趙一萍，康德措，杜 明，蘇少鋒，李雅靜，其日格日，白東義，李 蓓，芒 來*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬屬動物遺傳育種與繁殖科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬屬動物研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.興安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭浩特 137400）

（Nuclear Factor-Kappa B，核轉(zhuǎn)錄因子kappa B）作為多種信號傳導(dǎo)途徑中的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，廣泛存在于機(jī)體不同種類的細(xì)胞中。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子等基因的表達(dá)，從而在對外界刺激響應(yīng)、機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)、抗病原體等過程中發(fā)揮著積極的作用。Sen等首次發(fā)現(xiàn)了NF-B蛋白，其是一種核蛋白，能與免疫球蛋白輕鏈基因的增強(qiáng)子B序列進(jìn)行特異結(jié)合，因而得名為NF-B。NF-B是一個(gè)可誘導(dǎo)的二聚體轉(zhuǎn)錄因子家族，包括5種蛋白：p65（RelA）、NF-B1（p50/p105）、NF-B2（p52/p100）、RelB和c-Rel，最常見的形式是由p50（NF-B1）和p65（RelA）形成的異源二聚體。在靜止細(xì)胞中，NF-B與IB（Inhibitory NF-B，NF-B抑 制 蛋 白）結(jié)合，此時(shí)胞漿中NF-B處于無活性的狀態(tài)；當(dāng)IBs蛋白被泛素化修飾，進(jìn)而被降解，從而與NF-B二聚體解離，釋放NF-B二聚體，獲得自由的NF-B二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄。鑒于NF-B既可以參與天然免疫應(yīng)答，又可以調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答，因此NF-B信號通路與細(xì)胞因子的相關(guān)研究一直處于免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)，但關(guān)于馬屬動物NF-B信號通路的研究較少。蒙古馬作為優(yōu)秀的地方馬種，具有抗病力強(qiáng)、耐粗飼等特征，NF-B信號通路是否在蒙古馬較強(qiáng)的抗病力中發(fā)揮作用未見報(bào)道。本研究對NF-B信號通路相關(guān)基因在蒙古馬肝臟、脾臟、肺臟和血液組織中表達(dá)進(jìn)行分析，為研究NF-B信號通路在馬匹正常狀態(tài)下機(jī)體固有免疫調(diào)控等過程中的作用奠定了理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 從內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市達(dá)茂旗隨機(jī)選擇3匹健康的蒙古馬（雄性，平均年齡3.67±1.53歲），頸靜脈采集血液（EDTA抗凝劑）；屠宰過程中采集組織（脾臟、肺臟和肝臟），將采集到的所有樣品快速置于液氮中暫為保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后存放于-80℃冰箱中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad CFX96 Touch，美國），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad Gel Doc XR+，美國），酶標(biāo)儀（Thermo NanoDrop 2000C，美國），WB轉(zhuǎn)移電泳槽（Tanon VE186，上海）。

1.2.2 主要試劑 Trizol、TB GreenPremix Ex TaqII定量試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，大連），BCA蛋白定量試劑盒（Cwbiotech，北京），兔多克隆NF-B p65抗體、山羊多克隆IL-1抗體（Abcam，上海），小鼠單克隆-actin抗體（ZSGBBIO，北京），羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG抗體（Jackson，美國）。

1.3 熒光定量PCR

1.3.1 引物合成 以馬-基因?yàn)閮?nèi)參基因，選取NF-B通路上的相關(guān)基因和為目的基因。根據(jù)NCBI收錄的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，通過NCBI中的Blast功能檢測各引物的特異性，引物具體信息見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.3.2 總RNA提取 按照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行總RNA的提取，并通過酶標(biāo)儀檢測總RNA的純度和濃度，nm/nm值在1.8～2.0之間且濃度較高的RNA樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA置于-80℃保存。qRT-PCR反應(yīng)體系按照試劑盒說明書配制，共20 μL：TB Green Premix ExTaqII 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddHO 6 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性60 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。為減少實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的誤差，每個(gè)樣品進(jìn)行了3次重復(fù)。

1.4 免疫印跡分析 按照常規(guī)方法提取肺臟中總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度。然后通過制膠、蛋白變性、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、成像和灰度分析等步驟對目的蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析 以-基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用2定量分析方法，對NF-B信號通路上基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。采用IBM SPSS Statistics 26軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古馬免疫組織NF-B通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析 NF-B信號通路相關(guān)基因在肝臟、脾臟、肺臟和血液中均有表達(dá)，且在肺臟中的表達(dá)最高，在脾臟或肝臟中的表達(dá)最低。基因在4個(gè)組織中的表達(dá)水平高于其他4個(gè)基因（圖1）。7個(gè)基因在4個(gè)組織中的表達(dá)存在差異，NF-B p50基因在肺臟中的表達(dá)顯著高于在肝臟、脾臟、血液中的表達(dá)；基因在肺臟中的表達(dá)極顯著高于在肝臟、脾臟中的表達(dá)，顯著高于在血液中的表達(dá)；基因在肺臟中的表達(dá)顯著高于在肝臟、脾臟和血液中的表達(dá)；基因在肺臟中的表達(dá)顯著高于在肝臟中的表達(dá)；基因、基因和基因在各組織之間的表達(dá)差異不顯著（≥0.05）。

圖1 蒙古馬肝臟、脾臟、肺臟和血液組織中NF-κB通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)量

2.2 蒙古馬免疫組織NF-B通路相關(guān)基因蛋白水平表達(dá)分析 NF-B p65和IL-1蛋白在蒙古馬4個(gè)組織中均有表達(dá)；NF-B p65蛋白在脾臟中表達(dá)較高，其次為在肝臟、血液、肺臟中的表達(dá)量；IL-1蛋白在4個(gè)組織中的表達(dá)量從高到低順序依次為肺臟、脾臟、肝臟和血液（圖2）。

圖2 蒙古馬肝臟、脾臟、肺臟和血液組織中NF-κB p65和IL-1β蛋白表達(dá)

3 討 論

NF-B參與多種生理和病理過程，在固有和獲得性免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖與分化、炎癥反應(yīng)、疾病反應(yīng)過程中都起到重要作用，具有廣泛的生物學(xué)活性。未活化的NF-B p50/NF-B p65異源二聚體與抑制蛋白結(jié)合定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)抑制蛋白被降解，釋放出NFB p50/NF-B p65二聚體，活化的NF-B p50/NF-B p65異源二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，立即啟動多種細(xì)胞因子基因、生長因子基因、黏附分子基因和急性反應(yīng)蛋白基因等的轉(zhuǎn)錄。Li等對杜洛克豬不同組織中基因的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同組織之間的差別明顯，較高水平表達(dá)的組織有肺臟、脾臟、肝臟和小腸，表達(dá)中等水平的組織包括腎臟和胃，較低水平表達(dá)的組織為心臟、背最長肌和腿肌，說明基因在豬免疫器官的表達(dá)量相對較高。本研究對蒙古馬免疫組織中基因的表達(dá)測定結(jié)果與杜洛克豬免疫器官的表達(dá)趨勢基本一致，在肺臟中的表達(dá)最高，其次為肝臟和脾臟，這充分說明基因在免疫調(diào)節(jié)中的重要性。劉霞等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肺臟組織中基因的表達(dá)量略高于基因。本研究檢測4個(gè)組織（肝臟、脾臟、肺臟、血液）中基因均處于較高水平的表達(dá)，其中基因表達(dá)量均高于基因。NF-B p50與NF-B p65形成異源二聚體，故二者的表達(dá)趨勢一致。NF-B p65蛋白在脾臟中表達(dá)最高，在肺臟中表達(dá)最低，這與mRNA水平檢測結(jié)果相反，基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯、翻譯后調(diào)控最終形成NF-B p65蛋白，在不同組織中此過程各環(huán)節(jié)間存在的差異導(dǎo)致了mRNA和蛋白表達(dá)的不一致。

NF-B激活后由胞漿快速移位進(jìn)入胞核，并與靶基因的B基序結(jié)合啟動基因轉(zhuǎn)錄，釋放IL-1、TNF-α等促炎因子?；蛟诓煌M織中表達(dá)量存在差異，本研究檢測到基因和IL-1蛋白在肺臟中的表達(dá)都高于其他3個(gè)組織。這可能由于蒙古馬肺臟受到病原微生物的刺激，機(jī)體啟動防御系統(tǒng)來幫助機(jī)體清理入侵的病原微生物和損傷修復(fù)。IL-1增加可以進(jìn)一步啟動IL-1/NF-B的信號通路。NF-B信號通路在馬匹中研究的相對較少，Bureau等評估健康馬和受肺氣腫影響的馬（哮喘動物模型）支氣管細(xì)胞中NF-B活性，發(fā)現(xiàn)在健康馬中NF-B存在較少，受肺氣腫影響的馬在危險(xiǎn)期NF-B活性處于高水平。Uhl等發(fā)現(xiàn)馬駒接種馬紅球菌后細(xì)胞核內(nèi)NF-B活性增加，同時(shí)細(xì)胞因子表達(dá)也明顯增加。馬匹在受到外界刺激（肺氣腫或接種馬紅球菌）后，機(jī)體將激活NF-B，NF-B活性增強(qiáng)，啟動下游細(xì)胞因子等表達(dá)。本研究檢測的7個(gè)基因與其他組織相比在肺臟中的表達(dá)量均相對較高，這可能是由于內(nèi)蒙古地區(qū)風(fēng)沙較大，蒙古馬放牧在草原上，為了適應(yīng)惡劣的風(fēng)沙環(huán)境所致。本實(shí)驗(yàn)所用蒙古馬均未患有肺部疾病，但肺部NF-B高表達(dá)水平是否起到預(yù)警的作用需要后續(xù)研究進(jìn)一步論證。

4 結(jié) 論

本研究利用qRT-PCR和Western Blot方法分析了NF-B信號通路上7個(gè)基因在蒙古馬免疫組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，7個(gè)基因在蒙古馬肝臟、脾臟、肺臟和血液組織均有表達(dá)但存在差異，在肺臟中的表達(dá)量較高，這可能與蒙古馬適應(yīng)內(nèi)蒙古地區(qū)風(fēng)沙較大的環(huán)境有關(guān)。