。

圖1 A STAT5B擴增曲線

圖1 B STAT5B熔解曲線

圖1 C STAT5B溶解峰

圖2 A GAPDH擴增曲線

圖2 B GAPDH熔解曲線

圖2 C GAPDH溶解峰

2.2 新疆褐牛乳房炎抗性相關基因的相對表達量結果分析 根據牛奶中體細胞數推薦分級標準，將6頭新疆褐牛按照不同體細胞數分成健康組和患乳房炎組（各3頭）。通過SPSS19.0分析后，表明基因在檢測的2組新疆褐牛的血液中均有表達，基因對奶牛乳房炎影響不顯著。但基因在健康新疆褐牛血液中的表達量高于患乳房炎的新疆褐牛（圖3），表明基因可能對新疆褐牛乳房炎抗性有一定的作用。

圖3 STAT5B基因在健康和患乳房炎牛中的相對表達量分析圖

2.3基因編碼蛋白的理化性質和氨基酸組成通過ExPASy網站分別分析基因編碼蛋白的理化性質及一級結構結果（表2）、氨基酸組成結果（圖4）?；蚓幋a蛋白的分子式CHNOS，總共12 602個原子，分子量為89 943.02，由787個氨基酸共同編碼，其中95個為帶負電荷氨基酸（Asp+Glu），79個為帶正電荷氨基酸（Arg+Lys），不穩(wěn)定參數高達51.52，結果表明該蛋白為較不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數為86，總平均親水性為-0.472，氨基酸組成分析表明：含量最高的是亮氨酸（10.5%），其次是谷氨酰胺（9.7%），含量最低的是半胱氨酸（1.1%）。

表2 STAT5B基因編碼蛋白的理化性質

圖4 STAT5B基因編碼蛋白的氨基酸組分

2.4基因編碼蛋白二、三級結構分析 利用在線軟件對基因編碼蛋白進行蛋白二級結構預測，結果見圖5。該蛋白質中-螺旋高達50.95%，無規(guī)則卷曲占比34.69%，延伸鏈占比11.69%，-折疊的含量僅占2.67%。結果顯示-螺旋及無規(guī)則卷曲是整體蛋白質結構中的主要組成結構元件，最后利用SWISS-MOLD在線工具對基因編碼蛋白三級結構進行建模預測（圖6）。

圖5 STAT5B基因編碼蛋白二級結構

圖6 STAT5B基因編碼蛋白三級結構

2.5基因編碼蛋白疏水性/親水性分析 由圖7可知，小于0的數值（位于第二象限）稍多于大于0的數值（位于第一象限），且該蛋白的最高值2.944，在第466個氨基酸處，此處疏水性最強；最低值-3.100，在第388個氨基酸處，此處親水性最強。綜上可得，STAT5B蛋白是一種親水性蛋白。

圖7 STAT5B基因編碼蛋白的親水性/疏水性預測

2.6基因編碼蛋白的同源性分析 通過使用在線軟件BLAST進行?；虻暮怂嵝蛄斜葘Γ阉髋c其同源性較高的物種，進行同源性分析和比較。下載該基因同源物的核酸序列后再用MEGA7.0軟件構建基因的系統進化樹，結果顯示：?；蚺c水牛（）親緣關系最近，同源性為98.80%，其次與彎角大羚羊（）親緣關系較近，同源性為97.80%。在哺乳動物中家貓（）跟?；蛴H緣關系較遠，同源性為92.72%（圖8）。

圖8 9個物種的STAT5B基因編碼產物的系統進化樹

2.7 STAT5B蛋白的亞細胞定位、信號肽的預測和跨膜結構區(qū)分析

2.7.1 STAT5B蛋白亞細胞定位 通過對STAT5B蛋白進行亞細胞定位，得到結果顯示：蛋白主要位于細胞質，可能性為52.2%，其次小部分存于細胞核和線粒體，其可能性分別為26.1%和13.0%，位于細胞骨架和細胞膜的STAT5B蛋白含量可能性相等，均為4.3%。因此，推測該蛋白主要在細胞質中發(fā)揮其性能。

2.7.2 STAT5B蛋白信號肽的預測 對STAT5B蛋白進行信號肽預測，結果顯示：基因編碼蛋白質的氨基酸殘基信號肽最大分值為0.001，表明該蛋白不是分泌蛋白，從而不能進行跨膜轉移或定位。

2.7.3 STAT5B蛋白的跨膜結構區(qū)分析 對STAT5B蛋白進行跨膜結構區(qū)分析，結果表明：基因編碼蛋白沒有明顯的跨膜結構（圖9），表明STAT5B蛋白不存在信號肽序列，可以高效表達。

圖9 STAT5B基因編碼蛋白的跨膜結構域分析

3 討 論

3.1 不同乳房健康程度新疆褐?；虻谋磉_量分析 目前，基因與新疆褐牛乳房炎和泌乳性狀關系的研究較少，通過查閱資料發(fā)現，基因參與調節(jié)GH引起的脂肪分解，活化的二聚體能夠在細胞核內調節(jié)一系列與脂代謝相關的基因表達，而在和敲除的小鼠體內，GH引起的脂解作用消失。Urioste等研究發(fā)現，奶牛測定日SCC的標準偏差與臨床乳腺炎密切相關。Tahir等通過候選基因法在基因檢測到2個SNPs，其中基因的SNP1的野生型AA基因型與低水平的SCC、SCS和IL4顯著相關；SNP2與血清細胞因子和奶牛乳房炎顯著相關。何陽花等研究發(fā)現荷斯坦奶?；虻腟NP可能對乳蛋白量、對乳脂率、產奶量和SCS有顯著影響。本研究通過RT-qPCR分析基因在不同乳房健康程度的新疆褐牛中的表達量，結果發(fā)現基因對奶牛乳房炎影響不顯著，但基因在健康新疆褐牛血液中的表達量高于患乳房炎的新疆褐牛，推測該基因的存在可能起著抑制新疆褐牛乳房炎發(fā)生的作用。對于新疆褐?；蚴欠駞⑴c新疆褐牛乳房炎炎癥抗性的生物學過程，還需要進一步研究。

3.2基因生物信息學分析 蛋白質是構成生物體的重要組成之一，是生物體發(fā)揮正常功能的基礎，通過了解蛋白質的結構，可以理解生命中許多本質問題。具有廣泛的生物學作用，主要參與催乳素和生長激素的信號轉導，參與免疫炎癥反應，參與調控組織細胞的增殖、分化和凋亡。姜徽等研究發(fā)現，基因可能通過調節(jié)IL-2的合成來間接影響牛乳房炎。通過對基因編碼蛋白質結構進行分析，能夠確認功能單位或者結構域，從而指導設計進行功能確認的生物學實驗，為遺傳操作提供目標，為新疆褐牛乳房炎抗性的機制研究提供可靠依據。

本實驗通過對下載的基因序列進行生物信息學分析，推測STAT5B蛋白可能對新疆褐牛乳房炎抗性具有調控功能。生物信息學分析表明：STAT5B編碼787個氨基酸，脂肪系數為86，總平均親水性為-0.472（<0），不穩(wěn)定參數高達51.52，推測STAT5B蛋白是一種親水性蛋白，其半衰期較短，為不穩(wěn)定蛋白質。蛋白質的二級結構是蛋白質三維結構的基礎，是在二級結構的基礎上進一步盤繞、折疊形成的。-螺旋及無規(guī)則卷曲占STAT5B蛋白質結構中的絕大部分，成功的預測蛋白二級結構有助于正確建立序列對比關系?；虻腄NA序列系統進化樹顯示?；蚺c水牛的親緣關系最為接近，其次與彎角大羚羊的親緣關系較為接近，說明該基因在不同物種上可能存在著一定的差異。對基因編碼蛋白的亞細胞定位預測發(fā)現，蛋白主要分布在細胞的細胞質內，研究表明，STAT5B蛋白是胞質蛋白質的可能性較大。進行信號肽和跨膜區(qū)分析發(fā)現，此蛋白的N端均無信號肽，因此推測這些蛋白為非分泌蛋白質，沒有明顯跨膜結構區(qū)，從而不能進行跨膜轉移或定位。對STAT5B編碼蛋白進行生物信息學分析，為進一步了解和分析STAT5B的結構與功能提供了理論依據。

4 結 論

本實驗通過生物信息學分析的方法對牛基因編碼的蛋白進行分析及功能預測，結果發(fā)現基因編碼蛋白的分子式為CHNOS，總共12 602個原子，分子量為89 943.02，由787個氨基酸共同編碼，屬不穩(wěn)定的親水性蛋白；基因的DNA序列系統進化樹顯示牛基因與水牛的親緣關系較為接近，與家貓關系較遠。RT-qPCR結果表明，基因對奶牛乳房炎影響不顯著。本研究結果為后期進一步研究和驗證基因的結構和功能提供了一定的理論參考。