呂曉蘭，余寧翔，葉 沁，吳澤儀，孟祥河

(浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，德清 313200)(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所2，杭州 310014)

含油脂食品在生產(chǎn)、儲(chǔ)藏過程中極易發(fā)生氧化反應(yīng)從而影響食品品質(zhì)，添加抗氧化劑是防止食品氧化的有效手段。特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)是含油脂食品中應(yīng)用最廣泛的抗氧化劑之一，其抗氧化效果在同等條件下優(yōu)于其他抗氧化劑[1]。然而，TBHQ在食品生產(chǎn)和儲(chǔ)藏過程中極易因氧化和揮發(fā)而損耗。Anwar等[2]在185 ℃加熱、充氮條件下測(cè)定TBHQ降解產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TBHQ生成了30多種產(chǎn)物，而且加熱時(shí)間越久，生成的產(chǎn)物越多。其中，特丁基對(duì)苯醌(TBBQ)是TBHQ最主要的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[3]。相關(guān)毒理學(xué)研究表明，TBBQ的毒性遠(yuǎn)大于TBHQ。Braeuning等[4]分別用TBHQ和TBBQ處理老鼠中的3T3細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TBBQ用量只需TBHQ用量的1%，就能使相鄰未經(jīng)處理過的細(xì)胞死亡。RAW264.7細(xì)胞暴露于TBBQ后，通過劑量和時(shí)間依賴性方式調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期S/G2的轉(zhuǎn)換，可抑制DNA的合成，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。Matsunaga等[6]也研究證實(shí)TBHQ對(duì)人體內(nèi)皮細(xì)胞的毒性要小于TBBQ。雖然TBBQ的生物毒性機(jī)制尚未完全闡明，但這些研究成果證明TBBQ具有潛在的生物細(xì)胞毒性危害。

TBHQ是生成TBBQ的前體物質(zhì)，所以食品中TBBQ的含量和食品中本身添加的TBHQ含量有關(guān)，而TBHQ轉(zhuǎn)化生成TBBQ則和食品的加工工藝和儲(chǔ)藏條件有關(guān)。之前的各項(xiàng)研究是在實(shí)驗(yàn)室條件下簡(jiǎn)單模擬食品的加工過程并測(cè)定食品中的TBBQ含量。但是在實(shí)際生產(chǎn)生活中，食品的加工程序復(fù)雜，不同食品的加工工藝不同，且食品的儲(chǔ)藏運(yùn)輸條件不同，所以不同食品中TBBQ含量會(huì)因多種因素的影響而不同。目前關(guān)于含油脂食品中TBBQ含量分布的研究鮮有報(bào)道。同時(shí)，雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)TBHQ檢測(cè)的研究已相當(dāng)成熟，但對(duì)其代謝產(chǎn)物TBBQ的檢測(cè)研究尚處于起步階段，也沒有專門的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)用來(lái)測(cè)定TBBQ。為了更好了解TBBQ在商業(yè)食品中的分布情況，以更準(zhǔn)確的評(píng)估市售典型含油脂食品的健康風(fēng)險(xiǎn)，本實(shí)驗(yàn)在前人的研究基礎(chǔ)上優(yōu)化TBBQ檢測(cè)的前處理方法，同時(shí)，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定可添加TBHQ的食品分類，選取了118個(gè)樣品，用優(yōu)化后的前處理方法測(cè)定樣品中TBBQ的含量，并討論食品成分、加工工藝等對(duì)含油脂食品質(zhì)量安全的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

叔丁基對(duì)苯醌(TBBQ)(≥98%)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、石油醚(分析純)、精煉菜籽油。

BS124S型電子分析天平，Agilent1260液相色譜儀(紫外光度檢測(cè)器)，TGL-10C型高速臺(tái)式離心機(jī)，DE-400 g萬(wàn)能高速粉碎機(jī)，XH-B型漩渦振蕩器，RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，DKS-24型電熱恒溫水浴鍋。

1.2 樣品選擇

按照GB 2760—2014中可添加TBHQ的食品分類，一共采集了六大類，118個(gè)樣品：普通食用油、油炸面制品、腌制肉類、熟制堅(jiān)果、烘焙食品、膨化食品均為市售，采購(gòu)時(shí)間在2020年5月—2021年10月，所有樣品均在保質(zhì)期內(nèi)，除部分腌制肉類中無(wú)法確定是否含TBHQ外，其他產(chǎn)品均確認(rèn)添加了TBHQ。

1.3 食品中油樣的提取

固體樣品在高速粉碎機(jī)中粉碎，稱取60 g于150 mL錐形瓶中。再加入50 mL的石油醚，振蕩1 min，靜置12 h后8 000 r/min下離心10 min。收集澄清液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮得到純油。

1.4 油樣中TBBQ的提取條件優(yōu)化

稱取1.00 g油樣于5 mL離心管中，加入2 mL試劑(甲醇、乙腈、1∶1甲醇乙腈混合液)，劇烈振蕩2 min，7 000～9 000 r/min離心1～5 min后，將上清液轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中。重復(fù)操作2次，每次加入1.5 mL試劑，合并上清液并定容。過0.45 μm的有機(jī)濾膜，進(jìn)HPLC分析。

1.5 TBBQ檢測(cè)

1.5.1 檢測(cè)方法的建立

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定樣品中TBBQ的含量，檢測(cè)方法在前人的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些修改[7]。HPLC分析條件：色譜柱為Agilent XDB-C18(4.6×250 nm，2.5 μm)；在柱溫為30 ℃的條件下用65%的甲醇和35%的純水等度洗脫20 min，流速為0.80 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；進(jìn)樣量為10 μL。通過比較樣品的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，鑒定樣品中的TBBQ。

1.5.2 方法的驗(yàn)證

定量樣品中的TBBQ是通過比較待測(cè)樣峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得。該標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過測(cè)定乙腈中TBBQ的連續(xù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL)，分析TBBQ峰面積和濃度的相關(guān)性而建立的。線性回歸方程為：Y=32.31X+7.643，其中R2=0.998。最低檢出限為0.12 μg/mL，最低定量限為0.37 μg/mL。

1.5.3 回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)選取最優(yōu)的TBBQ檢測(cè)前處理方法?；厥諏?shí)驗(yàn)以3種濃度的精煉菜籽油為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。稱取0.10 g TBBQ，溶于49.90 g精煉菜籽油中，配制成TBBQ含量為2 000.00 mg/kg的母液。分別稱取5.00、1.00、0.05 g的母液，用油樣稀釋至40.00 g，制得TBBQ含量為250.00、50.00、2.50 mg/kg的儲(chǔ)備用油。儲(chǔ)備用油按1.4測(cè)定，精煉菜籽油的加標(biāo)回收率為(90.15±0.45)%～(95.04±0.51)%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%～0.76%。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2次及以上，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性差異分析，P<0.05。用Origin8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)表明，最佳的提取溶劑是乙腈(圖1a)，且TBBQ含量越高，提取效果越好，TBBQ的回收率在(89.87±0.68)%～(95.43±0.41)%。離心轉(zhuǎn)速在7 000-9 000 r/min內(nèi)時(shí)(圖1b)，精煉菜籽油中TBBQ的回收率在(94.95±0.54)%～(95.43±0.41)%范圍內(nèi)波動(dòng)，區(qū)別不大。離心時(shí)間在1～5 min內(nèi)時(shí)(圖1b)，精煉菜籽油中TBBQ的回收率在(94.11±1.02)%～(95.43±0.41)%范圍內(nèi)波動(dòng)。

圖1 精煉菜籽油中不同溶劑、提取溶劑用量(一次提取)、離心轉(zhuǎn)速、離心時(shí)間對(duì)TBBQ回收率的影響

對(duì)于1.00 g的油脂而言，一次提取溶劑量為5 mL時(shí)(圖1b)，提取效果最好，TBBQ的回收率為(95.95±0.87)%。最后確定TBBQ最優(yōu)的前處理方法為：稱取1.00 g油樣于長(zhǎng)試管中，用移液管移取加入2 mL乙腈(色譜級(jí))。劇烈振蕩2 min，8 000 r/min下離心3 min后，將上清液轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中。重復(fù)以上操作兩次，每次加入1.5 mL的乙腈(色譜純)，合并兩次的上清液，定容至5 mL。

2.2 樣品中TBBQ的測(cè)定結(jié)果

由表1可知，TBBQ的平均水平分布在(1.12±0.49)mg/kg至(4.16±4.99)mg/kg之間(表1)。在不同食品類別中，TBBQ的水平相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均較高，TBBQ的SD在0.49～6.45 mg/kg之間。TBBQ含量最高的是瓜子，含量為(23.59±0.73)mg/kg。TBBQ平均含量最高的是膨化食品，平均值為(4.16±4.99)mg/kg。所有樣本中，含量超過1.0、5.0、15.0 mg/kg的樣品數(shù)分別占總樣品數(shù)的53.39%、15.25%、3.39%。油炸面制品中TBBQ的檢出率最高，為95.00%，腌制肉類中TBBQ的檢出率最低，為37.50%。

表1 不同樣品中TBBQ的含量分布

抽取的19個(gè)烘焙食品中(圖2a)，TBBQ含量為0～(1.85±0.14)mg/kg。其中測(cè)得TBBQ含量最高的是一款沙琪瑪，含量為(1.85±0.14)mg/kg。TBBQ的平均水平分布為(1.12±0.49)mg/kg。抽取的24個(gè)膨化食品中(圖2b)，TBBQ含量分布區(qū)間為0～(17.29±0.53)mg/kg。其中測(cè)得TBBQ含量最高的產(chǎn)品是一款山藥片，含量為(17.29±0.53)mg/kg。TBBQ的平均水平分布為(4.16±4.99)mg/kg。抽取的22個(gè)普通食用油中(圖2c)，TBBQ含量分布區(qū)間為0～(2.76±0.13)mg/kg，TBBQ含量最高的是一款調(diào)和油，為(2.76±0.13)mg/kg。TBBQ的平均水平分布為(1.26±0.91)mg/kg。在抽取的樣品中，大豆油和調(diào)和油中TBBQ含量普遍高于菜籽油，分析原因可能是不同油種類中本身添加的TBHQ量就不同。抽取的25個(gè)熟制堅(jiān)果中(圖2d)，TBBQ含量分布區(qū)間為0～(23.59±0.73)mg/kg。其中測(cè)得TBBQ含量最高的是瓜子，為(23.59±0.73)mg/kg。TBBQ的平均水平分布為(3.91±6.45)mg/kg。結(jié)果顯示，水煮瓜子中TBBQ的含量是堅(jiān)果中最高的，明顯高于油炸堅(jiān)果(如花生、荷蘭豆)中TBBQ的含量，考慮是食品加工工藝的不同導(dǎo)致的區(qū)別。抽取的20個(gè)油炸面制品中(圖2e)，TBBQ含量分布區(qū)間為0～(8.83±0.20)mg/kg。TBBQ的平均水平分布為(3.94±2.42)mg/kg。其中，一款辣條的TBBQ含量最高，為(8.83±0.20)mg/kg，普遍高于麻花中TBBQ的含量。抽取的8個(gè)腌制肉類中，TBBQ含量分布區(qū)間為(0.85±0.08)～(6.52±0.26)mg/kg，平均水平分布為(3.47±2.33)mg/kg。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腌制肉類的TBBQ檢出率只有37.5%，雖然按照GB 2760—2014中可添加TBHQ的食品分類，TBHQ也能加入腌肉制品，但是在實(shí)際采購(gòu)中發(fā)現(xiàn)，明確標(biāo)明含有TBHQ的產(chǎn)品很少，究其原因，一是采用了其他抗氧化劑，如異抗壞血酸鈉，二是因?yàn)殡缛庵破分械乃趾亢陀秃烤^低，從而降低了油氧化的風(fēng)險(xiǎn)，而且脂肪和油的部分氧化恰恰能形成腌肉制品獨(dú)特的風(fēng)味，這也限制了TBHQ的添加。

圖2 烘焙食品、膨化食品、食用油、熟制堅(jiān)果、油炸面制品TBBQ分布情況的箱型圖

另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)118個(gè)樣品中有53.39%樣品中TBBQ含量大于1.0 mg/kg，有15.25%的樣品TBBQ含量大于5.0 mg/kg，有3.39%的樣品TBBQ 含量大于15.0 mg/kg。TBBQ有潛在細(xì)胞毒性，TBBQ濃度為1 μg/mL時(shí)會(huì)使老鼠前胃黏膜DNA斷裂，5 μg/mL時(shí)，損傷肝細(xì)胞質(zhì)膜[8，9]。Morimoto等[8]報(bào)道1% 3-BHA和0.001%TBHQ不會(huì)引起DNA的損傷，而0.0001%TBBQ就可引起DNA損傷，在相同濃度條件下，TBBQ對(duì)DNA的損傷高于TBHQ對(duì)DNA損傷的100倍以上。因此，將TBBQ列入風(fēng)險(xiǎn)因子來(lái)評(píng)估油脂食品的安全性是非常有必要的。

2.3 TBBQ含量分布與食品加工工藝的關(guān)系

大量研究表明，TBBQ在油脂儲(chǔ)存過程中會(huì)伴隨著TBHQ的損耗不斷產(chǎn)生，是目前已知的TBHQ在加熱條件下的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[3]。所以TBBQ在食品中的含量分布與TBHQ的添加量緊密相連。TBHQ是合法的食品添加劑，國(guó)家規(guī)定允許最大的添加量是200 mg/kg。但在實(shí)際采樣過程中發(fā)現(xiàn)，很多食用油及含油脂食品中其實(shí)并未添加TBHQ，而是采用添加其他抗氧化劑或使用其他抗氧化手段來(lái)達(dá)到抗氧化目的。而在添加TBHQ的食品中，TBBQ的含量又與TBHQ的添加方式、食品加工工藝有關(guān)。加熱溫度和時(shí)間會(huì)影響TBBQ的生成，而且，TBBQ會(huì)因揮發(fā)而損耗[10]。由此，本研究主要從TBHQ的添加方式和食品的加工方式(冷、熱加工)來(lái)具體分析不同食品TBBQ含量分布與食品加工工藝的關(guān)系。

冷加工食品是指常溫環(huán)境下，在食品加工過程中加入TBHQ，比如表面噴涂 TBHQ，以達(dá)到抗氧化的目的。在本課題采集到的樣品中，辣條和腌肉制品屬于冷加工食品。辣條的制作工藝是面筋做好后再添加TBHQ。腌制肉類的生產(chǎn)工藝是先腌制后風(fēng)干，最后在表面噴涂TBHQ。散裝臘肉中TBBQ含量較高(6.52±0.26)mg/kg。這個(gè)含量相較于其他類食品，TBBQ含量相對(duì)較高，分析原因可能是：一方面，油脂暴露于空氣中容易氧化。Li等[11]通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，油脂在室溫下儲(chǔ)藏8周后TBBQ測(cè)定值比120 ℃下連續(xù)加熱2～24 h后的TBBQ測(cè)定值都要高；另一方面，因?yàn)殡缛猱a(chǎn)品通常是用鹽腌制，鹽中含有的金屬離子(如Cu2+、Fe3+等)會(huì)催化TBHQ轉(zhuǎn)化生成TBBQ。

熱加工可分為短時(shí)熱加工和長(zhǎng)時(shí)熱加工。短時(shí)熱加工主要是指短時(shí)的高溫加工手段，常見的短時(shí)熱加工產(chǎn)品有油炸類堅(jiān)果、油炸型膨化食品等。長(zhǎng)時(shí)熱加工是指在長(zhǎng)時(shí)高溫下進(jìn)行水煮或烘烤，常見的食品有餅干、蛋糕、瓜子花生和一些烘烤堅(jiān)果等。

目前，食品工廠采用的短時(shí)煎炸條件大多數(shù)為：煎炸溫度為120～200 ℃，每批次煎炸時(shí)長(zhǎng)為30 s～3 min，與本課題組研究的煎炸模型接近[12]。在該模型中，TBHQ含量在第一次油炸后損失了30%～45%，隨之而來(lái)的是 TBBQ含量的大幅提升。5～30 min內(nèi)，樣品分別在140、170、190 ℃條件下煎炸，140 ℃組測(cè)得的TBBQ最大含量比后2組測(cè)得的TBBQ最大含量高。2 h后，幾乎檢測(cè)不到TBBQ[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，荷蘭豆和花生的加工工藝就是短時(shí)油炸，這兩者的TBBQ含量明顯低于水煮瓜子。其中一種煎炸的荷蘭豆沒有檢出TBBQ，與模型相符，推測(cè)該產(chǎn)品的加工工藝就是短時(shí)連續(xù)油炸。GB 17401—2003《膨化食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》將膨化食品分為兩大類：油炸型膨化食品和非油炸型膨化食品。本實(shí)驗(yàn)中山藥片、玉米角、鍋巴是油炸型膨化食品，米餅是非油炸型膨化食品。檢測(cè)結(jié)果顯示，山藥片、玉米角和鍋巴所含TBBQ的含量明顯高于米餅。Buck[13]發(fā)現(xiàn)薯片在煎炸后，薯片的抗氧化能力提高同時(shí)油中的TBHQ含量下降，他由此推測(cè) TBHQ 會(huì)在煎炸時(shí)被吸附到薯片中，從而提高薯片的抗氧化能力。膨化食品中TBBQ的平均水平分布為(4.16±4.99)mg/kg，高于其他類食品，分析原因可能一是由于膨化食品的加工模式是短時(shí)油炸，且煎炸油反復(fù)使用，符合之前團(tuán)隊(duì)研究的連續(xù)煎炸模型；二是因?yàn)榕蚧称分械呐蚧瘎?huì)增大食品表面積和孔隙，使食品更容易接觸水分和氧氣，加速TBHQ向TBBQ轉(zhuǎn)化。

烘烤堅(jiān)果和水煮堅(jiān)果的加工屬于長(zhǎng)時(shí)熱加工。抽取的25個(gè)熟制堅(jiān)果中，水煮瓜子中TBBQ的含量是幾類堅(jiān)果食品中最高的，最高為(23.59±0.73)mg/kg。水煮瓜子的加工工藝一般是在水煮過程中加入TBHQ，煮入味后干燥而成。在水煮過程中，為使調(diào)味料和TBHQ能滲入瓜子中產(chǎn)生作用，會(huì)在調(diào)味液中加入過量的調(diào)味料和TBHQ。這就導(dǎo)致瓜子在水煮和干燥過程時(shí)，TBHQ轉(zhuǎn)化生成的TBBQ含量變多。另外，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，品牌1瓜子中TBBQ 含量在(0.41±0.05)～(1.24±0.11)mg/kg，品牌2瓜子中 TBBQ 含量在(1.22±0.12)～(23.59±0.73)mg/kg。對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，品牌1包裝內(nèi)添加了脫氧劑，且有獨(dú)立密封袋，而品牌2則無(wú)。所以良好的產(chǎn)品包裝能一定程度上防止TBHQ轉(zhuǎn)化生成TBBQ。其次，檢測(cè)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，不同口味的瓜子中所含TBBQ含量也不盡相同，總體來(lái)看，五香味瓜子中TBBQ含量小于其他口味的瓜子。分析原因可能是，瓜子在加工過程中，添加的某些物質(zhì)(如花椒、八角)中所含的某些成分能阻止TBHQ向TBBQ轉(zhuǎn)化[14]。而其他烘烤堅(jiān)果，加工工藝一般是在高溫或低溫下烘烤，待食品冷卻后再進(jìn)行調(diào)味。油烘型堅(jiān)果中TBHQ一般存在于油中，但是畢竟允許添加的TBHQ的含量有限，且在高溫烘烤時(shí)也易揮發(fā)，限制了烘烤堅(jiān)果中的TBHQ轉(zhuǎn)化生成TBBQ。

烘焙食品也屬于長(zhǎng)時(shí)熱加工產(chǎn)品。本次抽取的19個(gè)烘焙食品中TBBQ含量均低于(1.85±0.14)mg/kg，平均值為(1.12±0.49)mg/kg，低于其他五大類食品。從加工工藝分析，烘焙食品是將含有TBHQ的食用油與食品配料混合處理后進(jìn)行烘烤。這種工藝的加熱方式是在封閉環(huán)境下進(jìn)行熱風(fēng)循環(huán)加熱，這會(huì)加劇TBHQ氧化生成TBBQ。但是，TBBQ含量也只會(huì)在初始階段快速增加，之后會(huì)因?yàn)槿狈η绑w物質(zhì)以及自身的揮發(fā)而降低[5]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)得到TBBQ檢測(cè)的最優(yōu)前處理?xiàng)l件為：萃取試劑為乙腈、8 000 r/min離心3 min、一次提取溶劑量為5 mL。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)分析了118個(gè)市售典型含油脂食品中TBBQ的含量分布情況。測(cè)定結(jié)果顯示，所有樣品TBBQ的平均水平分布在(1.12±0.49)～(4.16±4.99)mg/kg之間，整體趨勢(shì)如下：膨化食品>油炸面制品>熟制堅(jiān)果>腌制肉類>食用油>烘焙食品。不同食品中TBBQ的含量和初始TBHQ的添加量及食品加工工藝有關(guān)。腌制肉類中TBBQ的檢出率最低，只有37.5%，油炸面制品的檢出率最高，為95%。所有食品中，水煮瓜子的TBBQ含量明顯高于其他類食品，其中五香味瓜子的TBBQ含量低于其他口味瓜子。