陳俊宇，孔偉華，黃 怡，吳成茹，崔 琦，劉巨釗

(浙江中醫(yī)藥大學藥學院1，杭州 311402)(浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院2，杭州 310053)(浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院3，杭州 310053)

楊梅(Myricarubra)是楊梅科楊梅屬植物，分布于我國南部各省，生于低山丘陵向陽山坡或山谷中，至今已有上千年的栽培歷史[1,2]。作為重要的藥食同源植物，楊梅的根、樹皮、果實均可入藥，其藥用價值最早記載于唐代孟詵編纂的《食療本草》中，《本草綱目》中記載其果實可入藥，其味甘酸，性溫，可用于治療扁桃體炎、牙齦紅腫等疾病[3,4]。我國是全世界最大的楊梅產(chǎn)區(qū)，浙江省仙居市的楊梅品質(zhì)最佳[5]。楊梅除了作為水果以外，還在飲料、罐頭等食品加工行業(yè)占有一席之地，楊梅種仁富含植物油脂、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分[6,7]。目前國內(nèi)外對楊梅種仁油的研究尚處起步階段，尤其是對東魁楊梅種仁的相關研究尚且較少。油脂是人類日常攝入的物質(zhì)之一，具有抗氧化功能。相比于過多攝入會引發(fā)膽固醇與血糖迅速上升的飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸的適量攝入更具優(yōu)勢，如阻礙脂肪團、改善血脂以及血糖的整體水平、防控突然發(fā)生心血管病的隱患，還有助于促進糖尿病的迅速康復[8,9]。

中藥提取是影響因素復雜的非線性過程。響應面法(RSM)是提取工藝優(yōu)化的傳統(tǒng)方法，但存在無法反映多因素多水平的非線性復雜關系的局限性，且依賴于大量的驗證實驗[10]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(ANN)基于其輸入層、隱藏層、輸出層的3層神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，可通過相應函數(shù)完成輸入層與輸出層的高度非線性擬合，從而實現(xiàn)對多因素多指標的實驗優(yōu)化，因此在提取工藝的優(yōu)化中具有更大的優(yōu)勢[11]。目前ANN已經(jīng)在提取工藝優(yōu)化中得到了一定的應用，如生物堿、皂苷、黃酮等活性成分的提取工藝優(yōu)化[12]。ANN在油脂的高效提取中應用效果較好，如應用超臨界CO2流體提取枸杞籽中棕櫚酸、亞油酸等物質(zhì)，經(jīng)過ANN的工藝優(yōu)化，提取率14.28%，可達原料含脂量的91%[13]。本實驗研究了東魁楊梅的種仁油的提取工藝及抗氧化活性，以期提高楊梅資源利用率，尋找并開發(fā)油料植物的替代資源，為油脂資源開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

東魁楊梅(Myricarubracv.Dongkui, MRDK)于2021-06采自浙江省臺州市橫溪鎮(zhèn)(120.470 6 °E, 28.735 2 °N)，并由浙江中醫(yī)藥大學張春椿副教授鑒定。提取所用試劑為分析純，檢測所用試劑為色譜純。

1.2 提取及工藝優(yōu)化

1.2.1 索氏提取

稱量5.0 g粉碎后的東魁楊梅種仁，放入索氏提取器中，并加入100 mL石油醚(60～90 ℃)，在80 ℃下水浴中提取6 h。經(jīng)毛細管法檢測無油脂后，完成提取，并經(jīng)減壓濃縮后得到東魁楊梅種仁油(MRDK kernel oil, MRDKKO)，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 超聲有機溶劑提取

準確稱量5.0 g粉碎后的東魁楊梅種仁，置于錐形瓶中，并加入石油醚(60～90 ℃)，在超聲輔助提取儀中進行提取，在提取過程中分別對液固比、提取時間、提取溫度、超聲功率進行單因素考察，再利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡對提取工藝進行進一步優(yōu)化。提取結(jié)束后，進行抽濾，并經(jīng)減壓濃縮后得到東魁楊梅種仁油，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3 脂肪酸成分分析

1.3.1 脂肪酸轉(zhuǎn)酯化

準確稱量5.0 g的MRDKKO于圓底燒瓶中，依次加入45 mL甲醇和5 mL的H2SO4甲醇溶液(0.1 mol/L)，放入轉(zhuǎn)子后連接好反應裝置，于300 r/min轉(zhuǎn)速下，在80 ℃水浴中，進行脂肪酸轉(zhuǎn)酯化，反應時間為2 h。反應結(jié)束后將冷卻至室溫的燒瓶中溶液全部轉(zhuǎn)移至分液漏斗中后，加入適量去離子水，靜置4 h。上層即為脂肪酸甲酯，加入適量無水Na2SO4后，按1∶1 000加入色譜正己烷，以14 000 r/min離心后置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 GC/Q-TOF MS檢測

安捷倫7890B-7250四級桿飛行時間質(zhì)譜儀(GC/Q-TOF MS)。色譜條件：色譜柱：HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；升溫程序為：初始溫度50 ℃，以60 ℃/min升溫至170 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升溫至180 ℃，保持5 min，最后以20 ℃/min升溫至220 ℃，保持5 min；載氣為高純氦氣(99.999 9%)，流速1.2 mL/min；進樣量1 μL；不分流。質(zhì)譜條件：電子轟擊電離(EI)模式，電離能源70 eV，離子源溫度200 ℃，傳輸線溫度290 ℃，數(shù)據(jù)采集方式為TOF-Scan全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z50～500；采集速率5 spectra/s；溶劑延遲5 min。通過NIST14標準譜數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻資料完成結(jié)構(gòu)鑒定。

1.4 理化性質(zhì)測定

相對密度：GB/T 5518—2008，折射系數(shù)：GB/T 5527—2010，酸值：GB/T 5530—2005，碘值：GB/T 5532—2008，過氧化值：GB/T 5538—2005。

1.5 SEM分析

將提取前后的東魁楊梅種仁置于真空干燥箱中烘干至恒重，制樣后，經(jīng)噴金處理，于SU8010場發(fā)射掃描電子顯微鏡下進行觀察分析。

1.6 DPPH自由基清除活性

分別將0.1 mL一系列濃度的東魁楊梅種仁油與1.4 mL 95%乙醇及1 mL 40 μg/mL的DPPH乙醇溶液進行混合，避光放置70 min后于517 nm波長下測定其吸光度，空白樣品以95%乙醇替代樣品溶液，實驗重復3次，且VC為對照。

1.7 統(tǒng)計分析

所有實驗均重復3次，使用MS Excel完成統(tǒng)計分析，用Origin 8.0軟件作圖，使用MATLAB完成人工神經(jīng)網(wǎng)絡代碼編寫及相關優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 油脂成分

索氏提取法對MRDKKO的得率為62.00%。轉(zhuǎn)酯化后通過GC/Q-TOF MS結(jié)果可以看出(圖1)，共有5個主要的信號峰，其中含量最高的2個信號峰分別是亞油酸和油酸，總不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)高達82.20%，其種類及對應關系如表1所示。

注：圖中編號與表1對應一致。

與荸薺楊梅種仁油相比(表2)，MRDKKO酸值、過氧化值均較低，結(jié)合表1不難發(fā)現(xiàn)，這是由于MRDKKO中游離脂肪酸更少、不飽和脂肪酸含量更高造成的。與傳統(tǒng)食用油大豆油和橄欖油相比，MRDKKO酸值及過氧化值顯著低于大豆油和橄欖油[14,15]，碘值則介于大豆油與橄欖油之間，表明MRDKKO已達到食用油的標準，可作為天然食用油進行開發(fā)。

表1 東魁楊梅種仁油的脂肪酸成分

表2 東魁楊梅種仁油主要理化性質(zhì)

2.2 單因素及人工神經(jīng)網(wǎng)絡實驗

2.2.1 單因素實驗

在圖2中，MRDKKO的提取率隨液固比的增加而顯著增加，而當液固比達到14 mL/g時，MRDKKO的提取率基本不再增加，這是因為液固比為12 mL/g時提取率已基本達到最大值，使用過多的提取溶劑則會增加成本，同時有機溶劑也會在提取過程中揮發(fā)，因此，選擇液固比為12 mL/g進行MRDKKO的提取。

圖2 東魁楊梅種仁油單因素實驗提取結(jié)果

隨著提取時間的延長，MRDKKO的提取率得以增加，且在提取時間為40 min基本達到最大值，盡管持續(xù)增加提取時間MRDKKO的提取率有一定程度的增加，然而綜合考慮提取率與提取時間的效率問題，選取提取時間為40 min進行后續(xù)實驗。

提取溫度從20 ℃增加到40 ℃時MRDKKO提取率顯著提高，這是因為溫度的上升會加速對細胞的破壞和油脂的溶出，而過高的溫度則會導致有機溶劑的揮發(fā)，影響提取的傳質(zhì)效率，從而降低提取率，因此，40 ℃作為適宜的提取溫度進行實驗。

超聲功率從100 W增加至300 W，MRDKKO的提取率呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，當超聲功率超過300 W時，提取率則不再增加，這是因為超聲功率的提高會加速其對細胞的破壞，但當超聲功率持續(xù)增加會使溫度升高，一方面導致溶劑揮發(fā)，另一方面減少了溶劑與東魁楊梅種仁的接觸，最終導致提取率的下降，故300 W作為最佳的超聲功率。

2.2.2 人工神經(jīng)網(wǎng)絡實驗

從單因素實驗結(jié)果可以分析出，液固比、提取時間、提取溫度這3個因素對MRDKKO的提取效果影響顯著，故利用ANN對這3個因素進行優(yōu)化分析。在ANN優(yōu)化過程中，以3個因素為輸入層，MRDKKO提取率為輸出層，構(gòu)建了3-8-1的ANN模型，其中設置60%的數(shù)據(jù)為訓練集，20%的數(shù)據(jù)為驗證集，20%的數(shù)據(jù)為測試集，通過對MRDKKO提取率的ANN預測分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，訓練集、測試集、矯正集及整個模型的R值分別為0.999 21、0.999 8、0.999 93和0.994 67，非常接近1，且所有數(shù)據(jù)都分布在40o線左右，表明建立的ANN模型與實驗數(shù)據(jù)的完美擬合，也進一步證明了實驗值與ANN預測值間具有良好的相關性。結(jié)合ANN模型擬合并通過軟件分析得出最佳工藝參數(shù)：液固比13.91 mL/g，提取時間40.85 min，提取溫度42.66 ℃，MRDKKO提取率為67.94%，在實際實驗操作中，選取液固比14 mL/g，提取時間41 min，提取溫度42 ℃進行驗證實驗，重復3次后MRDKKO提取率為67.87%，可以發(fā)現(xiàn)，模擬擬合可靠合理，結(jié)果預測準確。

圖3 實驗數(shù)據(jù)與每一步計算的神經(jīng)網(wǎng)絡數(shù)據(jù)的散點比較圖

2.2.3 提取動力學

采用一級動力學模型對超聲有機溶劑提取MRDKKO隨提取時間變化進行研究，得到如圖4所示的動力學曲線，并經(jīng)軟件擬合得到動力學參數(shù)即提取達到平衡時的提取率C∞為68.93，提取反應速率常數(shù)k為0.12，R2=0.98，數(shù)據(jù)表明采用一級動力學方程對MRDKKO的提取是適合的，同時結(jié)合C∞與k結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用超聲有機溶劑提取東魁楊梅種仁在41 min左右基本達到提取平衡及最大提取率，表明超聲有機溶劑提取法提取效率較高。

圖4 超聲有機溶劑法提取東魁楊梅種仁油動力學曲線

2.3 SEM

掃描電鏡結(jié)果能夠衡量出提取方法對樣品表面的破壞程度，通常植物油脂存在于細胞內(nèi)或細胞間，對樣品表面破壞的越嚴重，說明更有利于油脂滲透到提取溶劑中。由圖5可以看出未提取的樣品表面光滑，組織沒有被破壞，且有較多的油脂存在；由于索氏提取時間長，組織有一定程度的破壞，且油脂有所減少；超聲有機溶劑提取由于超聲空化力與有機溶劑的共同作用，對組織破壞的最嚴重，可以發(fā)現(xiàn)基本無油脂的存在。

圖5 不同方法提取油脂后東魁楊梅種仁SEM圖

2.4 DPPH自由基清除能力

如圖6所示，隨著MRDKKO濃度的增加，其DPPH自由基清除能力增加，當MRDKKO質(zhì)量濃度增加至9.95 mg/mL時達到DPPH自由基的半數(shù)清除活性濃度即IC50值，與對照VC的IC50值0.067 mg/mL相比，雖然其DPPH自由基清除能力顯著低于VC，但MRDKKO為油脂類，無法直接比擬VC這種強還原劑，與其他種類的植物油脂相比，MRDKKO由于富含不飽和脂肪酸，故其作為植物天然油脂DPPH自由基清除活性較好。

圖6 東魁楊梅種仁油DPPH自由基清除能力

3 討論

本研究使用超聲有機溶劑法對東魁楊梅種仁油進行提取，分別對液固比、超聲時間、提取溫度、超聲功率4個因素進行單因素進行優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)液固比、提取時間、提取溫度是對東魁楊梅種仁油提取率影響較大的3個因素。超聲功率影響較小的原因是由于楊梅種仁本身質(zhì)地較軟，粉碎后能夠充分與溶劑接觸，較低的超聲功率即可達到較好的提取效果，所以低功率和高功率超聲對油脂的提取率影響較小。通常在工業(yè)化生產(chǎn)中，不會使用超聲有機溶劑提取法進行大規(guī)模提取，這也為工業(yè)化使用其他方法對東魁楊梅種仁油的高效提取提供支持[16]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡法近年來在提取工藝優(yōu)化等領域有廣泛應用，因其算法簡單，預測結(jié)果準確，對訓練集數(shù)據(jù)要求低等優(yōu)勢明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的RSM法正得到越來越多的關注[17]。工藝優(yōu)化是綠色化學的核心思想之一，盡量使用最少的提取溶劑、相對最短的提取時間、更低的溫度獲取到更高的得率，是工業(yè)生產(chǎn)中尤為重要的一環(huán)[18]。尤其是目前楊梅油產(chǎn)品還處于發(fā)展的萌芽階段，市面上相關產(chǎn)品甚少，現(xiàn)如今正是搶占市場的良好時間。結(jié)合前期實驗發(fā)現(xiàn)這可能與楊梅種子壁厚，難剝離造成的，種子難處理極大地限制了楊梅油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[19]。楊梅在我國南部各省山區(qū)分布廣泛，是一種重要的經(jīng)濟作物，資源儲量充足。只有建立在綠色化學的基礎上，解決楊梅種子難剝離的問題，才能夠?qū)崿F(xiàn)將楊梅種仁油開發(fā)為高品質(zhì)食用油。

4 結(jié)論

本研究使用GC/Q-TOF MS氣質(zhì)聯(lián)用儀建立一套快速、準確的針對東魁楊梅種仁油進行成分分析及結(jié)構(gòu)鑒定的檢測方法。結(jié)果表明東魁楊梅種仁油中亞油酸質(zhì)量分數(shù)可達38.72%，總不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)高達82.20%。DPPH自由基清除活性實驗表明東魁楊梅種仁油具有較好的抗氧化活性。高不飽和脂肪酸含量、高碘值、低酸值說明東魁楊梅種仁油是一種極具潛力的天然油脂來源。

致謝：本文得到了浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院醫(yī)學科研中心公共平臺盛正華老師、王林燕老師、關旸老師、王博老師的幫助與支持，以及浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院醫(yī)學科研中心公共平臺提供的技術(shù)協(xié)助，特此感謝！