吳壽堂，祝家秘，溫曉艷，周志楠，陳 祥*

（1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

黔北麻羊（Qianbei Ma goat）又名麻羊，主產(chǎn)于貴州省北部地區(qū)的遵義市仁懷市與習(xí)水縣等地，是基于貴州省較為獨(dú)特的喀斯特地貌而形成的具有獨(dú)特特性的地方山羊品種。身處云貴高原地區(qū)的黔北麻羊能較好地適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂颉⒆匀缓偷乩憝h(huán)境。在生產(chǎn)性能方面，黔北麻羊體格較大、體質(zhì)結(jié)實(shí)、四肢粗壯，屬毛皮肉兼用型品種，皮膚大多為花色，因遺傳性能穩(wěn)定、抗逆性強(qiáng)、耐粗飼、繁殖力高而聞名，是寶貴的畜禽遺傳資源。

視黃醇（Retinol）是維生素A的化名，分子式為CHO，其具有維持正常視覺、促進(jìn)生長發(fā)育、調(diào)節(jié)營養(yǎng)等重要功能，對(duì)哺乳動(dòng)物的生長發(fā)育十分重要。早期研究表明，在體內(nèi)，視黃醇通過代謝演變?yōu)榛钚砸蜃右朁S酸（Retinoic Acid，RA）在體內(nèi)調(diào)控RNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度，進(jìn)而影響哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞的生長發(fā)育以及氨基酸的吸收和發(fā)揮。而RA的活性主要由視黃酸受體（Retinoic Acid Receptors，）和類視黃醇X受體（Retinoid X receptors，）所介導(dǎo)，進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用。RARs是RA誘導(dǎo)的屬于類固醇和甲狀腺激素受體超家族的轉(zhuǎn)錄加強(qiáng)因子，也是RXRs的一種異二聚體，相對(duì)于，在多種信號(hào)通路中起到主要的調(diào)控作用。RARs具有和3種亞型。研究表明，在調(diào)節(jié)各種細(xì)胞的增殖發(fā)育、形態(tài)變化、代謝、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等多個(gè)方面具有廣泛的生物學(xué)活性。最新數(shù)據(jù)顯示，家族基因中（）、（）和（）分別定位在山羊的第19號(hào)、第27號(hào)、第5號(hào)染色體上，染色體的不同定位證實(shí)了視黃酸受體家族基因功能的多樣性。此外，還有研究顯示基因在大白豬的性腺組織中也具有廣泛的表達(dá)，現(xiàn)如今，還被當(dāng)作是小尾寒羊（綿羊）高繁殖力的差異基因。

目前，家族基因在豬、牛、綿羊等動(dòng)物組織表達(dá)中均有研究報(bào)道，但其在山羊不同組織中的表達(dá)研究尚未發(fā)現(xiàn)，故本實(shí)驗(yàn)以貴州優(yōu)良地方山羊品種黔北麻羊?yàn)檠芯繉?duì)象，探究家族基因在黔北麻羊不同組織中的表達(dá)量，以期為后續(xù)進(jìn)一步研究家族基因功能以及對(duì)山羊繁殖性狀的調(diào)控機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 黔北麻羊來自貴州省習(xí)水縣，選取健康、體況相近的母羊3頭，依據(jù)貴州省地方標(biāo)準(zhǔn)《羊屠宰操作規(guī)程》（DB22/T 2740-2017）進(jìn)行屠宰，立即采集心臟、下丘腦、肝臟、垂體、脾臟、子宮、肺臟、輸卵管、腎臟以及卵巢10個(gè)組織進(jìn)行相應(yīng)處理。于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器與試劑 紫外光分光光度計(jì)（Qubit 4，Thermo Fisher）；電泳儀（DYY-2C型，六一儀器廠）；PCR擴(kuò) 增 儀（C1000 TouchTM，Thermo Fisher）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96 Real-Time System，Bio-Bad）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood II，Bio-Bad）。TRIzol試劑、液氮、三氯甲烷、0.5×TAE緩沖液、異丙醇、75%乙醇、西班牙瓊脂糖均購自貴州羅德宏信生物技術(shù)有限公司；熒光定量試劑2×Ts Master RT-qPCR Mix（擎科生物）；第一鏈cDNA合成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（康為世紀(jì)）。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的山羊（）基因序列（登錄號(hào)：XM_018065 032.1）、基因序列（登錄號(hào)：XM_013975483.2）、基因序列（登錄號(hào)：XM_018047691.1），運(yùn)用軟件Primer 5.064設(shè)計(jì)熒光引物，以作為熒光定量的內(nèi)參基因。引物由生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)股份有限公司合成。詳細(xì)信息見表1。

表1 引物信息

1.4 RNA的提取及cDNA合成 按照TRIzol結(jié)合液氮研磨以提取黔北麻羊心臟、下丘腦、肝臟、垂體、脾臟、子宮、肺臟、輸卵管、腎臟以及卵巢10個(gè)組織的總RNA，隨后于超微量分光光度計(jì)下進(jìn)行檢測(cè)，若圖像呈現(xiàn)單峰、曲線平滑并且D/D值在1.8～2.0區(qū)間內(nèi)，則證明所提取的RNA沒有被污染，可用于進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)研究。根據(jù)HiFi Script cDNA Synthesis Kit試劑盒（康為世紀(jì)）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，超微量分光光度計(jì)下測(cè)定其濃度，合格的產(chǎn)物放置于-20°保存。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR RT-qPCR反應(yīng)體系為10 μL：2×UltraSYBR Mixture 5 μL、cDNA（1 000 ng/μL）1 μL、Primer sense（10 μmol/L）0.5 μL、Primer Anti-sense（10 μmol/L）0.5 μL、ddHO 3 μL。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s、62.3℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取平均值，檢測(cè)與基因在黔北麻羊心臟、下丘腦、肝臟、垂體、脾臟、子宮、肺臟、輸卵管、腎臟以及卵巢10個(gè)組織的表達(dá)水平。

1.6 數(shù)據(jù)分析 用Excel軟件預(yù)先處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，然后使用2法分析黔北麻羊與基因在10個(gè)組織中的差異表達(dá)，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1與基因引物特異性檢測(cè) 使用PCR法擴(kuò)增、基因的熒光引物序列，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其特異性。結(jié)果顯示如圖1：與顯示出與目的片段一致的亮帶，且無非特異性擴(kuò)增，證實(shí)引物特異性良好。

圖1 RARA、RARB與RARG基因擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)R與基因特異性 如圖2～4所示，在各組織中與基因擴(kuò)增曲線呈“S”形狀，整體趨勢(shì)一致。熔解曲線呈現(xiàn)單峰，且較為集中，無雙峰及雜亂條帶，證明與基因特異性較好。

圖2 RARA基因擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖3 RARB基因擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖4 RARG基因擴(kuò)增曲線和熔解曲線

2.3 黔北麻羊不同組織中基因mRNA表達(dá)量分析 黔北麻羊基因在不同組織中均有表達(dá)（圖5）?；蛟谇甭檠虿煌M織中的表達(dá)量由大到小依次為肝>心>下丘腦>脾>垂體>肺>輸卵管>子宮>腎>卵巢，其中肝臟的表達(dá)量極顯著高于所有組織，心、脾、下丘腦及垂體中基因的表達(dá)量均顯著高于肺、腎、子宮和輸卵管，其余組織間均未達(dá)到差異顯著水平。

圖5 RARA基因在黔北麻羊不同組織中的差異表達(dá)量

2.4 黔北麻羊不同組織中基因mRNA表達(dá)量分析基因在黔北麻羊的不同組織中均有表達(dá)（圖6），其中輸卵管表達(dá)量極顯著高于其他組織，其余組織之間則呈不顯著差異，黔北麻羊基因表達(dá)由高到低依次為輸卵管>下丘腦>子宮>卵巢>肝>心>肺>腎>垂體>脾。

圖6 RARB基因在黔北麻羊不同組織中的差異表達(dá)量

2.5 黔北麻羊不同組織中基因mRNA表達(dá)量分析基因在黔北麻羊10個(gè)不同組織中也存在著不同程度的表達(dá)（圖7），基因的表達(dá)量由高到低依次為下丘腦>卵巢>輸卵管>肝>心>子宮>腎>肺>垂體>脾，且下丘腦中基因的表達(dá)量極顯著高于所有組織，基因在卵巢的表達(dá)量極顯著高于除下丘腦以外的其余組織，其余組織間差異不顯著。

圖7 RARG基因在黔北麻羊不同組織中的差異表達(dá)量

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以黔北麻羊?yàn)閷?duì)象，利用RT-qPCR技術(shù)，檢測(cè)在黔北麻羊的不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與基因在黔北麻羊的不同組織中均有表達(dá)，說明這3個(gè)基因的表達(dá)具有廣譜性。

維生素A是畜牧行業(yè)的必需物質(zhì)，已被證實(shí)能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體上皮細(xì)胞的生長并維持動(dòng)物機(jī)體的正常發(fā)育，故其在體內(nèi)的含量對(duì)哺乳動(dòng)物的生長發(fā)育及繁殖十分重要。作為維生素A的代謝產(chǎn)物之一，RA對(duì)細(xì)胞增殖、分化、免疫反應(yīng)、視覺形成、精子形成等各方面均具有十分重要的作用，RA可以進(jìn)入細(xì)胞核并與RARs結(jié)合以促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄，而作為RAR受體家族成員在調(diào)控RA生理功能方面具有重要作用?，F(xiàn)如今，已經(jīng)證實(shí)RARs對(duì)于腦、脊髓、心臟、眼睛、骨骼、肺等器官的早期發(fā)育十分重要。而本研究發(fā)現(xiàn)基因（）在黔北麻羊10個(gè)不同組織均具有廣泛的表達(dá)，這與視黃酸生理功能及維生素A在體內(nèi)的分布機(jī)制相符。此外，RARs家族基因?qū)Σ溉閯?dòng)物的繁殖機(jī)能十分重要。當(dāng)基因在動(dòng)物脂肪組織中被切除后，能影響動(dòng)物機(jī)體脂肪細(xì)胞的分化等其他性狀。本研究發(fā)現(xiàn)基因在黔北麻羊肝臟中的表達(dá)量最高，在肺和卵巢中的表達(dá)量較低，這與前人在180日齡與270日齡的大白豬中基因時(shí)空表達(dá)差異的研究結(jié)果類似，且其發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)隨著日齡的升高而增加，在1日齡肝臟中的表達(dá)量較低，因本研究選用的黔北麻羊屠宰時(shí)約為36周齡（252日齡），故其在肝臟中的表達(dá)量相對(duì)較高可能是由于黔北麻羊的生長發(fā)育所致。卵巢基因表達(dá)量較低可能是由于羊自身生理狀態(tài)較差，進(jìn)而使其消化、吸收能力減弱或卵巢卵泡退化或存在病理狀態(tài)所致。是不同于的另一種RARs，其可以通過信號(hào)通路誘導(dǎo)RARRES 1、2和3在子宮及胎盤中表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)除垂體外，基因在黔北麻羊性腺組織中的表達(dá)量普遍高于非性腺組織，且在輸卵管中的表達(dá)量最高，這與前人使用免疫組化所檢測(cè)出的結(jié)果相似。楊國偉等人發(fā)現(xiàn)基因在大白豬中存在時(shí)空表達(dá)差異，在心、腎、卵巢中存在持續(xù)高表達(dá)，與本研究結(jié)果類似。故本研究推測(cè)基因在性腺中的高表達(dá)可能對(duì)調(diào)控黔北麻羊的繁殖性能存在一定影響。早在1995年，Look等人發(fā)現(xiàn)在成年大鼠和人類中，基因在皮膚中高表達(dá)，在肺、脾與腎臟中表達(dá)量較低?；蚰軌蛟谪i的關(guān)鍵妊娠時(shí)期表達(dá)，也能夠控制豬的產(chǎn)仔性狀。此外，大量研究證明基因的遺傳變異與豬、綿羊的繁殖力高度相關(guān)?，F(xiàn)如今，也被認(rèn)為是母羊多胎性狀的候選基因。綿羊基因在心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、十二指腸、淋巴、下丘腦、垂體、肌肉、睪丸等12個(gè)組織中均有表達(dá)，證實(shí)了基因在綿羊中廣譜表達(dá)。此外，李俊等研究發(fā)現(xiàn)在從江香豬卵巢、輸卵管與子宮中均存在較高的表達(dá)。而本研究發(fā)現(xiàn)黔北麻羊基因在10個(gè)組織中均有表達(dá)，在下丘腦和卵巢中的表達(dá)量較高，極顯著高于其他組織，其次是輸卵管，在子宮、肺、脾、腎中的表達(dá)量相對(duì)較低，這與Look等與王維民等人的研究結(jié)果基本一致，但在子宮中的表達(dá)量較低與李俊等人的研究結(jié)果不符，推測(cè)可能是由于物種不同或其組織生理狀態(tài)不同所致。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用RT-qPCR檢測(cè)了與基因在黔北麻羊10個(gè)組織中的表達(dá)水平，結(jié)果表明3個(gè)基因在黔北麻羊不同組織均有不同程度的表達(dá)，基因表達(dá)高于肝臟，基因表達(dá)高于輸卵管，而基因在下丘腦中的表達(dá)量最高。研究結(jié)果可為進(jìn)一步探究其對(duì)山羊繁殖性狀的調(diào)控機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。